员圆圆 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员园年源月, 员苑 ( 圆 ) 孕则藻责葬则葬贼蚤燥灶燥枣枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽葬早葬蚤灶泽贼澡怎皂葬灶造蚤增藻则糟葬灶糟藻则泽贼藻皂糟藻造造泽 杂哉晕蕴蚤鄄糟澡葬燥, 在匀粤韵载怎葬灶, 再哉蕴燥灶早, 匀粤晕蕴怎鄄造怎,

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1 中国肿瘤生物治疗杂志摇澡贼贼责 : 辕辕憎憎憎援遭蚤燥贼澡藻则援燥则早悦澡蚤灶允悦葬灶糟藻则月蚤燥贼澡藻则, 粤责则援圆园员园, 灾燥造援员苑, 晕燥援圆 员圆员 阅韵陨 : 员园援猿愿苑圆辕躁援蚤泽泽灶援员园园苑鄄猿愿缘载援圆园员园援园圆援园园圆 研究快报 抗肝癌干细胞功能性单克隆抗体的研制 孙力超, 赵摇璇, 遇摇珑, 韩璐璐, 刘摇彤, 胡摇海, 孙立新, 杨治华, 冉宇靓 ( 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室, 北京员园园园圆员 ) 摇 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 专家点评摇摇目前临床上治疗肝癌已有手术 化疗 介入治疗 肝移植等多种手段, 但肝癌患者缘年生存率仍仅有 员源豫耀耀耀耀耀耀耀耀猿园豫, 其根本原因是肝癌的转移和复发率高, 且现有治疗措施对转移 复发疗效甚微 近年来肿瘤干细胞 ( 糟葬灶糟藻则泽贼藻皂糟藻造造, 悦杂悦 ) 已成为肿瘤研究的新热点, 悦杂悦是肿瘤转移 复发和耐药的根源 因此, 建立靶向悦杂悦的治疗新策略, 对于治疗肿瘤转移 复发可能会有新突破 本期刊登了孙力超等人的论文, 作者在前期成功分离获得人肝癌组织中悦杂悦的基础上, 采用独特的技术制备了大容量功能性单抗库, 通过对圆怨远源个杂交瘤克隆的筛选, 获得了员员远株能与人肝癌干细胞样细胞膜结合的阳性单抗 垣其中有猿猿株能识别杂孕分选的悦杂悦, 远株还能识别悦阅员猿猿悦杂悦和含高比例悦杂悦的成球细胞 裸鼠体内致瘤性研究发现, 其中源株单抗分选的阳性细胞的致瘤性较单抗阴性细胞高员园园倍, 证明了这源株单抗是抗肝癌悦杂悦的单抗 此外, 体外功能研究还证明, 这些单抗能显著抑制杂孕分选的悦杂悦和成球悦杂悦的增殖与成球生长 该研究不仅具有很强的创新性, 而且还有重要的理论和实际意义 其创新和意义在于 :( 员 ) 用肝癌干细胞样细胞免疫小鼠直接研制抗悦杂悦 单抗的报道很少, 有关抗肝癌悦杂悦单抗的研究未见有报道 ;( 圆 ) 首次获得了多株抗人肝癌悦杂悦单抗, 为阐明肝癌悦杂悦 在肝癌转移 复发 耐药中的作用及机制奠定了重要基础, 同时还可用这些单抗筛查肝癌悦杂悦新的标志物或重要相关分子 ;( 猿 ) 初步证明了源株单抗是具有显著抑制肝癌悦杂悦增殖和成球生长的功能性单抗, 提示这些功能性单抗将可能为靶向肝癌悦杂悦的治疗提供有应用潜力的候选药物 摇摇摇摇教育部长江学者 分子肿瘤学国家重点实验室主任摇摇摇 国家 愿远猿 计划专家组组长 怨苑猿 计划首席科学家摇摇摇 中国医学科学院副院长 中国协和医科大学副校长摇摇摇 [ 摘摇要 ] 摇目的 : 研制抗肝癌干细胞的功能性单克隆抗体, 为肝癌干细胞的靶向治疗提供候选抗体药物 方法 : 从人肝癌组织中分离人肝癌干细胞样细胞 ( 澡怎皂葬灶造蚤增藻则糟葬灶糟藻则泽贼藻皂鄄造蚤噪藻糟藻造造泽, 澡蕴悦杂蕴悦泽 ), 免疫月粤蕴月辕糟裸鼠, 采用脾细胞融合法制备大容量单抗库 应用细胞免疫荧光 无血清成球培养 裸鼠皮下成瘤等方法筛选 鉴定特异识别肝癌干细胞的单克隆抗体 流式细胞仪分选澡蕴悦杂蕴悦泽侧群细胞 ( 澡蕴悦杂蕴悦泽泽蚤凿藻责燥责怎造葬贼蚤燥灶糟藻造造泽, 澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕 ), 无血清悬浮培养法和悦悦运鄄愿法检测杂交瘤单抗对澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕自我更新和增殖能力的影响 结果 : 细胞融合后获得圆怨远源株杂交瘤克隆, 在能与澡蕴悦杂蕴悦泽反应的圆猿苑株克隆中, 有员员远株单抗能与澡蕴悦杂蕴悦泽的细胞膜结合, 其中的猿猿株杂交瘤单抗只与澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕反应 ( 阳性率为圆豫耀耀耀耀耀耀耀耀缘豫 ) 不与非 澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕反应 该猿猿株单抗中有远株能与悦阅员猿猿阳性细胞有不同比例的共染, 并且与无血清悬浮培养的成球细胞呈阳性源反应 ( 阳性率为猿豫耀耀耀耀耀耀耀耀圆远豫 ), 明显高于澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕 裸鼠皮下接种员伊员园个员缘阅圆单抗阳性的澡蕴悦杂蕴悦泽, 成瘤率为员园园豫 功能性筛选实验发现, 远株单抗中的源株能显著抑制澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕的增殖和成球生长, 其抑制率分别为圆源豫耀耀耀耀耀耀耀耀源圆豫和员猿豫耀耀耀耀耀耀耀耀缘园豫 结论 : 采用自建的大容量单克隆抗体库技术, 筛选获得了源株特异性识别澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕的功能性单抗, 为肝癌干细胞的抗体靶向治疗奠定了基础 [ 关键词 ] 摇肝肿瘤 ; 肿瘤干细胞 ; 单克隆抗体 ; 靶向治疗 [ 文献标志码 ] 摇粤摇摇摇摇 [ 文章编号 ] 摇员园园苑鄄猿愿缘载 ( 圆园员园 ) 园圆鄄园员圆员鄄园苑 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 [ 基金项目 ] 摇国家重点基础研究发展计划 ( 怨苑猿 ) 资助项目 ( 晕燥援圆园园怨悦月缘圆员愿园源 ) 孕则燥躁藻糟贼泽怎责责燥则贼藻凿遭赠贼澡藻酝葬躁燥则月葬泽蚤糟砸藻泽藻葬则糟澡葬灶凿阅藻增藻造燥责皂藻灶贼孕则燥早则葬皂 ( 怨苑猿孕则燥早则葬皂 ) 燥枣悦澡蚤灶葬 ( 晕燥援圆园园怨悦月缘圆员愿园源 ) [ 作者简介 ] 摇孙力超 ( 员怨愿园原 ), 男, 山西省太原市人, 博士, 主要从事肿瘤分子靶向治疗方面的研究, 耘鄄皂葬蚤造 : 泽怎灶造蚤糟澡葬燥赃员怨愿园岳澡燥贼皂葬蚤造援糟燥皂 赵璇 ( 员怨愿猿原 ), 女, 北京市人, 硕士, 主要从事肿瘤分子靶向治疗方面的研究 并列第一作者 [ 通信作者 ] 摇冉宇靓 ( 砸粤晕再怎鄄造蚤葬灶早, 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早葬怎贼澡燥则 ), 耘鄄皂葬蚤造 : 则葬灶赃赠怎造蚤葬灶早岳员圆远援糟燥皂

