猿圆圆 摇摇恶性肿瘤的发病率和病死率呈逐年上升趋势, 严重威胁着全人类的健康及生命 [ 员 ] 转移是导致肿瘤患者病死率高的重要原因, 阻断恶性肿瘤的转移将能显著提高患者生存率 近年来对某一类型肿瘤器官特异性转移 ( 如食管癌转移到肺和肝 ; 乳腺癌转移到肺 肝 骨等 ) 分子机制的研究受到极大关注

Transcription

1 中国肿瘤生物治疗杂志摇澡贼贼责 : 辕辕憎憎憎援遭蚤燥贼澡藻则援燥则早悦澡蚤灶允悦葬灶糟藻则月蚤燥贼澡藻则, 粤怎早援圆园园愿, 灾燥造援员缘, 晕燥援源 猿圆员 阅韵陨 : 员园援猿愿苑圆辕躁援蚤泽泽灶援员园园苑鄄猿愿缘载 圆园园愿 园源 园园缘 论著 抑制结肠癌细胞与肝窦内皮细胞黏附的功能性抗体的初步研究 孙力超, 冉宇靓, 遇摇珑, 胡摇海, 钟摇星, 孙立新, 杨治华 ( 中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所细胞及分子生物学研究室, 北京摇员园园园圆员 ) [ 摘摇要 ] 摇目的 : 研制抑制结肠癌细胞与肝窦血管内皮细胞黏附的功能性单抗, 鉴定该单抗识别的抗原分子 方法 : 以人肝窦内皮细胞 ( 澡怎皂葬灶造蚤增藻则泽蚤灶怎泽燥蚤凿葬造藻灶凿燥贼澡藻造蚤葬造糟藻造造, 匀蕴杂耘悦 ) 免疫月粤蕴月辕糟小鼠, 将小鼠脾细胞与杂孕圆辕园细胞融合, 采用甲基纤维素选择培养液培养, 制备抗匀蕴杂耘悦的单克隆抗体库 采用免疫荧光染色 黏附实验等方法筛选 鉴定能抑制结肠癌蕴泽员苑源栽细胞与肝窦内皮细胞黏附的功能性单克隆抗体 提取肝窦内皮细胞膜蛋白, 采用宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早方法鉴定单抗识别的功能性抗原蛋白 结果 : 匀蕴杂耘悦免疫小鼠的脾细胞与杂孕圆辕园细胞融合后产生员源源园个杂交瘤株, 获得员员怨株产生抗匀蕴杂耘悦抗体的阳性克隆, 其中圆园株能显著抑制具有肝转移能力的结肠癌蕴泽员苑源栽细胞与匀蕴杂耘悦的黏附 ; 其中员缘株为陨早酝型, 猿株为陨早郧型, 圆株测不到重链 ; 其中员株抗黏附能力最强的单抗 ( 黏附抑制率为缘员豫 ) 命名为员圆月远, 该单抗在缘耀耀耀耀耀耀圆园园 μ 早辕皂造范围内显著阻断匀蕴杂耘悦与蕴泽员苑源栽的黏附, 且呈剂量依赖性 ; 单抗员圆月远所识别的匀蕴杂耘悦抗原蛋白的相对分子质量为源远园园园 结论 : 建立了抗匀蕴杂耘悦单克隆抗体库, 获得了圆园株具有抑制结肠癌细胞与肝窦血管内皮细胞黏附的功能性抗体, 初步鉴定了一种可能参与结肠癌肝转移的黏附分子, 为结肠癌的组织器官特异转移机制及靶向治疗的研究奠定了一定的基础 [ 关键词 ] 摇结肠癌 ; 肝窦内皮细胞 ; 黏附 ; 功能性单克隆抗体 ; 抗原 [ 中图分类号 ] 摇砸苑猿缘援猿 ; 砸苑猿园援缘源摇摇摇摇 [ 文献标志码 ] 摇粤摇摇摇摇 [ 文章编号 ] 摇员园园苑鄄猿愿缘载 ( 圆园园愿 ) 园源鄄园猿圆员鄄园缘 耘泽贼葬遭造蚤泽澡皂藻灶贼燥枣枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽枣燥则蚤灶澡蚤遭蚤贼蚤燥灶燥灶葬凿澡藻泽蚤燥灶遭藻贼憎藻藻灶糟燥造燥灶糟葬灶糟藻则葬灶凿澡怎皂葬灶造蚤增藻则泽蚤灶怎泽燥蚤凿葬造藻灶凿燥贼澡藻造蚤葬造糟藻造造泽 杂哉晕蕴蚤鄄糟澡葬燥, 砸粤晕再怎鄄造蚤葬灶早, 再哉蕴燥灶早, 匀哉匀葬蚤, 在匀韵晕郧载蚤灶早, 杂哉晕蕴蚤鄄曾蚤灶, 再粤晕郧在澡蚤鄄匀怎葬 ( 阅藻责葬则贼皂藻灶贼燥枣悦藻造造葬灶凿酝燥造藻糟怎造葬则月蚤燥造燥早赠, 悦葬灶糟藻则陨灶泽贼蚤贼怎贼藻, 孕藻噪蚤灶早哉灶蚤燥灶酝藻凿蚤糟葬造悦燥造造藻早藻, 悦澡蚤灶藻泽藻粤糟葬凿藻皂赠燥枣酝藻凿蚤糟葬造杂糟蚤藻灶糟藻, 月藻蚤躁蚤灶早员园园园圆员, 悦澡蚤灶葬 ) [ 粤遭泽贼则葬糟贼 ] 摇韵遭躁藻糟贼蚤增藻 : 栽燥泽糟则藻藻灶枣燥则枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿赠憎澡蚤糟澡糟葬灶蚤灶澡蚤遭蚤贼贼澡藻葬凿澡藻泽蚤燥灶遭藻贼憎藻藻灶糟燥造燥灶糟葬灶糟藻则糟藻造造泽葬灶凿澡怎皂葬灶造蚤增藻则泽蚤灶怎泽燥蚤凿葬造藻灶凿燥贼澡藻造蚤葬造糟藻造造泽 ( 蕴杂耘悦泽 ), 葬灶凿贼燥蚤凿藻灶贼蚤枣赠贼澡藻泽责藻糟蚤枣蚤糟葬灶贼蚤早藻灶燥枣贼澡藻泽糟则藻藻灶藻凿葬灶鄄贼蚤遭燥凿赠援酝藻贼澡燥凿泽 : 月粤蕴月辕糟皂蚤糟藻憎藻则藻蚤皂皂怎灶蚤扎藻凿憎蚤贼澡蕴杂耘悦泽, 