员圆苑员 摇摇人巨细胞病毒 ( 澡怎皂葬灶糟赠贼燥皂藻早葬造燥增蚤则怎泽, 匀悦酝灾 ) 属于 β 疱疹病毒, 在人群中感染率高, 在发达国家有缘园豫的感染率, 而在多数发展中国家感染率则高达 [ 员员园园豫 ] 在美国, 每年有圆耀耀耀耀耀耀耀耀猿万名婴儿感染匀悦酝灾, 而在印度等发展中国家, 则

Transcription

1 员圆苑园 中国病理生理杂志摇悦澡蚤灶藻泽藻允燥怎则灶葬造燥枣孕葬贼澡燥责澡赠泽蚤燥造燥早赠摇圆园员愿, 猿源 ( 苑 ): 员圆苑园鄄员圆苑远杂志网址 : 澡贼贼责 : 辕辕憎憎憎援糟躁责责援灶藻贼 [ 文章编号 ] 摇员园园园鄄源苑员愿 ( 圆园员愿 ) 园苑鄄员圆苑园鄄园苑 干扰素诱导蛋白晕皂蚤与人巨细胞病毒皮层蛋白 哉蕴圆猿相互作用区域的研究 叶倩宸, 摇陈业伟, 摇傅政民, 摇李晓钿, 摇冯琳远, 摇杨晓苹, 摇冉艳红, 摇李弘剑 ( 暨南大学生命科学技术学院, 广东广州缘员园远猿圆 ) 摇摇 [ 摘摇要 ] 摇目的 : 探究干扰素诱导蛋白晕鄄酝赠糟相互作用因子 ( 晕皂蚤 ) 与人巨细胞病毒 ( 匀悦酝灾 ) 皮层蛋白哉蕴圆猿相互作用的关键区域 方法 : 根据前期实验结果, 分别将员园个不同截短突变型的晕皂蚤构建到原核表达载体责郧耘载鄄源栽鄄员上, 转化到大肠杆菌砸燥泽藻贼贼葬 ( 阅耘猿 ) 感受态细胞中, 表达并纯化出带有郧杂栽标签的融合蛋白, 利用郧杂栽鄄责怎造造凿燥憎灶的方法探究晕皂蚤与哉蕴圆猿相互作用的区域 根据郧杂栽鄄孕怎造造凿燥憎灶实验结果, 用同源重组的方法在真核表达载体责糟阅鄄晕粤源鄄酝赠糟上分别构建猿个缺失突变型晕皂蚤 将实验组和对照组的晕皂蚤分别与含有云造葬早标签的哉蕴圆猿质粒共转染至匀藻蕴葬细胞中, 通过免疫共沉淀法进一步研究晕皂蚤与哉蕴圆猿的相互作用区域 结果 :( 员 ) 员园个截短突变型晕皂蚤与郧杂栽基因融合的原核表达载体构建成功 ;( 圆 ) 猿个缺失突变型晕皂蚤与酝赠糟基因融合的真核表达载体构建成功 ;( 猿 ) 郧杂栽鄄责怎造造凿燥憎灶实验证明晕皂蚤与哉蕴圆猿相互作用位点位于晕皂蚤上的第员怨圆耀耀耀耀耀耀耀耀圆园圆位氨基酸区域 ;( 源 ) 免疫共沉淀法确认晕皂蚤的第员怨圆耀耀耀耀耀耀耀耀圆园圆位氨基酸区域是与哉蕴圆猿相互作用的区域, 与郧杂栽鄄责怎造造凿燥憎灶实验结果一致 结论 : 晕皂蚤与哉蕴圆猿相互作用的区域位于晕皂蚤上第员怨圆耀耀耀耀耀耀耀耀圆园圆位氨基酸区域 这为阐明哉蕴圆猿帮助匀悦酝灾在宿主体内潜伏的分子机理提供了基础 摇摇 [ 关键词 ] 摇人巨细胞病毒 ; 晕鄄酝赠糟相互作用因子 ; 郧杂栽鄄责怎造造凿燥憎灶实验 ; 免疫共沉淀摇摇 [ 中图分类号 ] 摇砸缘员员 ; 砸猿远猿摇摇摇摇 [ 文献标志码 ] 摇粤凿燥蚤 : 员园援猿怨远怨辕躁援蚤泽泽灶援员园园园鄄源苑员愿援圆园员愿援园苑援园员怨 运藻赠葬皂蚤灶燥葬糟蚤凿泽燥枣蚤灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽遭藻贼憎藻藻灶蚤灶贼藻则枣藻则燥灶鄄蚤灶凿怎糟藻凿责则燥贼藻蚤灶晕鄄酝赠糟蚤灶贼藻则葬糟贼燥则葬灶凿澡怎皂葬灶糟赠贼燥皂藻早葬造燥增蚤则怎泽贼藻早怎皂藻灶贼责则燥贼藻蚤灶哉蕴圆猿再耘匝蚤葬灶鄄糟澡藻灶, 悦匀耘晕再藻鄄憎藻蚤, 悦澡蚤灶早皂葬灶云韵韵, 蕴陨载蚤葬燥鄄贼蚤葬灶, 云耘晕郧蕴蚤灶鄄赠怎葬灶, 再粤晕郧载蚤葬燥鄄责蚤灶早, 砸粤晕再葬灶鄄澡燥灶早, 蕴陨匀燥灶早鄄躁蚤葬灶 ( 悦燥造造藻早藻燥枣蕴蚤枣藻杂糟蚤藻灶糟藻葬灶凿栽藻糟澡灶燥造燥早赠, 允蚤灶葬灶哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠, 郧怎葬灶早扎澡燥怎缘员园远猿圆, 悦澡蚤灶葬援耘鄄皂葬蚤造 : 贼造蚤澡躁岳躁灶怎援藻凿怎援糟灶 ) 摇摇 [ 粤月杂栽砸粤悦栽 ] 摇粤陨酝 : 栽燥蚤灶增藻泽贼蚤早葬贼藻贼澡藻噪藻赠葬皂蚤灶燥葬糟蚤凿泽燥枣蚤灶贼藻则枣藻则燥灶鄄蚤灶凿怎糟藻凿责则燥贼藻蚤灶晕鄄酝赠糟蚤灶贼藻则葬糟贼燥则 ( 晕皂蚤 ) 贼澡葬贼蚤灶贼藻则葬糟贼泽憎蚤贼澡澡怎皂葬灶糟赠贼燥皂藻早葬造燥增蚤则怎泽 ( 匀悦酝灾 ) 贼藻早怎皂藻灶贼责则燥贼藻蚤灶哉蕴圆猿援酝耘栽匀韵阅杂 : 粤糟糟燥则凿蚤灶早贼燥贼澡藻责则藻增蚤燥怎泽则藻鄄泽怎造贼泽, 员园早则燥怎责泽燥枣贼澡藻贼则怎灶糟葬贼藻凿晕皂蚤枣则葬早皂藻灶贼憎藻则藻糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿燥灶责造葬泽皂蚤凿责郧耘载鄄源栽鄄员援砸藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼责造葬泽皂蚤凿泽憎藻则藻贼则葬灶泽鄄枣燥则皂藻凿蚤灶贼燥耘援糟燥造蚤砸燥泽藻贼贼葬 ( 阅耘猿 ) 糟燥皂责藻贼藻灶贼糟藻造造泽, 葬灶凿枣怎泽蚤燥灶责则燥贼藻蚤灶泽憎蚤贼澡郧杂栽贼葬早憎藻则藻藻曾责则藻泽泽藻凿葬灶凿责怎则蚤枣蚤藻凿援栽澡藻凿燥鄄皂葬蚤灶泽燥灶晕皂蚤贼澡葬贼皂藻凿蚤葬贼藻凿贼澡藻蚤灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶憎蚤贼澡哉蕴圆猿憎藻则藻蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿遭赠郧杂栽鄄责怎造造凿燥憎灶贼藻泽贼援月葬泽藻凿燥灶贼澡藻则藻泽怎造贼泽燥枣郧杂栽鄄责怎造造凿燥憎灶贼藻泽贼, 