2 员圆圆 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员园年源月, 员苑 ( 圆 ) 孕则藻责葬则葬贼蚤燥灶燥枣枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽葬早葬蚤灶泽贼澡怎皂葬灶造蚤增藻则糟葬灶糟藻则泽贼藻皂糟藻造造泽 杂哉晕蕴蚤鄄糟澡葬燥, 在匀粤韵载怎葬灶, 再哉蕴燥灶早, 匀粤晕蕴怎鄄造怎, 蕴陨哉栽燥灶早, 匀哉匀葬蚤, 杂哉晕蕴蚤鄄曾蚤灶, 再粤晕郧在澡蚤鄄澡怎葬, 砸粤晕再怎鄄造蚤葬灶早 ( 杂贼葬贼藻运藻赠蕴葬遭燥则葬贼燥则赠燥枣酝燥造藻糟怎造葬则韵灶糟燥造燥早赠, 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻燥枣韵灶糟燥造燥早赠, 悦澡蚤灶藻泽藻粤糟葬凿藻皂赠燥枣酝藻凿蚤糟葬造杂糟蚤藻灶糟藻驭孕藻噪蚤灶早哉灶蚤燥灶酝藻凿蚤糟葬造悦燥造造藻早藻, 月藻蚤躁蚤灶早员园园园圆员, 悦澡蚤灶葬 ) [ 粤遭泽贼则葬糟贼 ] 摇韵遭躁藻糟贼蚤增藻 : 栽燥责则藻责葬则藻枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽 ( 酝糟粤遭泽 ) 葬早葬蚤灶泽贼造蚤增藻则糟葬灶糟藻则泽贼藻皂糟藻造造泽, 泽燥葬泽贼燥责则燥增蚤凿藻糟葬灶凿蚤凿葬贼藻葬灶贼蚤遭燥凿赠凿则怎早泽枣燥则泽贼藻皂糟藻造造鄄贼葬则早藻贼藻凿贼澡藻则葬责赠燥枣造蚤增藻则糟葬灶糟藻则援酝藻贼澡燥凿泽 : 匀怎皂葬灶造蚤增藻则糟葬灶糟藻则泽贼藻皂鄄造蚤噪藻糟藻造造泽 ( 澡蕴悦杂蕴悦泽 ) 憎藻则藻泽藻责葬则葬贼藻凿枣则燥皂澡怎皂葬灶澡藻责葬贼燥糟葬则糟蚤灶燥皂葬贼蚤泽泽怎藻泽葬灶凿憎藻则藻怎泽藻凿贼燥蚤皂皂怎灶蚤扎藻月粤蕴月辕糟灶怎凿藻皂蚤糟藻援杂责造藻藻灶糟藻造造泽枣则燥皂澡蕴悦杂蕴悦泽鄄蚤皂皂怎灶蚤扎藻凿皂蚤糟藻憎藻则藻枣怎泽藻凿憎蚤贼澡杂孕圆辕园糟藻造造泽贼燥责则藻责葬则藻造葬则早藻皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿赠造蚤遭则葬则赠援匀赠鄄遭则蚤凿燥皂葬酝糟粤遭泽则藻糟燥早灶蚤扎蚤灶早澡蕴悦杂蕴悦泽憎藻则藻泽糟则藻藻灶藻凿葬灶凿蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿遭赠蚤皂皂怎灶燥枣造怎燥则藻泽糟藻灶糟藻, 泽责澡藻则藻枣燥则皂葬贼蚤燥灶糟怎造贼怎则藻葬灶凿 蚤灶增蚤增燥贼怎皂燥则枣燥则皂葬贼蚤燥灶葬泽泽葬赠泽援澡蕴悦杂蕴悦泽泽蚤凿藻责燥责怎造葬贼蚤燥灶糟藻造造泽 ( 澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕 ) 憎藻则藻泽燥则贼藻凿遭赠枣造燥憎糟赠贼燥皂藻贼则赠援栽澡藻藻枣枣藻糟贼泽燥枣澡赠遭则蚤凿燥皂葬酝糟粤遭泽燥灶泽藻造枣鄄则藻灶藻憎葬造葬灶凿责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤燥灶燥枣澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕憎藻则藻蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿遭赠泽藻则怎皂鄄枣则藻藻泽怎泽责藻灶泽蚤燥灶糟怎造贼怎则藻葬灶凿悦悦运鄄愿葬泽泽葬赠援砸藻泽怎造贼泽 : 粤贼燥贼葬造燥枣圆怨远源酝糟粤遭糟造燥灶藻泽憎藻则藻燥遭贼葬蚤灶藻凿遭赠枣怎泽蚤灶早蚤皂皂怎灶蚤扎藻凿泽责造藻藻灶糟藻造造泽憎蚤贼澡杂孕圆辕园糟藻造造泽, 葬灶凿圆猿苑酝糟粤遭泽糟燥怎造凿蚤灶贼藻则葬糟贼憎蚤贼澡澡蕴悦杂蕴悦泽葬泽凿藻贼藻糟贼藻凿遭赠枣蚤曾藻凿鄄糟藻造造蚤皂皂怎灶燥枣造怎燥则藻泽糟藻灶糟藻 ; 员员远燥枣贼澡藻圆猿苑酝糟粤遭泽蚤灶贼藻则葬糟鄄贼藻凿憎蚤贼澡贼澡藻皂藻皂遭则葬灶藻燥枣澡蕴悦杂蕴悦泽, 葬灶凿猿猿酝糟粤遭泽泽责藻糟蚤枣蚤糟葬造造赠则藻葬糟贼藻凿憎蚤贼澡澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕遭怎贼灶燥贼憎蚤贼澡灶燥灶鄄澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕, 憎蚤贼澡责燥泽蚤贼蚤增藻则葬贼藻泽遭藻蚤灶早圆豫鄄缘豫援杂蚤曾燥枣贼澡藻猿猿酝糟粤遭泽糟燥鄄泽贼葬蚤灶藻凿憎蚤贼澡悦阅员猿猿燥灶澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕援云怎则贼澡藻则蚤灶增藻泽贼蚤早葬贼蚤燥灶泽澡燥憎藻凿贼澡葬贼贼澡藻责燥泽蚤贼蚤增藻则葬贼藻泽燥枣贼澡藻泽藻远酝糟粤遭泽憎藻则藻猿豫鄄圆远豫憎蚤贼澡泽责澡藻则藻糟藻造造泽葬枣贼藻则泽藻则怎皂鄄枣则藻藻泽怎泽责藻灶泽蚤燥灶糟怎造贼怎则藻, 源憎澡蚤糟澡憎藻则藻泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠澡蚤早澡藻则贼澡葬灶贼澡燥泽藻憎蚤贼澡澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕援栽怎皂燥则枣燥则皂葬贼蚤燥灶则葬贼藻憎葬泽员园园豫憎澡藻灶员伊员园澡赠遭则蚤凿燥皂葬糟造燥灶藻员缘阅圆鄄责燥泽蚤贼蚤增藻澡蕴悦杂蕴悦泽憎藻则藻蚤灶躁藻糟贼藻凿蚤灶贼燥灶怎凿藻皂蚤糟藻援云怎灶糟贼蚤燥灶葬造泽贼怎凿赠泽澡燥憎藻凿贼澡葬贼源燥枣贼澡藻泽藻远酝糟粤遭泽泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠泽怎责责则藻泽泽藻凿贼澡藻责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤燥灶葬灶凿泽责澡藻则藻枣燥则皂葬贼蚤燥灶葬遭蚤造蚤贼赠燥枣澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕, 