贼澡藻泽责造藻藻灶糟藻造造泽燥枣贼澡藻蚤皂皂怎灶蚤扎藻凿皂蚤糟藻憎藻则藻枣怎泽藻凿憎蚤贼澡杂孕圆辕园糟藻造造泽葬灶凿糟怎造贼怎则藻凿燥灶皂藻贼澡赠造糟藻造造怎造燥泽藻贼燥藻泽贼葬遭造蚤泽澡葬灶贼蚤鄄蕴杂耘悦泽皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿赠造蚤遭则葬则赠援云怎灶糟贼蚤燥灶葬造皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽憎澡蚤糟澡蚤灶澡蚤遭蚤贼藻凿贼澡藻葬凿澡藻则藻灶糟藻遭藻贼憎藻藻灶糟燥造燥灶糟葬灶糟藻则糟藻造造泽 ( 蕴泽员苑源栽糟藻造造泽 ) 葬灶凿蕴杂耘悦泽憎藻则藻泽糟则藻藻灶藻凿葬灶凿蚤凿藻灶贼蚤鄄枣蚤藻凿遭赠蚤皂皂怎灶燥枣造怎燥则藻泽糟藻灶糟藻, 耘蕴陨杂粤葬灶凿葬凿澡藻泽蚤增藻葬泽泽葬赠援栽澡藻皂藻皂遭则葬灶藻责则燥贼藻蚤灶泽憎藻则藻藻曾贼则葬糟贼藻凿枣则燥皂蕴杂耘悦泽葬灶凿贼澡藻泽责藻鄄糟蚤枣蚤糟葬灶贼蚤早藻灶则藻糟燥早灶蚤扎藻凿遭赠皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿赠憎葬泽凿藻贼藻糟贼藻凿遭赠宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早葬泽泽葬赠援砸藻泽怎造贼泽 : 栽燥贼葬造造赠员源源园皂燥灶燥鄄糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿赠糟造燥灶藻泽憎藻则藻燥遭贼葬蚤灶藻凿遭赠贼澡藻枣怎泽蚤灶早泽责造藻藻灶糟藻造造泽燥枣蚤皂皂怎灶蚤扎藻凿皂蚤糟藻憎蚤贼澡杂孕圆辕园糟藻造造泽, 员怨怨燥枣贼澡藻皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽则藻糟燥早灶蚤扎藻凿蕴杂耘悦泽 ; 葬灶凿圆园糟造燥灶藻泽, 蚤灶糟造怎凿蚤灶早员缘陨早酝贼赠责藻, 猿陨早郧贼赠责藻, 葬灶凿圆憎蚤贼澡贼澡藻澡藻葬增赠泽贼则葬灶凿怎灶凿藻贼藻糟贼鄄葬遭造藻, 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠泽怎责责则藻泽泽藻凿贼澡藻葬凿澡藻则藻灶糟藻遭藻贼憎藻藻灶糟燥造燥灶糟葬灶糟藻则糟藻造造泽葬灶凿蕴杂耘悦泽援韵灶藻燥枣贼澡藻泽藻糟造燥灶藻泽憎蚤贼澡贼澡藻泽贼则燥灶早藻泽贼葬灶贼蚤鄄葬凿澡藻泽蚤增藻葬遭蚤造蚤贼赠 ( 蚤灶澡蚤遭蚤贼燥则赠则葬贼藻缘员豫 ) 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠蚤灶澡蚤遭蚤贼藻凿贼澡藻葬凿澡藻泽蚤燥灶遭藻贼憎藻藻灶糟燥造燥灶糟葬灶糟藻则糟藻造造泽葬灶凿匀蕴杂耘悦泽葬贼员缘原圆园园 μ 早辕皂造蚤灶葬凿燥泽藻鄄凿藻责藻灶凿藻灶贼皂葬灶灶藻则葬灶凿则藻葬糟贼藻凿憎蚤贼澡葬灶贼蚤早藻灶泽燥枣源远噪阅援悦燥灶糟造怎泽蚤燥灶 : 宰藻澡葬增藻泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠藻泽鄄贼葬遭造蚤泽澡藻凿葬灶葬灶贼蚤鄄匀蕴杂耘悦皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿赠造蚤遭则葬则赠葬灶凿燥遭贼葬蚤灶藻凿圆园枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽憎澡蚤糟澡糟葬灶泽怎责责则藻泽泽贼澡藻葬凿澡藻则藻灶糟藻燥枣糟燥造燥灶糟葬灶糟藻则糟藻造造泽憎蚤贼澡蕴杂耘悦泽援韵灶藻葬凿澡藻泽蚤增藻皂燥造藻糟怎造藻憎澡蚤糟澡皂蚤早澡贼皂藻凿蚤葬贼藻糟燥造燥灶糟葬灶糟藻则造蚤增藻则皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽澡葬泽遭藻藻灶责则藻造蚤皂蚤灶葬则蚤造赠蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿援栽澡藻泽藻葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽皂葬赠澡藻造责贼燥怎灶凿藻则泽贼葬灶凿贼澡藻皂藻糟澡葬灶蚤泽皂燥枣燥则早葬灶鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽燥枣糟燥造燥灶糟葬灶糟藻则糟藻造造泽葬灶凿泽澡藻凿造蚤早澡贼燥灶葬灶贼蚤鄄皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽贼澡藻则葬责赠燥枣糟燥造燥灶糟葬灶糟藻则援 [ 运藻赠憎燥则凿泽 ] 摇糟燥造燥灶糟葬灶糟藻则 ; 造蚤增藻则泽蚤灶怎泽燥蚤凿葬造藻灶凿燥贼澡藻造蚤葬造糟藻造造 ; 葬凿澡藻泽蚤燥灶 ; 枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿赠 ; 葬灶贼蚤早藻灶 [ 悦澡蚤灶允悦葬灶糟藻则月蚤燥贼澡藻则, 圆园园愿, 员缘 ( 源 ): 猿圆员鄄猿圆缘 ] 摇摇 [ 基金项目 ] 摇国家自然科学基金项目 ( 晕燥援猿园缘苑园愿员愿 ); 国家重点基础研究发展规划 ( 怨苑猿 ) 资助项目 ( 晕燥援圆园园圆悦月缘员猿员园远 ) 援杂怎责责燥则贼藻凿遭赠贼澡藻晕葬鄄贼蚤燥灶葬造晕葬贼怎则葬造杂糟蚤藻灶糟藻云燥怎灶凿葬贼蚤燥灶燥枣悦澡蚤灶葬 ( 晕燥援猿园缘苑园愿员愿 ); 贼澡藻酝葬躁燥则杂贼葬贼藻月葬泽蚤糟砸藻泽藻葬则糟澡阅藻增藻造燥责皂藻灶贼孕则燥早则葬皂燥枣悦澡蚤灶葬 ( 晕燥援圆园园圆悦月缘员猿员园远 ) [ 作者简介 ] 摇孙力超 ( 员怨愿园鄄 ), 男, 山西省太原市人, 博士, 主要从事肿瘤抗体工程研究工作 悦燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早葬怎贼澡燥则援耘鄄皂葬蚤造 : 则葬灶赃赠怎造蚤葬灶早岳员圆远援糟燥皂

2 猿圆圆 摇摇恶性肿瘤的发病率和病死率呈逐年上升趋势, 严重威胁着全人类的健康及生命 [ 员 ] 转移是导致肿瘤患者病死率高的重要原因, 阻断恶性肿瘤的转移将能显著提高患者生存率 近年来对某一类型肿瘤器官特异性转移 ( 如食管癌转移到肺和肝 ; 乳腺癌转移到肺 肝 骨等 ) 分子机制的研究受到极大关注 在转移过程中, 肿瘤细胞与靶器官血管内皮细胞的黏附是肿瘤转移的重要步骤, 阻断这种黏附作用有可能抑制肿瘤转移 [ 圆鄄猿 ] 本课题组在对癌细胞与血管内皮细胞的相关性研究中发现, 不同组织类型肿瘤细胞与不同器官内皮细胞的黏附能力具有明显的组织特异性和选择性, 这种黏附特异性与临床上肿瘤的组织特异性转移密切相关 [ 源鄄苑 ] ; 并推测, 临床上半数以上的结肠癌发生肝转移可能与结肠癌细胞与人肝窦内皮细胞的嗜性黏附相关 因此, 本研究采用肝窦血管内皮细胞免疫动物, 获得大容量单抗库 [ 愿 ], 以肝窦内皮细胞和具有肝转移能力的人结肠癌细胞蕴泽员苑源栽为研究对象, 通过体外黏附实验, 筛选 鉴定出具有抑制结肠癌细胞与肝窦内皮细胞的黏附功能性单克隆抗体, 并对该单克隆抗体识别的抗原进行了初步鉴定, 为研究结肠癌肝转移的机制, 研制靶向结肠癌肝转移的治疗性抗体奠定实验基础 员摇 材料与方法 员援员摇主要材料人肝窦内皮细胞 ( 澡怎皂葬灶造蚤增藻则泽蚤灶怎泽燥蚤凿葬造藻灶凿燥鄄贼澡藻造蚤葬造糟藻造造, 匀蕴杂耘悦 ) 由中日友好医院临床医学研究所娄晋宁教授赠送 小鼠骨髓瘤细胞杂孕圆辕园鄄粤郧员源 ( 简称杂孕圆辕园 ) 结肠癌细胞系蕴泽员苑源栽 ( 具肝转移能力 ) 为本室保存培养 雌性远耀耀耀耀耀耀愿周龄月粤蕴月辕糟小鼠购于维通利华生物公司 ( 动物合格证号 : 杂悦载运员员鄄园园鄄园园员园 ), 饲养于中国协和医科大学实验动物研究所 阅酝耘酝 酝耘酝培养液 胎牛血清 ( 枣藻贼葬造遭燥增蚤灶藻泽藻鄄则怎皂, 云月杂 ) 为匀赠糟造燥灶藻公司产品 匀粤栽选择培养液 生物素标记的羊抗鼠陨早酝为杂蚤早皂葬公司产品 匀砸孕标记羊抗小鼠陨早酝为灾藻糟贼燥则公司产品, 悦赠猿标记葬增鄄蚤凿蚤灶为允葬糟噪泽燥灶公司产品, 杂月粤悦造燥灶燥贼赠责蚤灶早杂赠泽贼藻皂辕匀砸孕为杂燥怎贼澡藻则灶月蚤燥贼藻糟澡公司产品, 明胶 ( 郧藻造葬贼蚤灶 ) 阅粤孕陨为杂蚤早皂葬公司产品 宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早试剂盒购自普利莱基因有限公司 孕灾阅云为酝蚤造造蚤责燥则藻公司产品, 透析管为郧藻月粤公司产品 员援圆摇细胞培养匀蕴杂耘悦泽细胞培养在阅酝耘酝培养液中, 蕴泽员苑源栽细胞培养在酝耘酝培养液中, 杂孕圆辕园细胞和分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞均培养在阅酝耘酝培养液中 以上培养液中均含有员园豫云月杂, 筛选杂交瘤细胞时加入匀粤栽选择培养液 员援猿摇月粤蕴月辕糟小鼠的免疫及细胞融合 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园园愿年愿月, 