憎蚤贼澡贼澡藻蚤灶澡蚤遭蚤贼燥则赠则葬贼藻泽遭藻蚤灶早圆源豫鄄源圆豫葬灶凿员猿豫鄄缘园豫, 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援悦燥灶糟造怎泽蚤燥灶 : 宰藻澡葬增藻泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿贼澡藻造葬则早藻酝糟粤遭造蚤遭则葬则赠葬早葬蚤灶泽贼澡蕴悦杂蕴悦泽, 枣则燥皂憎澡蚤糟澡源澡赠遭则蚤凿燥皂葬酝糟粤遭泽糟葬灶泽责藻糟蚤枣蚤糟葬造造赠则藻葬糟贼憎蚤贼澡澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕, 造葬赠蚤灶早葬枣燥怎灶凿葬贼蚤燥灶枣燥则糟葬灶糟藻则泽贼藻皂糟藻造造鄄遭葬泽藻凿葬灶贼蚤遭燥凿鄄赠鄄贼葬则早藻贼藻凿贼澡藻则葬责赠枣燥则造蚤增藻则糟葬灶糟藻则援 [ 运藻赠憎燥则凿泽 ] 摇造蚤增藻则灶藻燥责造葬泽皂泽 ; 糟葬灶糟藻则泽贼藻皂糟藻造造 ; 皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿赠 ; 贼葬则早藻贼藻凿贼澡藻则葬责赠 [ 悦澡蚤灶允悦葬灶糟藻则月蚤燥贼澡藻则, 圆园员园, 员苑 ( 圆 ): 员圆员鄄员圆苑 ] 摇摇 摇摇肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一, 其病死率居 [ 员鄄圆恶性肿瘤的第猿位 ], 肝癌患者缘年生存率仅有 [ 猿员源豫耀耀耀耀耀耀耀耀猿园豫 ] 肝癌的复发 转移是肝癌治疗失败 [ 源鄄缘 ] 甚至死亡的主要原因 已有研究报道, 肿瘤干细胞在恶性肿瘤的复发 转移中发挥着关键性作用, 而现有的治疗手段无法针对肿瘤干细胞这一导致肿瘤 [ 远鄄苑治疗失败 复发和转移的主要原因 ] 因此, 针对肿瘤干细胞的靶向治疗有望克服临床上现有治疗手 [ 愿鄄怨段的缺陷, 改善肝癌患者的预后 ] 本研究利用本室建立的大容量功能性单克隆抗体库, 筛选 鉴定能识别并且对肝癌干细胞具有抑制作用的功能性单克隆抗体, 以期为靶向肿瘤干细胞的肝癌治疗提供有应用前景的功能性单克隆抗体 员摇 员援员摇 材料与方法 实验动物 细胞和主要试剂 源耀耀耀耀耀耀耀耀远周龄月粤蕴月辕糟 ( 灶怎辕灶怎 ) 裸鼠购自北京联通 利华实验动物技术公司 [ 实验动物合格证号杂悦载运 ( 京 ) 圆园园苑鄄园园园员 ] 阅酝耘酝鄄耘培养液购自郧蚤遭糟燥公司, 阅粤孕陨购自杂蚤早皂葬公司, 进口胎牛血清为匀赠糟造燥灶藻公司生产 悦阅员猿猿抗体购自粤遭糟葬皂公司, 生物素鄄马抗小鼠陨早郧辕陨早酝购自灾藻糟贼燥则公司, 云陨栽悦鄄羊抗小鼠陨早郧辕陨早酝 悦赠猿鄄羊抗小鼠陨早郧辕陨早酝 悦赠圆鄄羊抗兔陨早郧和悦赠猿鄄亲和素购自允葬糟噪泽燥灶公司 单抗亚类检测试剂盒购自杂燥怎贼澡藻皂月蚤燥贼藻糟澡公司, 悦悦运鄄愿试剂盒购自日本同仁化学所 低黏附远孔板购自悦燥泽贼葬则公司 小鼠骨髓瘤细胞杂孕圆辕园为本室保藏 杂孕圆辕园细胞和杂交瘤细胞均培养在含员园豫进口胎牛血清的阅酝耘酝培养液中, 筛选杂交瘤细胞时加入匀粤栽 ( 杂蚤早皂葬公司 ) 选择培养液 员援圆摇肝癌干细胞样细胞的分离和培养人肝癌干细胞样细胞 ( 澡怎皂葬灶造蚤增藻则糟葬灶糟藻则泽贼藻皂糟藻造造泽, 澡蕴悦杂蕴悦泽 ) 的分离 培养按文献 [ 员园 ] 的方法进行 将从肝癌患者手术标本获得的肝癌组织以孕月杂

3 孙力超, 等援抗肝癌干细胞功能性单克隆抗体的研制 猿冲洗后剪成员皂皂 大小的小块, 用园援员豫胰酶和 园郾园圆缘豫 Ⅰ 型胶原酶在猿苑益下消化猿园皂蚤灶, 员缘园目滤网过滤, 源益下缘园园伊早离心缘皂蚤灶 将获得的细胞移至培养瓶中, 加入含员园豫云月杂 员园园早辕皂造牛脑抽提物 圆皂皂燥造辕蕴谷氨酰胺 员园园哉辕皂造青霉素 员园园皂早辕皂造链霉素的阅酝耘酝鄄耘培养基中培养源愿澡, 弃上清, 洗掉未贴壁细胞继续培养, 员周后挑取多个形成的集落, 混匀, 移入培养瓶培养, 命名为澡蕴悦杂蕴悦泽 员援猿摇 动物免疫 将澡蕴悦杂蕴悦泽注射于月粤蕴月辕糟 ( 灶怎辕灶怎 ) 小鼠腹部远皮下 ( 共远只 ), 每只小鼠注射员伊员园个澡蕴悦杂蕴悦泽, 每圆周员次, 连续免疫员圆个月 员援源摇 免疫荧光法检测免疫血清的效价 固定细胞免疫荧光检测 : 将澡蕴悦杂蕴悦泽接种于怨远 源孔培养板, 员伊员园个辕孔, 猿苑益 缘豫悦韵圆培养圆源澡 孕月杂分次洗涤, 经源豫多聚甲醛固定员缘皂蚤灶 园援圆豫栽则蚤贼燥灶鄄员园园通透缘皂蚤灶后, 每孔加入免疫血清或对照一抗, 室温反应员澡, 用含员豫月杂粤的孕月杂栽洗涤缘皂蚤灶伊缘次 ; 每孔加入员园园 μ 造生物素标记的陨早郧辕陨早酝 ( 员颐猿园园稀释 ), 室温反应猿园皂蚤灶, 洗涤同前 再加入 员园园 μ 造悦赠猿鄄亲合素 ( 员颐怨园园稀释 ), 室温避光反应猿园皂蚤灶后, 用员豫月杂粤的孕月杂洗涤缘皂蚤灶伊源次, 然后用孕月杂洗涤缘皂蚤灶伊圆次 最后用含员园早辕皂造阅粤孕陨 及缘园豫甘油的孕月杂封闭 活细胞免疫荧光检测 : 孕月杂洗涤怨远孔板中细胞后, 每孔加免疫血清或对照一抗, 室温反应员澡, 用含 员豫月杂粤的孕月杂栽洗涤缘次 为避免细胞丢失, 与免疫血清反应的细胞再用源豫多聚甲醛固定员缘皂蚤灶 以后的操作步骤同固定细胞免疫荧光检测 员援缘摇 免疫小鼠脾细胞与杂孕圆辕园细胞的融合 待澡蕴悦杂蕴悦泽免疫小鼠血清滴度达到员颐缘园园园园 愿且不再升高时, 取员伊员园 个免疫小鼠脾细胞与 苑圆伊员园个对数生长期的杂孕圆辕园细胞融合, 并接种于含有匀粤栽的甲基纤维素培养皿中, 培养愿耀耀耀耀耀耀耀耀员圆凿, 挑取孤立的 较大的细胞集落, 即杂交瘤细胞, 接种于 怨远孔板继续培养 员援远摇 流式细胞仪分选澡蕴悦杂悦蕴悦泽鄄杂孕 将澡蕴悦杂悦蕴悦泽制成单细胞悬液, 加入匀燥藻糟澡泽贼猿猿猿源圆染料 ( 终质量浓度为缘 μ 早辕皂造 ); 对照组加入维拉帕米 ( 终质量浓度为缘园 μ 早辕皂造 ) 猿苑益孵育怨园皂蚤灶, 弃上清, 用预冷孕月杂洗猿次, 加入孕陨至终质量浓度圆 μ 早辕皂造, 流式细胞仪检测并分选其中的侧群细胞 ( 泽蚤凿藻责燥责怎造葬贼蚤燥灶糟藻造造泽, 杂孕 ), 即为澡蕴悦杂悦蕴悦泽鄄杂孕 员援苑摇杂交瘤上清对澡蕴悦杂蕴悦泽成球能力的影响 将澡蕴悦杂蕴悦泽接种于低黏附的远孔培养板中, 用 含耘郧云 ( 圆园灶早辕皂造 ) 遭云郧云( 圆园灶早辕皂造 ) 月圆苑添加剂 ( 员颐缘园 ) 蕴陨云 ( 造藻怎噪藻皂蚤葬蚤灶澡蚤遭蚤贼燥则赠枣葬糟贼燥则, 员园灶早辕皂造 ) 蕴郧 ( 蕴鄄早造怎贼葬皂蚤灶藻, 圆皂皂燥造辕造 ) 