员缘 ( 源 ) 将对数生长期的匀蕴杂耘悦泽注射于月粤蕴月辕糟小鼠远腹部皮下 ( 共远只 ), 每只小鼠注射员伊员园个匀蕴杂耘悦泽, 每圆周员次, 连续免疫员圆个月 每隔圆个月从小鼠尾静脉取血分离血清, 采用固定细胞免疫荧光法测定血清中抗匀蕴杂耘悦抗体滴度 当免疫血清抗体滴度不再升高时, 同时测定免疫血清对结肠癌细胞与肝窦内皮细胞黏附的影响 取血清滴度最高并具有抑制结肠癌细胞与肝窦内皮细胞黏附作用的小鼠脾细胞与杂孕圆辕园细胞融合, 融合细胞接种于甲基纤维素选择性培养皿中 愿耀耀耀耀耀耀员园凿后挑出单个孤立生长的细胞集落转接于怨远孔培养板, 继续培养苑耀耀耀耀耀耀员源凿, 用活细胞荧光测定上清中单抗与匀蕴杂耘悦的特异结合能力 员援源摇单克隆抗体亚型的测定及单克隆抗体的纯化采用杂燥怎贼澡藻则灶月蚤燥贼藻糟澡生产的单抗分型检测试剂盒, 按照试剂盒说明书进行操作 陨早酝抗体采用粤皂藻则泽澡葬皂公司的匀蚤贼则葬责预装柱纯化, 纯化后的单抗经杂阅杂鄄孕粤郧耘鉴定 员援缘摇活细胞免疫荧光法筛选抗肝窦内皮细胞膜抗原的单抗缘将肝窦内皮细胞以员伊员园辕孔接种于怨远孔培养板中, 细胞培养圆凿后吸弃培养液, 加入抗肝窦内皮细胞的单克隆抗体, 同时设正常小鼠陨早酝作为阴性对照 室温孵育员澡, 用含孕月杂洗涤, 加入生物素标记羊抗小鼠陨早酝 ( 员颐源园园 ), 室温孵育猿园皂蚤灶, 孕月杂洗涤, 加入悦赠猿鄄粤增蚤凿蚤灶 ( 员颐员园园园 ), 室温孵育猿园皂蚤灶后, 孕月杂洗涤 ; 最后用含员园 μ 早辕皂造阅粤孕陨的缘园豫甘油覆盖细胞 员援远摇黏附实验测定肿瘤细胞的黏附能力用悦葬造糟藻蚤灶粤酝 ( 蚤灶增蚤贼则燥早藻灶公司 ) 标记肿瘤细胞 悦葬造糟藻蚤灶粤酝能够自由穿透细胞膜, 进入细胞后, 被胞质中的脂酶切割释放荧光产物并被保留在胞内, 从而较长时间标记细胞, 而不影响细胞的黏附能力 呈对数生长的结肠癌细胞蕴泽员苑源栽用无血清员远源园培养液洗涤, 用缘皂燥造辕蕴悦葬造糟藻蚤灶粤酝于猿苑益 缘豫悦韵圆培养标记猿园皂蚤灶 标记的肿瘤细胞经无血清员远源园 [ 远培养液洗涤后用于黏附试验 ] 怨远孔培养板经圆豫明胶于猿苑益 缘豫悦韵圆培养箱中包被猿园皂蚤灶后, 将源员伊员园蕴杂耘悦接种于平板, 培养圆源澡 经无血清培养液洗涤, 加入稀释好的上述实验中制备的免疫血清或者纯化的功能性单克隆抗体员圆月远, 孵育猿园缘皂蚤灶, 每孔加入含圆援缘伊员园悦葬造糟藻蚤灶粤酝标记的蕴泽员苑源栽结肠癌细胞 于猿苑益 缘豫悦韵圆共同静止孵育员澡后, 振荡洗涤远次, 洗去未黏附的肿瘤细胞 用荧光显微镜镜检并拍照黏附的肿瘤细胞 每个视野黏附的肿瘤细胞采用陨孕孕缘援员责造怎泽软件计数 员援苑摇抗体识别抗原的分离提取用亲和层析方法提取该单克隆抗体所识别的抗原 将纯化的单克隆抗体员圆月远与悦晕月则鄄葬糟贼蚤增葬贼藻凿

3 孙力超, 等援抑制结肠癌细胞与肝窦内皮细胞黏附的功能性抗体的部分研究 猿圆猿 杂藻责澡葬皂泽藻源月交联, 将用砸葬凿蚤燥蚤皂皂怎灶燥责则藻糟蚤责蚤贼葬贼蚤燥灶 ( 砸陨孕粤 ) 方法提取匀蕴杂耘悦细胞的总蛋白溶液与偶联员圆月远的柱料于源益混合过夜 用园援员皂燥造辕蕴的甘氨酸 ( 责匀圆援缘 ) 洗脱层析柱上的抗原, 将不同管洗脱抗原在真空冷冻浓缩仪上浓缩至圆园 μ 造, 合并不同管浓缩抗原, 移入到透析管中透析 员援愿摇宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早以及孕粤郧耘胶硝酸银染色检测抗匀蕴杂耘悦单抗识别的抗原分子提取匀蕴杂耘悦总蛋白, 用月悦粤方法定量后, 取猿园 μ 早蛋白经杂阅杂鄄孕粤郧耘分离, 采用半干式电转移法将圆蛋白从凝胶转移到硝酸纤维素膜 ( 园援苑缘皂粤辕糟皂, 圆澡 ) 丽春红染色确定蛋白转移情况, 并标出标准分子量蛋白的位置 将膜放在缘豫的脱脂奶 ( 溶于孕月杂, 责匀苑援源 ) 中源益封闭过夜, 与杂交瘤上清猿苑益下孵育员澡, 以杂孕圆辕园培养上清作为一抗阴性对照 孕月杂清洗后与匀砸孕标记羊抗小鼠陨早酝 ( 员颐圆园园 ) 猿苑益下孵育员澡 用孕月杂栽洗膜源次, 耘悦蕴发光试剂盒显垣色 粤早能与氨基酸形成稳定的复合物, 然后在还垣原剂甲醛作用下粤早还原成银颗粒, 蛋白电泳条带可被染成黑褐色, 具体操作按照杂糟澡燥藻灶造藻等设计的方法进行 员援怨摇统计学处理统计学处理采用杂孕杂杂员园援园软件包, 进行贼检验 统计学显著性水平为孕约园援园缘, 所有的孕值均为双尾检验 圆摇结摇果 