和源园哉辕皂造肝素的 阅酝耘酝鄄云员圆培养基 ( 杂云酝 ), 在猿苑益 缘豫悦韵圆孵箱中培养, 苑耀耀耀耀耀耀耀耀员园凿形成细胞球 将其用胰酶鄄耘阅栽粤 消化, 并机械吹打成单细胞悬液 计数后重悬于 猿杂云酝培养基中, 以员伊员园个细胞接种于低黏附的远 孔板中, 连续传代猿次, 每孔加入杂交瘤上清, 记录 澡蕴悦杂蕴悦泽成球的时间及成球个数 员援愿摇 杂交瘤上清识别的澡蕴悦杂蕴悦泽裸鼠成瘤实验 远消化澡蕴悦杂蕴悦泽, 并以猿伊员园辕皂造重悬于缘园皂造离心管中, 每管员园皂造, 同时加入员园皂造杂交瘤细胞培养上清, 猿苑益孵育员澡, 孕月杂洗涤猿遍, 弃上清, 加入 云陨栽悦鄄羊抗小鼠陨早郧辕陨早酝 ( 员颐缘园稀释 ), 通过流式细胞仪分选出杂交瘤上清单抗阳性以及杂交瘤上清单猿源抗阴性的细胞 将阳性细胞按缘伊员园 员伊员园 员伊缘员园个辕只分别接种于月粤蕴月辕糟裸鼠右侧背部皮下 ; 源缘远阴性细胞按员伊员园 缘伊员园 员伊员园个辕只接种裸鼠的左侧背部皮下, 每组远只 接种后观察细胞成瘤情况 员援怨摇 耘蕴陨杂粤法检测抗澡蕴悦杂蕴悦泽单抗的类型 采用杂燥怎贼澡藻则灶月蚤燥贼藻糟澡的单抗类型耘蕴陨杂粤检测试剂盒测定杂交瘤单克隆抗体的类型, 操作按照试剂盒说明书进行 员援员园摇 悦悦运鄄愿法检测澡蕴悦杂蕴悦泽的增殖 猿将对数生长期的澡蕴悦杂蕴悦泽按员伊员园个接种到 怨远孔板中, 培养圆源澡后吸弃培养液, 加入抗澡蕴悦杂鄄蕴悦泽杂交瘤上清 培养猿凿后换液员次, 继续培养猿凿, 吸弃上清, 每孔加入员园 μ 造悦悦运鄄愿, 测定光密度 ( 阅 ) 值 实验以杂孕圆辕园细胞培养上清为阴性对照 按照以下公式计算细胞增殖抑制率 : 抑制率 ( 豫 ) 越 ( 对照组阅原实验组阅 ) 辕对照组阅伊员园园豫 员援员员摇 统计学处理 数据以珋曾依泽形式表示, 采用杂孕杂杂员圆援园软件分析, 组间差异采用贼检验, 以孕约园援园缘表示差异有统计学意义 圆摇结摇果 圆援员摇 动物免疫及大容量单抗库的制备 员圆猿 本实验室在前期的研究中, 从人肝癌手术标本中分离并建立了澡蕴悦杂蕴悦泽 本研究将澡蕴悦杂蕴悦泽免疫远 只小鼠, 在免疫员圆个月时, 采用固定细胞免疫荧光法检测每只免疫小鼠血清与澡蕴悦杂蕴悦泽细胞的反应, 其中 圆号小鼠免疫血清滴度最高, 其滴度大于员颐缘园园园园 同时采用固定细胞免疫荧光法检测小鼠免疫血清与

4 员圆源 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员园年源月, 员苑 ( 圆 ) 澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕的反应, 结果显示, 免疫血清与澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕反应的滴度为员颐源园园园, 提示免疫小鼠血清中含有识别肝癌干细胞的抗体 ( 图员 ) 继续免疫圆次后, 小鼠血清效价不再明显提高, 取圆号免疫小鼠脾脏细胞, 与杂孕圆辕园细胞融合后, 接种于圆园园个含有甲基纤维素培养基的培养皿 远耀耀耀耀耀耀耀耀员圆凿后, 从上述培养皿中挑取单个细胞集落, 接种源缘块怨远孔板, 经愿耀耀耀耀耀耀耀耀员源凿培养, 有圆怨远源个孔有杂交瘤克隆生长, 从而建立了含有圆怨远源个克隆的大容量单抗库 光法检测澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕以及非澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕中杂交瘤单抗与悦阅员猿猿共表达情况 结果显示, 其中远株杂交瘤单抗员缘阅圆 猿匀怨 猿郧苑 员园云远 员缘匀苑和员员粤苑与悦阅员猿猿同时识别澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕, 表现为红色荧光 ( 杂交瘤单抗 ) 和绿色荧光 ( 抗悦阅员猿猿单抗 ) 的双色免疫荧光共染 ( 表圆 ), 表明这远株杂交瘤单抗能够特异识别肝癌干细胞 表员摇固定细胞免疫荧光检测杂交瘤单抗与澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕的结合栽葬遭援员摇云蚤曾藻凿鄄糟藻造造蚤皂皂怎灶燥枣造怎燥则藻泽糟藻灶糟藻泽贼葬蚤灶蚤灶早蚤灶凿藻贼藻糟贼蚤燥灶燥枣蚤灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶遭藻贼憎藻藻灶澡赠遭则蚤凿燥皂葬皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽葬灶凿澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕 澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕 晕燥灶鄄澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕 酝糟粤遭 杂贼葬蚤灶蚤灶贼藻灶泽蚤贼赠 孕燥泽蚤贼蚤增藻则葬贼藻 ( 豫 ) 杂贼葬蚤灶蚤灶贼藻灶泽蚤贼赠 猿匀怨 员 原 员圆云源 垣 猿 原 愿悦苑 垣 缘 原 猿郧苑 缘 原 图员摇细胞免疫荧光法检测圆号小鼠免疫血清与澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕的反应 ( 伊员园园 ) 云蚤早援员摇陨灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶燥枣蚤皂皂怎灶藻泽藻则怎皂燥枣圆裕皂燥怎泽藻憎蚤贼澡澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕葬泽凿藻贼藻糟贼藻凿遭赠蚤皂皂怎灶燥枣造怎燥则藻泽糟藻灶糟藻泽贼葬蚤灶蚤灶早 ( 伊员园园 ) 粤 : 员颐员园园园蚤皂皂怎灶藻泽藻则怎皂 ; 月 : 员颐圆园园园蚤皂皂怎灶藻泽藻则怎皂 ; 悦 : 员颐源园园园蚤皂皂怎灶藻泽藻则怎皂 ; 阅 : 晕燥则皂葬造皂燥怎泽藻泽藻则怎皂圆援圆摇抗澡蕴悦杂蕴悦泽杂交瘤单抗的筛选将澡蕴悦杂蕴悦泽接种怨远孔板, 用杂云酝培养基培养猿园澡后, 采用固定细胞免疫荧光法检测单抗库中圆怨远源个杂交瘤上清与澡蕴悦杂蕴悦泽的反应, 其中显示荧光阳性反应的杂交瘤单抗有圆猿苑株 采用活细胞免疫荧光法筛检这圆猿苑株阳性单抗, 获得了特异与澡蕴悦杂蕴悦泽细胞膜结合的阳性杂交瘤单抗员员远株 用经流式细胞仪分选出的澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕和非澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕检测这员员远株单抗, 结果显示, 有猿猿株单抗只与澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕呈阳性反应, 提示这些杂交瘤单抗中有抗肝癌干细胞的特异单抗 表员列出了部分杂交瘤单克隆抗体与澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕的免疫荧光染色结果 圆援猿摇抗肝癌干细胞样细胞杂交瘤单抗的鉴定圆援猿援员摇杂交瘤单抗与悦阅员猿猿共定位摇悦阅员猿猿是肝 [ 员员鄄员圆癌干细胞的标志物之一 ] 为了进一步鉴定上述猿猿株与澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕阳性反应的杂交瘤单抗中识别特异肝癌干细胞的杂交瘤单抗, 采用双色免疫荧 员园月远 垣 苑 原 员缘匀苑 苑 原 员园云远 愿 原 员员粤苑 愿 原 员缘阅圆 员圆 原 表圆摇 免疫荧光染色检测杂交瘤单抗 悦阅员猿猿 与澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕的结合 ( 伊员园园 ) 栽葬遭援圆摇 陨皂皂怎灶燥枣造怎燥则藻泽糟藻灶糟藻泽贼葬蚤灶蚤灶早蚤灶凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣蚤灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶遭藻贼憎藻藻灶澡赠遭则蚤凿燥皂葬皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽, 悦阅员猿猿葬灶凿澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕 酝糟粤遭 悦阅员猿猿 酝糟粤遭 杂贼葬蚤灶蚤灶贼藻灶泽蚤贼赠 孕燥泽蚤贼蚤增藻则葬贼藻 ( 豫 ) 杂贼葬蚤灶蚤灶贼藻灶泽蚤贼赠 孕燥泽蚤贼蚤增藻则葬贼藻 ( 豫 ) 猿匀怨 员 垣 圆 猿郧苑 远 源 员缘匀苑 苑 垣 猿 员园云远 怨 垣 缘 员员粤苑 愿 垣 圆 员缘阅圆 员源 垣 猿 圆援猿援圆摇 杂交瘤单抗识别成球细胞中的肝癌干细胞 摇 已有研究证明, 干细胞能够在无血清培养基中成

5 孙力超, 等援抗肝癌干细胞功能性单克隆抗体的研制 员圆缘 [ 员猿鄄员源球生长, 是肿瘤干细胞的标志之一 ] 流式分选出的澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕经无血清培养基培养后, 免疫荧光检测发现, 远株杂交瘤单抗识别的细胞比例增加 ( 表猿 ), 进一步提示这些单抗能够特异识别肝癌干细胞 表猿摇 免疫荧光检测杂交瘤单抗与成球培养后澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕的结合 栽葬遭援猿摇陨皂皂怎灶燥枣造怎燥则藻泽糟藻灶糟藻泽贼葬蚤灶蚤灶早蚤灶凿藻贼藻糟贼蚤燥灶燥枣蚤灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶遭藻贼憎藻藻灶澡赠遭则蚤凿燥皂葬皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽葬灶凿澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕葬枣贼藻则泽责澡藻则藻糟怎造贼怎则藻 酝糟粤遭杂贼葬蚤灶蚤灶早蚤灶贼藻灶泽蚤贼赠孕燥泽蚤贼蚤增藻则葬贼藻 ( 豫 ) 猿匀怨 垣 猿 猿郧苑 员远 员缘匀苑 员圆 员园云远 员园 员员粤苑 员圆 员缘阅圆 圆远 圆援猿援源摇杂交瘤员缘阅圆单抗阳性澡蕴悦杂蕴悦泽的裸鼠成瘤实验摇已有的研究表明肿瘤干细胞的特征之一是 [ 员缘鄄员远具有极高的致瘤性 ] 为了进一步证明筛选出的杂交瘤单抗可特异识别肝癌干细胞, 从远株杂交瘤单抗中随机选取一株识别澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕以及无血清悬浮成球培养后细胞的杂交瘤单抗员缘阅圆 经过流式分选出杂交瘤单抗员缘阅圆识别的澡蕴悦杂蕴悦泽, 接种裸鼠, 检测其致瘤能力 结果如表源所示, 接种 源员伊员园个员缘阅圆阳性的澡蕴悦杂蕴悦泽的裸鼠圆个月开始成瘤, 猿个月的成瘤率为员园园豫 ; 而员缘阅圆阴性澡蕴悦杂鄄远蕴悦泽至少需接种员伊员园个细胞圆个月后方可成瘤 员缘阅圆阳性澡蕴悦杂蕴悦泽的致瘤能力远强于员缘阅圆阴性 澡蕴悦杂蕴悦泽, 说明杂交瘤单抗员缘阅圆能够特异识别肝癌干细胞 圆援源摇 抗肝癌干细胞样细胞杂交瘤单抗的类型 采用杂燥怎贼澡藻则灶月蚤燥贼藻糟澡公司生产的单抗类型检测试剂盒, 对远株杂交瘤单抗进行类型检测 结果显示, 远株杂交瘤单抗均是陨早酝类抗体, 没有发现复合类型的克隆 ( 表缘 ) 圆援缘摇 杂交瘤单抗对澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕增殖的影响 采用悦悦运鄄愿法检测远株杂交瘤单抗对澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕增殖的影响, 结果显示, 远株杂交瘤单抗均能抑制澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕的增殖, 其抑制率为园援远豫耀耀耀耀耀耀耀耀源圆豫 ( 图 圆 ), 提示该远株杂交瘤单抗均是具有抑制肝癌干细胞增殖的功能性单抗 表源摇 杂交瘤员缘阅圆单抗阳性澡蕴悦杂蕴悦泽的裸鼠成瘤能力 栽葬遭援源摇 澡蕴悦杂蕴悦泽 垣员缘阅圆 原员缘阅圆 栽葬遭援缘摇 栽怎皂燥则蚤早藻灶蚤糟糟葬责葬糟蚤贼赠燥枣员缘阅圆鄄责燥泽蚤贼蚤增藻澡蕴悦杂蕴悦泽蚤灶灶怎凿藻皂蚤糟藻 晕怎皂遭藻则 栽怎皂燥则蚤早藻灶蚤糟糟葬责葬遭蚤造蚤贼赠 员皂燥灶贼澡圆皂燥灶贼澡泽猿皂燥灶贼澡泽 缘伊员园猿园辕远园辕远园辕远 员伊员园源园辕远猿辕远远辕远 员伊员园缘园辕远远辕远远辕远 员伊员园源园辕远园辕远园辕远 缘伊员园缘园辕远园辕远园辕远 员伊员园远园辕远源辕远远辕远 表缘摇远株单克隆抗体的类型 杂怎遭贼赠责藻泽燥枣远皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽 酝糟粤遭匀藻葬增赠糟澡葬蚤灶蕴蚤早澡贼糟澡葬蚤灶 员缘阅圆陨早酝原 猿匀怨陨早酝原 员缘匀苑陨早酝原 员园云远陨早酝原 猿郧苑陨早酝原 员员粤苑陨早酝原 图圆摇 悦悦运鄄愿法检测杂交瘤单抗对澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕 增殖的抑制率 云蚤早援圆摇陨灶澡蚤遭蚤贼燥则赠则葬贼藻泽燥枣皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽燥灶责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤燥灶燥枣澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕葬泽凿藻贼藻糟贼藻凿遭赠悦悦运鄄愿葬泽泽葬赠援 圆援远摇杂交瘤单抗抑制澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕的成球能力 采用干细胞成球培养法, 将澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕接种于

6 员圆远 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员园年源月, 员苑 ( 圆 ) 无血清培养基中进行成球培养, 并加入远株杂交瘤培养上清或杂孕圆辕园培养上清, 检测杂交瘤单抗对 澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕成球能力的作用 结果发现, 远耀耀耀耀耀耀耀耀愿凿时, 加入杂交瘤上清的澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕形成的细胞球较小 数目较少 ; 而加入杂孕圆辕园培养上清的细胞可见到由数十个到数百个细胞组成的较大的圆形细胞球体 远株杂交瘤单抗对澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕在无血清悬浮培养所形成细胞球的抑制率为猿豫耀耀耀耀耀耀耀耀缘园豫 ( 图猿 ), 提示筛选出的远株杂交瘤单抗是能够抑制肝癌干细胞自我更新的功能性单抗 图猿摇远株杂交瘤单抗抑制澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕的成球能力 云蚤早援猿摇陨灶澡蚤遭蚤贼燥则赠藻枣枣藻糟贼泽燥枣远皂燥灶燥糟造燥灶葬造葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽燥灶泽责澡藻则藻枣燥则皂葬贼蚤燥灶葬遭蚤造蚤贼赠燥枣澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕 猿摇讨摇论 肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一, 病死率高, 全世界每年约有员圆缘万人死于肝癌 复发和转 [ 员苑移是影响肝癌预后的最主要因素 ] 已有的研 [ 员愿鄄员怨 ] 究报道, 肿瘤干细胞是肿瘤复发 转移的主要原因, 而现有的治疗手段主要是通过不同方式抑制或杀灭肿瘤组织内的癌细胞, 对肿瘤干细胞无能为力, 从而导致肿瘤复发 转移以及临床治疗的失败 目前分子靶向治疗是肿瘤治疗领域的一个重大突 [ 圆园鄄圆员破, 如曲妥珠单抗 ] [ 圆圆 利妥昔单抗 ] 伊马替 [ 圆猿 ] 尼等分子靶向药物在肿瘤治疗中获得了良好的临床治疗效果 如果能获得特异性靶向肝癌干细胞的功能性单抗及分子靶标, 建立以肿瘤干细胞为靶的分子靶向治疗新方案, 必将显著降低和减少肝癌的复发 转移, 改善患者的预后, 提高缘年生存率 [ 圆源本室前期在研究肺癌 ] [ 圆缘 胃癌 ] [ 圆远 ] 食管癌分子靶标的过程中建立了大容量功能性单抗库技术平台 为了建立大容量的抗肝癌干细胞样细胞的功能性单抗库, 本研究从肝癌组织中分离 鉴定了含有肝 [ 员园癌干细胞的澡蕴悦杂蕴悦 ], 并免疫月粤蕴月辕糟裸鼠 固定细胞免疫荧光检测显示, 免疫小鼠血清在高滴度时 ( 员颐源园园园 ) 仍能够与澡蕴悦杂蕴悦泽鄄杂孕呈阳性反应, 其 阳性细胞比例约为愿豫, 提示用该免疫小鼠脾细胞融合制备的大容量杂交瘤单抗库中含有识别肝癌干细胞的单抗 将免疫小鼠脾细胞与杂孕圆辕园骨髓瘤细胞融合后接种圆园园个铺有甲基纤维素培养基的培养皿, 培养后从中挑取了源圆员远个单克隆细胞, 再接种 怨远孔板, 最终获得了圆怨远源个克隆生长的单抗库 采用高通量固定细胞免疫荧光法筛选该单抗库, 获得了圆猿苑个能识别澡蕴悦杂蕴悦泽的阳性单抗克隆株 ; 进一步用活细胞免疫荧光法筛选, 其中员员远株单抗能与澡蕴悦杂蕴悦泽的细胞膜结合 为了鉴定并获得能与肝癌干细胞结合的单抗, 采用流式术分选出澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕和非澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕 进一步用免疫荧光法检测上述员员远株杂交瘤上清, 结果显示, 其中猿猿株只与澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕呈阳性反应, 而不与非澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕反应 ; 并能识别更高比例的无血清培养基培养后的成球细胞, 其阳性比例为猿豫耀耀耀耀耀耀耀耀 圆远豫, 明显高于杂孕阳性细胞反应的比例 ( 员豫耀耀耀耀耀耀耀耀 员圆豫 ) 双色免疫荧光法检测发现, 其中远株杂交瘤上清能与肝癌干细胞标志物悦阅员猿猿有不同比例的共染 小鼠皮下成瘤实验表明, 抗肝癌干细胞单源抗阳性澡蕴悦杂蕴悦泽具有高致瘤性, 员伊员园个单抗阳性的澡蕴悦杂蕴悦泽接种后, 圆耀耀耀耀耀耀耀耀猿个月所有裸鼠均能成瘤 这些结果表明, 本研究至少获得了远株抗肝癌干细胞的杂交瘤单抗 增殖实验及成球实验结果显示, 远 株单抗中有源株杂交瘤单抗能显著抑制澡蕴悦杂蕴悦鄄杂孕 的生长 增殖和成球生长, 表明这源株杂交瘤单抗是具有功能的抗肝癌干细胞单抗 目前国 内外尚未见到针对肝癌干细胞的特异性功能性单抗的报道 本研究筛选 鉴定抗肝癌干细胞的功能性单抗采用了本室前期建立的大容量功能性单抗库技术平台 该技术已成功用于筛选 鉴定肺癌 胃癌 食管癌细胞的功能性单抗, 证明能获得高比例 ( 占库容的缘豫耀耀耀耀耀耀耀耀员园豫 ) 的功能性单抗 但本研究获得的抗肝癌干细胞的功能性单抗的比例相当低, 仅占库容的园援员豫耀耀耀耀耀耀耀耀园援圆豫 因此, 要获得抗肝癌干细胞单抗必须制备足够大的抗体库, 此外还需建立快速 高通量的筛选技术 目前本研究所还在进一步优化这一技术平台, 希望能提高获得功能性抗肿瘤干细胞单抗的比例 在此基础上, 本课题组正在进行这些单抗的其他功能性研究, 包括体内抑制肝癌生长 转移的研究, 以及与肝癌发生 发展 分期 转移 复发 耐药及预后的相关性研究, 最终希望为靶向肿瘤干细胞治疗肝癌及其复发 转移提供靶向候选药物 在功能性单抗体内外鉴定的基础上, 本课题组还将分离获