圆援员摇匀蕴杂耘悦免疫后动物血清抗体效价变化以及免疫血清的黏附抑制作用远以员伊员园个匀蕴杂耘悦连续免疫小鼠员园个月后, 固定细胞免疫荧光法检测每只小鼠血清效价 其中圆号小鼠效价最高, 达到员颐缘园园园园 ( 图员 ); 再继续免疫圆个月, 血清的抗体滴度不再显著升高 这时取小鼠脾细胞与杂孕圆辕园细胞融合, 制备了抗匀蕴杂耘悦的单克隆抗体库 免疫血清在员颐员园园稀释时, 能抑制结肠癌细胞与人肝窦内皮细胞的黏附 ( 图圆 ) 圆援圆摇功能性单抗的成功筛选与鉴定 圆援圆援员摇识别人肝窦内皮细胞膜蛋白单抗的筛选鉴定摇免疫融合后提取了员源源园个单克隆杂交瘤细胞培养于怨远孔板中, 有员圆园员个杂交瘤细胞存活, 其中与匀蕴杂耘悦泽明显反应阳性的有员员怨个克隆 图猿 是其中一株单抗 ( 员圆月远 ) 与人匀蕴杂耘悦泽反应的活细胞免疫荧光的结果 圆援圆援圆摇抑制结肠癌细胞与肝窦内皮细胞黏附的功能性单抗筛选摇黏附抑制实验结果显示, 抗匀蕴杂耘悦 单抗能显著抑制结肠癌细胞蕴泽员苑源栽与人肝窦内皮细胞的黏附, 抑制率在猿园豫耀耀耀耀耀耀缘员豫, 其中员圆月远单抗的抑制作用最强, 抑制率在缘园豫以上 ( 图源 ) 图员摇免疫荧光法检测圆号小鼠免疫血清效价 ( 伊源园 ) 裕云蚤早援员摇阅藻贼藻糟贼蚤燥灶燥枣蚤皂皂怎灶藻泽藻则怎皂贼蚤贼藻则燥枣圆皂燥怎泽藻遭赠蚤皂皂怎灶燥枣造怎燥则藻泽糟藻灶糟藻贼藻糟澡灶蚤择怎藻 ( 伊源园 ) 粤 : 陨皂皂怎灶藻泽藻则怎皂凿蚤造怎贼蚤燥灶员颐圆园园 ; 月 : 陨皂皂怎灶藻泽藻则怎皂凿蚤造怎贼蚤燥灶员颐圆园园园 ; 悦 : 陨皂皂怎灶藻泽藻则怎皂凿蚤造怎贼蚤燥灶员颐缘园园园园 ; 阅 : 晕燥则皂葬造皂燥怎泽藻泽藻则怎皂凿蚤造怎贼蚤燥灶员颐圆园园 图圆摇免疫血清抑制结肠癌细胞蕴泽员苑源栽与人肝窦内皮细胞的黏附 ( 伊员园园 ) 云蚤早援圆摇陨皂皂怎灶藻泽藻则怎皂蚤灶澡蚤遭蚤贼藻凿贼澡藻葬凿澡藻泽蚤燥灶遭藻贼憎藻藻灶蕴泽员苑源栽葬灶凿蕴杂耘悦泽 ( 伊员园园 ) 粤 : 晕燥则皂葬造皂燥怎泽藻泽藻则怎皂 ( 凿蚤造怎贼蚤燥灶员颐员园园 ); 月 : 陨皂皂怎灶藻泽藻则怎皂 ( 凿蚤造怎贼蚤燥灶员颐远园园 ); 悦 : 陨皂皂怎灶藻泽藻则怎皂 ( 凿蚤造怎贼蚤燥灶员颐员园园 ) 图猿活细胞免疫荧光检测员圆月远单克隆抗体与人肝窦内皮细胞膜表面抗原蛋白的结合 ( 伊员园园 ) 云蚤早援猿摇陨皂皂怎灶燥枣造怎燥则藻泽糟藻灶糟藻则藻泽怎造贼泽燥枣员圆月远皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿赠遭蚤灶凿蚤灶早憎蚤贼澡皂藻皂遭则葬灶藻葬灶贼蚤早藻灶燥枣匀蕴杂耘悦泽 ( 伊员园园 ) 粤 : 员圆月远皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿赠 ; 月 : 悦燥灶贼则燥造 圆援猿摇单抗的亚型鉴定在制备的圆园种抗匀蕴杂耘悦单克隆抗体中员缘株为陨早酝型 ( 包括员圆月远 ), 猿株为陨早郧型, 圆株单抗检测不到重链, 没有发现复合类型克隆

4 猿圆源 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园园愿年愿月, 员缘 ( 源 ) 圆援源摇员圆月远抗体对结肠癌细胞与人肝窦内皮细胞黏附的抑制员圆月远杂交瘤细胞大量培养上清用匀蚤贼则葬责疏水 ( 粤皂藻则泽澡葬皂公司 ) 纯化后获取员圆月远单抗, 经杂阅杂鄄孕粤郧耘电泳鉴定为单一的抗体条带 将员圆月远进行结肠癌细胞与肝窦内皮细胞黏附的阻断实验, 结果显示该单克隆抗体在缘耀耀耀耀耀耀圆园园 μ 早辕皂造范围内能明显抑制匀蕴杂耘悦与蕴泽员苑源栽之间的黏附 ( 孕约园援园缘, 图缘 ) 图源摇单克隆抗体对结肠癌细胞蕴泽员苑源栽与人肝窦内皮细胞黏附的抑制作用云蚤早援源摇陨灶澡蚤遭蚤贼燥则赠藻枣枣藻糟贼泽燥枣皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽葬早葬蚤灶泽贼葬凿澡藻泽蚤燥灶遭藻贼憎藻藻灶蕴泽员苑源栽泽葬灶凿蕴杂耘悦泽 [ 怨继发组织器官定位等 ] 肿瘤的转移有明显的组 [ 员园织器官特异性, 如结肠癌多发生肝转移 ], 肺癌倾 [ 员员鄄员圆 ] 向于脑转移等 尽管肿瘤的组织器官特异性转移可能与解剖学结构和血供有关, 但并不能完全解释其嗜器官转移, 如胃癌与结肠癌的血流相似, 但 [ 员猿胃癌最多见的是淋巴结和腹腔转移 ] 近年来的研究发现, 肿瘤细胞在特定组织器官的转移与靶组 [ 怨织器官内皮细胞的黏附密切相关 ] : 这种黏附作用包括肿瘤细胞与内皮细胞的瞬时特异性接触黏 [ 员园附 ], 以及随着肿瘤细胞黏附于靶器官内皮细胞, 两者相互作用导致多种黏附分子的表达, 协同促进 [ 员源鄄员缘肿瘤细胞的器官特异性转移 ] 这些报道表明, 靶器官血管内皮细胞表达的黏附分子在瘤细胞的嗜 [ 员远器官转移中具有重要作用 ] 若能用特异性抗体封闭这些血管内皮细胞黏附分子, 将有可能阻碍癌细胞在转移靶器官的着床, 从而抑制癌细胞在靶器官的生长 增殖 形成临床可见的远处器官转移灶, 达到预防 治疗肿瘤器官转移的目的 然而到目前为止尚未见到有关人肝窦内皮细胞黏附分子参与人结肠癌肝转移的相关报道 圆援缘摇 图缘摇不同质量浓度纯化抗体员圆月远对结肠癌细胞蕴泽员苑源栽与肝窦内皮细胞黏附的抑制作用 云蚤早援缘摇孕怎则蚤枣蚤藻凿皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿赠员圆月远葬贼凿蚤枣枣藻则藻灶贼糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶泽蚤灶澡蚤遭蚤贼藻凿葬凿澡藻泽蚤燥灶遭藻贼憎藻藻灶蕴泽员苑源栽葬灶凿蕴杂耘悦泽 孕! 园援园缘增泽糟燥灶贼则燥造 单克隆抗体员圆月远对抗原的特异性识别反应 宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早检测结果显示, 员圆月远单抗识别 匀蕴杂耘悦抗原的相对分子质量约为源远园园园 亲和纯化其识别的抗原经员园豫杂阅杂鄄孕粤郧耘电泳后, 经过硝酸银染色, 员圆月远单克隆抗体识别的抗原条带位置与 宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早的位置一致 ( 图远 ) 猿摇讨摇论 肿瘤转移是一个多步骤的复杂过程, 包括肿瘤细胞从原发灶的脱落 侵入基质 进入脉管系统 在 图远摇 硝酸银染色以及宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早 检测员圆月远单抗识别的抗原分子云蚤早援远摇员圆月远则藻糟燥早灶蚤扎藻凿葬灶贼蚤早藻灶泽葬泽凿藻贼藻糟贼藻凿遭赠宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早葬泽泽葬赠葬灶凿泽蚤造增藻则泽贼葬蚤灶蚤灶早酝 : 酝葬则噪藻则 ; 员 : 杂蚤造增藻则泽贼葬蚤灶蚤灶早 ; 圆 : 宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早 摇 摇 本研究通过肝窦内皮细胞免疫小鼠获得了抗肝 窦内皮细胞的大容量单抗库, 经活细胞荧光染色筛 选出能与肝窦内皮细胞反应的杂交瘤细胞员员怨株 ; 进一步通过体外黏附阻断实验筛选出圆园株能抑制 蕴泽员苑源栽与匀蕴杂耘悦黏附的杂交瘤培养上清, 将抑制 能力最强的单抗员圆月远纯化后进行黏附阻断实验, 发现该抗体能显著阻断蕴泽员苑源栽与匀蕴杂耘悦的黏附, 且呈剂量依赖相关性 结果表明该单抗识别的抗原

5 孙力超, 等援抑制结肠癌细胞与肝窦内皮细胞黏附的功能性抗体的部分研究 猿圆缘 分子是蕴泽员苑源栽细胞黏附匀蕴杂耘悦中起重要作用的黏附分子, 也可能在结肠癌细胞肝转移中有重要作用 进一步用单抗经亲和层析获得了相应的抗原分子, 经宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早和硝酸银染色证明该抗原分子的相对分子质量约为源远园园园, 目前正在对抗原分子基因进行鉴定分析, 为研究黏附分子在结肠癌肝转移中的作用机制奠定基础 目前, 肿瘤的靶向治疗和针对肿瘤新生血管的单克隆抗体研究越来越受到重视, 并且已经取得了重大进展, 如识别乳腺癌细胞上匀藻则鄄圆辕灶藻怎辕耘则遭月鄄圆 [ 员苑鄄员怨抗原的匀藻则糟藻责贼蚤灶已用于治疗乳腺癌 ] ; 识别灾耘郧云的单克隆抗体药粤增葬泽贼蚤灶, 通过抑制能够刺激新血管形成的 血管内皮细胞生长因子 ( 灾耘郧云 ) 治 [ 圆园鄄圆员疗大肠癌 ] 本课题筛选获得了圆园株能抑制蕴泽员苑源栽细胞与匀蕴杂耘悦细胞黏附的功能性单抗 这些单抗在人体内有可能通过封闭人肝窦内皮细胞的相应黏附分子, 阻断进入人血流中的结肠癌细胞与肝脏肝窦内皮细胞黏附 滞留和着床, 从而减少或阻断结肠癌肝转移灶的形成, 具有预防和治疗结肠癌肝转移的潜力 课题组下一步将用这些单抗在动物体内进行治疗结肠癌转移的研究, 为研制人源化抗体靶向抗癌药提供实验依据 [ 参考文献 ] [ 员 ] 摇允藻皂葬造粤, 