7 孙力超, 等援抗肝癌干细胞功能性单克隆抗体的研制 员圆苑 得相应的功能性分子靶标, 从而为筛选靶向肝癌干细胞的其他药物奠定基础 [ 参考文献 ] [ 员 ] 摇再葬灶早蕴, 孕葬则噪蚤灶阅酝, 蕴蚤蕴, 悦澡藻灶再援栽蚤皂藻贼则藻灶凿泽蚤灶糟葬灶糟藻则皂燥则贼葬造鄄蚤贼赠蚤灶悦澡蚤灶葬 : 员怨愿苑鄄员怨怨怨 [ 允 ] 援陨灶贼允悦葬灶糟藻则, 圆园园猿, 员园远 ( 缘 ): 苑苑员鄄苑愿猿援 [ 圆 ] 摇在澡葬燥孕, 阅葬蚤酝, 悦澡藻灶宰, 蕴蚤晕援悦葬灶糟藻则贼则藻灶凿泽蚤灶悦澡蚤灶葬 [ 允 ] 援允责灶允悦造蚤灶韵灶糟燥造, 圆园员园 [ 耘责怎遭葬澡藻葬凿燥枣责则蚤灶贼 ] 援 [ 猿 ] 摇蕴葬怎宰再, 耘悦蕴葬蚤援匀藻责葬贼燥糟藻造造怎造葬则糟葬则糟蚤灶燥皂葬 : 糟怎则则藻灶贼皂葬灶葬早藻皂藻灶贼葬灶凿则藻糟藻灶贼葬凿增葬灶糟藻泽 [ 允 ] 援匀藻责葬贼燥遭蚤造蚤葬则赠孕葬灶糟则藻葬贼阅蚤泽陨灶贼, 圆园园愿, 苑 ( 猿 ): 圆猿苑鄄圆缘苑援 [ 源 ] 摇匀葬造造允酝, 月葬则澡燥燥增藻则酝粤, 运葬扎皂蚤灶阅, 酝糟阅燥灶灶藻造造阅孕, 郧则藻藻灶造藻藻宰云, 栽澡燥皂葬泽砸杂援粤糟贼蚤增葬贼蚤燥灶燥枣贼澡藻葬则赠造鄄澡赠凿则燥糟葬则遭燥灶则藻糟藻责贼燥则蚤灶鄄澡蚤遭蚤贼泽蚤灶增葬泽蚤增藻葬灶凿皂藻贼葬泽贼葬贼蚤糟枣藻葬贼怎则藻泽燥枣澡怎皂葬灶遭则藻葬泽贼糟葬灶糟藻则糟藻造造泽葬灶凿责则燥皂燥贼藻泽遭则藻葬泽贼糟葬灶糟藻则糟藻造造凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬贼蚤燥灶 [ 允 ] 援酝燥造耘灶凿燥糟则蚤鄄灶燥造, 圆园员园, 圆源 ( 圆 ): 猿缘怨鄄猿远怨援 [ 缘 ] 摇杂怎造造蚤增葬灶允, 酝蚤灶灶葬允, 杂澡葬赠允援耘增蚤凿藻灶糟藻枣燥则泽藻造枣鄄则藻灶藻憎蚤灶早造怎灶早糟葬灶糟藻则泽贼藻皂糟藻造造泽葬灶凿贼澡藻蚤则蚤皂责造蚤糟葬贼蚤燥灶泽蚤灶贼怎皂燥则蚤灶蚤贼蚤葬贼蚤燥灶, 责则燥鄄早则藻泽泽蚤燥灶, 葬灶凿贼葬则早藻贼藻凿贼澡藻则葬责赠 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则酝藻贼葬泽贼葬泽蚤泽砸藻增, 圆园员园, 圆怨 ( 员 ): 远员鄄苑圆援 [ 远 ] 摇运怎澡灶晕在, 栽怎葬灶砸杂援砸藻早怎造葬贼蚤燥灶燥枣泽贼藻皂灶藻泽泽葬灶凿泽贼藻皂糟藻造造灶蚤糟澡藻燥枣皂藻泽藻灶糟澡赠皂葬造泽贼藻皂糟藻造造泽 : 蚤皂责造蚤糟葬贼蚤燥灶泽蚤灶贼怎皂燥则早藻灶藻泽蚤泽葬灶凿皂藻贼葬泽鄄贼葬泽蚤泽 [ 允 ] 援允悦藻造造孕澡赠泽蚤燥造, 圆园员园, 圆圆圆 ( 圆 ): 圆远愿鄄圆苑苑援 [ 苑 ] 摇耘葬贼燥灶悦蕴, 悦燥造燥皂遭藻造酝, 增葬灶凿藻则孕造怎蚤躁皂郧, 悦藻糟糟澡蚤灶蚤酝, 宰藻贼贼藻则鄄憎葬造凿粤, 蕴蚤责责蚤贼贼允, 藻贼葬造援耘增葬造怎葬贼蚤燥灶燥枣贼澡藻枣则藻择怎藻灶糟赠燥枣责怎贼葬贼蚤增藻责则燥泽贼葬贼藻糟葬灶糟藻则泽贼藻皂糟藻造造泽蚤灶责则蚤皂葬则赠葬灶凿皂藻贼葬泽贼葬贼蚤糟责则燥泽贼葬贼藻糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援孕则燥泽贼葬贼藻, 圆园员园 [ 耘责怎遭葬澡藻葬凿燥枣责则蚤灶贼 ] 援 [ 愿 ] 摇郧蚤灶藻泽贼蚤藻则悦, 蕴蚤怎杂, 阅蚤藻遭藻造酝耘, 运燥则噪葬赠葬匀, 蕴怎燥酝, 月则燥憎灶酝, 藻贼葬造援悦载悦砸员遭造燥糟噪葬凿藻泽藻造藻糟贼蚤增藻造赠贼葬则早藻贼泽澡怎皂葬灶遭则藻葬泽贼糟葬灶糟藻则泽贼藻皂糟藻造造泽蚤灶增蚤贼则燥葬灶凿蚤灶曾藻灶燥早则葬枣贼泽 [ 允 ] 援允悦造蚤灶陨灶增藻泽贼, 圆园员园, 员圆园 ( 圆 ): 源愿缘鄄源怨苑援 [ 怨 ] 摇杂葬造灶蚤噪燥增粤灾, 郧则燥贼澡粤, 粤责藻造粤, 运葬造造蚤枣葬贼蚤凿蚤泽郧, 月藻糟噪藻则皂葬灶灶月酝, 运澡葬皂蚤凿躁葬灶燥增粤, 藻贼葬造援栽葬则早藻贼蚤灶早燥枣糟葬灶糟藻则泽贼藻皂糟藻造造皂葬则噪藻则耘责悦粤酝遭赠遭蚤泽责藻糟蚤枣蚤糟葬灶贼蚤遭燥凿赠耘责悦粤酝曾悦阅猿蚤灶澡蚤遭蚤贼泽责葬灶糟则藻葬贼蚤糟糟葬则糟蚤灶燥皂葬 [ 允 ] 援允悦藻造造酝燥造酝藻凿, 圆园园怨, 员猿 ( 怨月 ): 源园圆猿鄄源园猿猿援 [ 员园 ] 赵摇璇, 冉宇靓, 遇摇珑, 孙力超, 胡摇海, 李摇春, 等援人肝癌组织中肿瘤干细胞样细胞的分离培养及鉴定 [ 允 ] 援中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园园怨, 员远 ( 缘 ): 源猿远鄄源源员援 [ 员员 ] 酝葬杂, 悦澡葬灶运宰, 匀怎蕴, 蕴藻藻栽运, 宰燥允再, 晕早陨韵, 藻贼葬造援陨凿藻灶贼蚤枣蚤鄄糟葬贼蚤燥灶葬灶凿糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶燥枣贼怎皂燥则蚤早藻灶蚤糟造蚤增藻则糟葬灶糟藻则泽贼藻皂辕责则燥早藻灶鄄蚤贼燥则糟藻造造泽 [ 允 ] 援郧葬泽贼则燥藻灶贼藻则燥造燥早赠, 圆园园苑, 员猿圆 ( 苑 ): 圆缘源圆鄄圆缘缘远援 [ 员圆 ] 杂怎藻贼泽怎早怎粤, 晕葬早葬噪蚤酝, 粤燥噪蚤匀, 酝燥贼燥澡葬泽澡蚤栽, 运怎灶蚤泽葬凿葬栽, 酝燥则蚤鄄垣憎葬噪蚤匀援悦澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶燥枣悦阅员猿猿澡藻责葬贼燥糟藻造造怎造葬则糟葬则糟蚤灶燥皂葬糟藻造造泽葬泽糟葬灶糟藻则泽贼藻皂辕责则燥早藻灶蚤贼燥则糟藻造造泽 [ 允 ] 援月蚤燥糟澡藻皂月蚤燥责澡赠泽砸藻泽悦燥皂鄄皂怎灶, 圆园园远, 猿缘员 ( 源 ): 愿圆园鄄愿圆源援 [ 员猿 ] 杂蚤灶早澡杂运, 匀葬憎噪蚤灶泽悦, 悦造葬则噪藻陨阅, 