杂蚤藻早藻造砸, 宰葬则凿耘, 藻贼葬造援悦葬灶糟藻则泽贼葬贼蚤泽贼蚤糟泽, 圆园园愿 [ 允 ] 援悦粤悦葬灶糟藻则允悦造蚤灶, 圆园园愿, 缘愿 ( 圆 ): 苑员鄄怨远援 [ 圆 ] 摇悦澡蚤遭葬灶葬再, 云怎躁蚤蚤杂, 陨糟澡蚤噪葬憎葬运, 藻贼葬造援栽怎皂燥则糟藻造造凿蚤泽泽燥糟蚤葬贼蚤燥灶泽糟燥则藻澡蚤早澡造赠糟燥则则藻造葬贼藻泽憎蚤贼澡造赠皂责澡灶燥凿藻皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽蚤灶泽怎责藻则枣蚤糟蚤葬造藻泽燥责澡葬早藻葬造糟葬则糟蚤灶燥皂葬 [ 允 ] 援允郧葬泽贼则燥藻灶贼藻则燥造匀藻责葬贼燥造, 圆园园缘, 圆园 ( 怨 ): 员猿苑员鄄员猿苑愿援 [ 猿 ] 摇月藻糟噪皂葬灶酝援悦粤酝泽葬则藻泽贼燥责责蚤灶早糟葬灶糟藻则蚤灶蚤贼泽皂藻贼葬泽贼葬贼蚤糟贼则葬糟噪泽 [ 允 ] 援允晕葬贼造悦葬灶糟藻则陨灶泽贼, 圆园园远, 怨愿 ( 怨 ): 缘苑远鄄缘苑苑援 [ 源 ] 摇悦澡葬灶粤韵援耘鄄糟葬凿澡藻则蚤灶蚤灶早葬泽贼则蚤糟糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援宰燥则造凿允郧葬泽贼则燥藻灶鄄贼藻则燥造, 圆园园远, 员圆 ( 圆 ): 员怨怨鄄圆园猿援 [ 缘 ] 摇周摇转, 遇摇珑, 冉宇靓援癌细胞和人血管内皮细胞黏附与器官特异性转移相关 [ 允 ] 援中国肿瘤临床, 圆园园远, 猿猿 ( 圆员 ): 员圆园员鄄员圆园源援 [ 远 ] 摇遇摇珑, 潘摇健, 周摇转, 等援抑制食管癌与肺血管内皮黏附的功能性抗体的制备 [ 允 ] 援中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园园远, 员猿 ( 缘 ): 猿猿圆鄄猿猿苑援 [ 苑 ] 摇杂糟澡造俟贼藻则运, 郧葬泽泽皂葬灶灶孕, 耘灶灶泽粤, 藻贼葬造援韵则早葬灶鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟皂藻贼葬泽贼葬贼蚤糟贼怎皂燥则糟藻造造葬凿澡藻泽蚤燥灶葬灶凿藻曾贼则葬增葬泽葬贼蚤燥灶燥枣糟燥造燥灶糟葬则糟蚤灶燥皂葬糟藻造造泽憎蚤贼澡凿蚤枣枣藻则藻灶贼皂藻贼葬泽贼葬贼蚤糟责燥贼藻灶贼蚤葬造 [ 允 ] 援粤皂允孕葬贼澡燥造, 圆园园远, 员远怨 ( 猿 ): 员园远源鄄员园苑猿援 [ 愿 ] 摇胡摇海, 冉宇靓, 遇摇珑, 等援靶向肿瘤血管内皮细胞抑制人肝癌移植瘤生长的功能性抗体的研制 [ 允 ] 援癌症, 圆园园苑, 圆远 ( 缘 ): 源缘猿鄄源缘苑援 [ 怨 ] 摇蕴葬灶早造藻赠砸砸, 云蚤凿造藻则陨允援栽怎皂燥则糟藻造造鄄燥则早葬灶皂蚤糟则燥藻灶增蚤则燥灶皂藻灶贼蚤灶贼藻则鄄葬糟贼蚤燥灶泽蚤灶贼澡藻责葬贼澡燥早藻灶藻泽蚤泽燥枣糟葬灶糟藻则皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽 [ 允 ] 援耘灶凿燥糟则砸藻增, 圆园园苑, 圆愿 ( 猿 ): 圆怨苑鄄猿圆员援 [ 员园 ] 耘灶灶泽粤, 郧葬泽泽皂葬灶灶孕, 杂糟澡造怎贼藻则运, 藻贼葬造援陨灶贼藻早则蚤灶泽糟葬灶凿蚤则藻糟贼造赠皂藻凿蚤葬贼藻皂藻贼葬泽贼葬贼蚤糟贼怎皂燥则糟藻造造葬凿澡藻泽蚤燥灶憎蚤贼澡蚤灶贼澡藻造蚤增藻则泽蚤灶怎泽燥蚤凿泽 [ 允 ] 援允郧葬泽贼则燥蚤灶贼藻泽贼杂怎则早, 圆园园源, 愿 ( 愿 ): 员园源怨鄄员园远园援 [ 员员 ] 悦葬泽贼则怎糟糟蚤宰粤, 运灶蚤泽藻造赠允孕援粤灶怎责凿葬贼藻燥灶贼澡藻贼则藻葬贼皂藻灶贼燥枣悦晕杂皂藻贼葬泽贼葬泽藻泽蚤灶泽皂葬造造糟藻造造造怎灶早糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则允, 圆园园愿, 员源 ( 猿 ): 员猿愿鄄员源远援 [ 员圆 ] 再葬灶燥杂, 酝葬贼泽怎皂燥则蚤再, 陨噪怎贼葬运, 藻贼葬造援悦怎则则藻灶贼泽贼葬贼怎泽葬灶凿责藻则泽责藻糟鄄贼蚤增藻燥枣葬灶早蚤燥早藻灶藻泽蚤泽葬灶凿葬灶贼蚤增葬泽糟怎造葬则贼澡藻则葬责藻怎贼蚤糟泽贼则葬贼藻早赠 : 灶燥灶鄄泽皂葬造造糟藻造造造怎灶早糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援陨灶贼允悦造蚤灶韵灶糟燥造, 圆园园远, 员员 ( 圆 ): 苑猿鄄愿员援 [ 员猿 ] 月葬蚤云, 郧怎燥载, 再葬灶早蕴, 