杂择怎蚤则藻允粤, 月葬赠葬灶蚤允, 匀蚤凿藻栽, 藻贼葬造援陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶燥枣澡怎皂葬灶遭则葬蚤灶贼怎皂燥则蚤灶蚤贼蚤葬贼蚤灶早糟藻造造泽 [ 允 ] 援晕葬贼怎则藻, 圆园园源, 源猿圆 ( 苑园员缘 ): 猿怨远鄄源园员援 [ 员源 ] 陨泽澡蚤遭葬泽澡蚤杂, 杂葬噪葬早怎糟澡蚤酝, 运怎则燥蚤憎葬栽, 再葬皂葬泽葬噪蚤酝, 运葬灶藻皂怎则葬 再, 杂澡蚤扎怎噪燥陨栽, 藻贼葬造援匀怎皂葬灶灶藻怎则葬造泽贼藻皂辕责则燥早藻灶蚤贼燥则糟藻造造泽, 藻曾鄄责葬灶凿藻凿蚤灶造燥灶早鄄贼藻则皂灶藻怎则燥泽责澡藻则藻糟怎造贼怎则藻, 责则燥皂燥贼藻枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造则藻糟燥增鄄藻则赠葬枣贼藻则枣燥糟葬造蚤泽糟澡藻皂蚤葬蚤灶皂燥灶早燥造蚤葬灶早藻则遭蚤造泽 [ 允 ] 援允晕藻怎则燥泽糟蚤砸藻泽, 圆园园源, 苑愿 ( 圆 ): 圆员缘鄄圆圆猿援 [ 员缘 ] 韵忆月则蚤藻灶悦粤, 孕燥造造藻贼贼粤, 郧葬造造蚤灶早藻则杂, 阅蚤糟噪允耘援粤澡怎皂葬灶糟燥造燥灶糟葬灶糟藻则糟藻造造糟葬责葬遭造藻燥枣蚤灶蚤贼蚤葬贼蚤灶早贼怎皂燥则早则燥憎贼澡蚤灶蚤皂皂怎灶燥凿藻枣蚤糟蚤藻灶贼皂蚤糟藻 [ 允 ] 援晕葬贼怎则藻, 圆园园苑, 源源缘 ( 苑员圆猿 ): 员园远鄄员员园援 [ 员远 ] 栽蚤则蚤灶燥灾, 悦葬皂藻则造蚤灶早燥砸, 云则葬灶糟燥砸, 酝葬造葬灶早葬阅, 蕴葬砸燥糟糟葬粤, 灾蚤早造蚤藻贼贼燥郧, 藻贼葬造援栽澡藻则燥造藻燥枣悦阅员猿猿蚤灶贼澡藻蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶葬灶凿糟澡葬则葬糟贼藻则蚤泽葬贼蚤燥灶燥枣贼怎皂燥怎则鄄蚤灶蚤贼蚤葬贼蚤灶早糟藻造造泽蚤灶灶燥灶鄄泽皂葬造造鄄糟藻造造造怎灶早糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援耘怎则允悦葬则凿蚤燥贼澡燥则葬糟杂怎则早, 圆园园怨, 猿远 ( 猿 ): 源源远鄄源缘猿援 [ 员苑 ] 再葬皂葬泽澡蚤噪蚤晕, 杂怎早葬憎葬则葬再, 栽葬皂怎则葬杂, 栽葬贼藻蚤泽澡蚤砸, 再燥泽澡蚤凿葬匀, 运葬灶藻噪燥允, 藻贼葬造援孕燥泽贼燥责藻则葬贼蚤增藻泽怎则增藻蚤造造葬灶糟藻憎蚤贼澡皂燥灶贼澡造赠泽藻则怎皂贼怎皂燥则皂葬则噪藻则泽葬枣贼藻则造蚤增蚤灶早鄄凿燥灶燥则造蚤增藻则贼则葬灶泽责造葬灶贼葬贼蚤燥灶枣燥则澡藻责葬贼燥糟藻造鄄造怎造葬则糟葬则糟蚤灶燥皂葬 [ 允 ] 援匀藻责葬贼燥造砸藻泽, 圆园员园 [ 耘责怎遭葬澡藻葬凿燥枣责则蚤灶贼 ] 援 [ 员愿 ] 蕴藻藻栽运, 悦葬泽贼蚤造澡燥粤, 酝葬杂, 晕早陨韵援蕴蚤增藻则糟葬灶糟藻则泽贼藻皂糟藻造造泽 : 蚤皂责造蚤鄄糟葬贼蚤燥灶泽枣燥则葬灶藻憎贼澡藻则葬责藻怎贼蚤糟贼葬则早藻贼 [ 允 ] 援蕴蚤增藻则陨灶贼, 圆园园怨, 圆怨 ( 苑 ): 怨缘缘鄄怨远缘援 [ 员怨 ] 悦澡葬灶凿葬阅, 陨泽葬赠藻增葬栽, 运怎皂葬则杂, 匀藻灶泽藻造允粤, 杂葬憎葬灶贼粤, 砸葬鄄皂葬泽憎葬皂赠郧, 藻贼葬造援栽澡藻则葬责藻怎贼蚤糟责燥贼藻灶贼蚤葬造燥枣葬凿怎造贼遭燥灶藻皂葬则则燥憎鄄凿藻则蚤增藻凿皂藻泽藻灶糟澡赠皂葬造泽贼藻皂糟藻造造泽蚤灶责则燥泽贼葬贼藻糟葬灶糟藻则遭燥灶藻皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽 [ 允 ] 援悦造蚤灶悦葬灶糟藻则砸藻泽, 圆园园怨, 员缘 ( 圆猿 ): 苑员苑缘鄄苑员愿缘援 [ 圆园 ] 月则葬增燥酝葬则择怎藻泽允酝援栽则藻葬贼皂藻灶贼燥枣遭则葬蚤灶皂藻贼葬泽贼葬泽藻泽蚤灶责葬贼蚤藻灶贼泽憎蚤贼澡垣匀耘砸圆遭则藻葬泽贼糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援粤凿增栽澡藻则, 圆园园怨, 圆远 ( 杂怎责责造员 ): 杂员愿鄄杂圆远援 [ 圆员 ] 栽燥蚤酝, 陨憎葬贼葬匀, 云怎躁蚤憎葬则葬再, 陨贼燥再, 晕葬噪葬皂怎则葬杂, 栽燥噪怎凿葬再, 藻贼葬造援蕴葬责葬贼蚤灶蚤遭皂燥灶燥贼澡藻则葬责赠蚤灶责葬贼蚤藻灶贼泽憎蚤贼澡则藻造葬责泽藻凿, 葬凿增葬灶糟藻凿, 燥则皂藻贼葬泽贼葬贼蚤糟遭则藻葬泽贼糟葬灶糟藻则 : 藻枣枣蚤糟葬糟赠, 泽葬枣藻贼赠, 葬灶凿遭蚤燥皂葬则噪藻则则藻泽怎造贼泽枣则燥皂允葬责葬灶藻泽藻责葬贼蚤藻灶贼泽责澡葬泽藻 Ⅱ 泽贼怎凿蚤藻泽 [ 允 ] 援月则允悦葬灶糟藻则, 圆园园怨, 员园员 ( 员园 ): 员远苑远鄄员远愿圆援 [ 圆圆 ] 砸蚤葬扎宰, 匀藻则灶葬灶凿藻扎鄄陨造蚤扎葬造蚤贼怎则则蚤云允, 悦扎怎糟扎皂葬灶酝杂援杂贼则葬贼藻早蚤藻泽贼燥藻灶鄄澡葬灶糟藻则蚤贼怎曾蚤皂葬遭葬灶贼蚤鄄贼怎皂燥则葬糟贼蚤增蚤贼赠蚤灶贼澡藻贼则藻葬贼皂藻灶贼燥枣悦阅圆园鄄责燥泽蚤贼蚤增藻月鄄糟藻造造灶藻燥责造葬泽皂泽 [ 允 ] 援陨皂皂怎灶燥造砸藻泽, 源远 ( 员辕圆辕猿 ): 员怨圆鄄圆园缘援 [ 圆猿 ] 在燥怎遭蚤则酝, 栽怎则泽扎栽, 酝藻灶葬则凿悦, 在蚤贼增燥早藻造蕴, 悦澡葬责怎贼晕援陨皂葬贼蚤灶蚤遭皂藻泽赠造葬贼藻 ( 郧造藻藻增藻糟 ( 糟 )): 贼葬则早藻贼藻凿贼澡藻则葬责赠葬早葬蚤灶泽贼糟葬灶糟藻则憎蚤贼澡蚤皂鄄皂怎灶藻责则燥责藻则贼蚤藻泽 [ 允 ] 援耘灶凿燥糟则酝藻贼葬遭陨皂皂怎灶藻阅蚤泽燥则凿阅则怎早栽葬则早藻贼泽, 圆园园怨 [ 耘责怎遭葬澡藻葬凿燥枣责则蚤灶贼 ] 援 [ 圆源 ] 胡摇海, 冉宇靓, 陈立钊, 遇摇珑, 孙立新, 杨治华援采用抗体库技术筛选抑制肺癌的功能性抗体 [ 允 ] 援肿瘤防治研究, 圆园园苑, 猿源 ( 远 ): 猿怨缘鄄猿怨愿援 [ 圆缘 ] 赵西路, 陈立钊, 冉宇靓, 胡摇海, 孙立新, 遇摇珑, 等援抑制胃癌增殖功能性单抗的制备 筛选及鉴定 [ 允 ] 援中国卫生检验杂志, 圆园园愿, 员愿 ( 远 ): 员园员猿鄄员园员缘援 [ 圆远 ] 遇摇珑, 潘摇健, 周摇转, 冉宇靓, 胡摇海, 娄晋宁, 等援抑制食管癌与肺血管内皮黏附的功能性抗体的制备 [ 允 ] 援中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园园远, 员猿 ( 缘 ): 猿猿圆鄄猿猿苑援 [ 收稿日期 ] 摇圆园员园原园圆原圆缘 [ 修回日期 ] 摇圆园员园原园猿原员愿 [ 本文编辑 ] 摇徐红梅