藻贼葬造援耘泽贼葬遭造蚤泽澡皂藻灶贼葬灶凿糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶燥枣葬澡蚤早澡皂藻贼葬泽贼葬贼蚤糟责燥贼藻灶贼蚤葬造蚤灶贼澡藻责藻则蚤贼燥灶藻怎皂枣燥则澡怎皂葬灶早葬泽贼则蚤糟糟葬灶糟藻则遭赠燥则贼澡燥贼燥责蚤糟贼怎皂燥则糟藻造造蚤皂责造葬灶贼葬贼蚤燥灶 [ 允 ] 援阅蚤早阅蚤泽杂糟蚤, 圆园园苑, 缘圆 ( 远 ): 员缘苑员鄄员缘苑愿援 [ 员源 ] 晕蚤怎允载, 在澡葬灶早宰允, 再藻蕴再, 藻贼葬造援栽澡藻则燥造藻燥枣葬凿澡藻泽蚤燥灶皂燥造藻糟怎造藻泽, 葬造责澡葬增遭藻贼葬猿, 葬造责澡葬增遭藻贼葬缘葬灶凿贼澡藻蚤则造蚤早葬灶凿泽蚤灶贼澡藻贼怎皂燥则糟藻造造葬灶凿藻灶凿燥贼澡藻造蚤葬造糟藻造造葬凿澡藻泽蚤燥灶 [ 允 ] 援耘怎则允悦葬灶糟藻则孕则藻增, 圆园园苑, 员远 ( 远 ): 缘员苑鄄缘圆苑援 [ 员缘 ] 再葬灶早郧再, 载怎运杂, 孕葬灶在匝, 藻贼葬造援陨灶贼藻早则蚤灶葬造责澡葬增遭藻贼葬远皂藻凿蚤葬贼藻泽贼澡藻责燥贼藻灶贼蚤葬造枣燥则糟燥造燥灶糟葬灶糟藻则糟藻造造泽贼燥糟燥造燥灶蚤扎藻蚤灶葬灶凿皂藻贼葬泽贼葬泽蚤扎藻贼燥贼澡藻造蚤增藻则 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则杂糟蚤, 圆园园愿, 怨怨 ( 缘 ): 愿苑怨鄄愿愿苑援 [ 员远 ] 陨泽澡蚤扎怎运, 杂怎灶燥泽藻晕, 再葬皂葬扎葬噪蚤运, 藻贼葬造援阅藻增藻造燥责皂藻灶贼葬灶凿糟澡葬则葬糟鄄贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶燥枣葬皂燥凿藻造燥枣造蚤增藻则皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽怎泽蚤灶早澡怎皂葬灶糟燥造燥灶糟葬灶糟藻则匀悦栽鄄员员远糟藻造造泽 [ 允 ] 援月蚤燥造孕澡葬则皂月怎造造, 圆园园苑, 猿园 ( 怨 ): 员苑苑怨鄄员苑愿猿援 [ 员苑 ] 匀怎燥遭藻则允, 允葬糟噪蚤泽糟澡悦, 哉灶贼糟澡酝, 藻贼葬造援粤凿躁怎增葬灶贼贼澡藻则葬责赠憎蚤贼澡贼则葬泽鄄贼怎扎怎皂葬遭 ( 匀藻则糟藻责贼蚤灶 ) 蚤灶责则蚤皂葬则赠遭则藻葬泽贼糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援在藻灶贼则葬造遭造郧赠灶葬噪燥造, 圆园园远, 员圆愿 ( 员 ): 猿园鄄猿苑援 [ 员愿 ] 粤则灶燥怎造凿蕴, 郧藻造造赠酝, 孕藻灶葬怎造贼鄄蕴造燥则糟葬云, 藻贼葬造援栽则葬泽贼怎扎怎皂葬遭鄄遭葬泽藻凿贼则藻葬贼皂藻灶贼燥枣匀耘砸圆鄄责燥泽蚤贼蚤增藻遭则藻葬泽贼糟葬灶糟藻则 : 葬灶葬灶贼蚤遭燥凿赠鄄凿藻责藻灶凿藻灶贼糟藻造造怎造葬则糟赠贼燥贼燥曾蚤糟蚤贼赠皂藻糟澡葬灶蚤泽皂 [ 允 ]? 月则允悦葬灶糟藻则, 圆园园远, 怨源 ( 圆 ): 圆缘怨鄄圆远苑援 [ 员怨 ] 月怎则泽贼藻蚤灶匀允, 运藻泽澡葬增蚤葬澡粤, 月葬则燥灶粤阅, 藻贼葬造援栽则葬泽贼怎扎怎皂葬遭责造怎泽增蚤灶燥则藻造遭蚤灶藻燥则贼葬曾葬灶藻糟澡藻皂燥贼澡藻则葬责赠枣燥则匀耘砸圆鄄燥增藻则藻曾责则藻泽泽蚤灶早皂藻贼葬泽贼葬贼蚤糟遭则藻葬泽贼糟葬灶糟藻则 : 贼澡藻贼则葬泽贼怎扎怎皂葬遭葬灶凿增蚤灶燥则藻造遭蚤灶藻燥则贼葬曾葬灶藻泽贼怎凿赠 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则, 圆园园苑, 员员园 ( 缘 ): 怨远缘鄄怨苑圆援 [ 圆园 ] 悦澡怎耘援月藻增葬糟蚤扎怎皂葬遭贼葬则早藻贼藻凿贼澡藻则葬责赠 : 增葬造蚤凿葬贼蚤燥灶燥枣葬灶早蚤燥早藻灶藻泽蚤泽葬泽葬噪藻赠贼葬则早藻贼枣燥则葬凿增葬灶糟藻凿糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援悦造蚤灶悦燥造燥则藻糟贼葬造悦葬灶糟藻则, 圆园园源, 源 ( 员 ): 员远援 [ 圆员 ] 砸葬赠鄄悦燥择怎葬则凿陨, 月葬糟澡藻造燥贼栽, 杂葬遭葬悦, 藻贼葬造援粤则藻葬灶贼蚤葬灶早蚤燥早藻灶蚤糟葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽怎灶蚤增藻则泽葬造枣燥则泽燥造蚤凿贼怎皂燥则 [ 允 ]? 月怎造造悦葬灶糟藻则援圆园园苑, 怨源 : 杂员怨员鄄杂员怨远援 [ 收稿日期 ] 摇圆园园愿原园缘原员缘 [ 修回日期 ] 摇圆园园愿原园苑原员圆 [ 本文编辑 ] 摇王摇莹