猿早则燥怎责泽燥枣凿藻造藻贼藻凿晕皂蚤枣则葬早皂藻灶贼泽憎藻则藻蚤灶泽藻则贼藻凿蚤灶贼燥贼澡藻藻怎噪葬则赠燥贼蚤糟藻曾责则藻泽泽蚤燥灶责造葬泽皂蚤凿责糟阅晕粤源鄄酝赠糟遭赠澡燥鄄皂燥造燥早燥怎泽则藻糟燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶援栽澡藻责造葬泽皂蚤凿憎蚤贼澡云造葬早鄄贼葬早早藻凿哉蕴圆猿责造葬泽皂蚤凿葬灶凿憎蚤造凿鄄贼赠责藻晕皂蚤燥则凿藻造藻贼蚤燥灶皂怎贼葬灶贼泽憎藻则藻糟燥鄄贼则葬灶泽鄄枣藻糟贼藻凿蚤灶贼燥匀藻蕴葬糟藻造造泽贼燥则藻糟燥灶枣蚤则皂贼澡藻噪藻赠葬皂蚤灶燥葬糟蚤凿泽燥灶晕皂蚤贼澡葬贼蚤灶贼藻则葬糟贼藻凿憎蚤贼澡哉蕴圆猿遭赠贼澡藻皂藻贼澡燥凿燥枣糟燥鄄蚤皂皂怎灶燥责则藻鄄糟蚤责蚤贼葬贼蚤燥灶 ( 悦燥鄄陨孕 ) 援砸耘杂哉蕴栽杂 : 栽澡藻责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟藻曾责则藻泽泽蚤燥灶增藻糟贼燥则泽燥枣员园早则燥怎责泽燥枣贼则怎灶糟葬贼藻凿晕皂蚤皂怎贼葬灶贼泽枣怎泽藻凿憎蚤贼澡郧杂栽 早藻灶藻憎藻则藻泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿援栽澡则藻藻早则燥怎责泽藻怎噪葬则赠燥贼蚤糟藻曾责则藻泽泽蚤燥灶增藻糟贼燥则泽燥枣晕皂蚤凿藻造藻贼蚤燥灶皂怎贼葬灶贼泽枣怎泽藻凿憎蚤贼澡酝赠糟早藻灶藻憎藻则藻葬造泽燥泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿援栽澡藻则藻泽怎造贼泽燥枣郧杂栽鄄责怎造造凿燥憎灶贼藻泽贼蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿贼澡葬贼贼澡藻则藻早蚤燥灶燥枣员怨圆耀耀耀耀耀耀耀耀圆园圆葬葬造燥糟葬贼藻凿燥灶晕皂蚤憎葬泽葬噪藻赠葬则藻葬贼燥蚤灶贼藻则葬糟贼憎蚤贼澡哉蕴圆猿援栽澡藻哉蕴圆猿遭蚤灶凿蚤灶早凿燥皂葬蚤灶燥枣晕皂蚤蚤灶贼澡藻葬皂蚤灶燥葬糟蚤凿泽员怨圆耀耀耀耀耀耀耀耀圆园圆葬葬憎葬泽糟燥灶枣蚤则皂藻凿遭赠悦燥鄄陨孕, 憎澡蚤糟澡憎葬泽糟燥灶泽蚤泽贼藻灶贼憎蚤贼澡贼澡藻郧杂栽鄄责怎造造凿燥憎灶则藻泽怎造贼泽援悦韵晕悦蕴哉杂陨韵晕 : 栽澡藻员怨圆耀耀耀耀耀耀耀耀圆园圆葬葬燥枣晕皂蚤葬则藻噪藻赠葬皂蚤灶燥葬糟蚤凿泽蚤灶贼澡藻蚤灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶憎蚤贼澡哉蕴圆猿援栽澡蚤泽皂葬赠责则燥增蚤凿藻贼澡藻遭葬泽蚤泽枣燥则糟造葬则蚤枣赠蚤灶早贼澡藻皂燥造藻糟怎造葬则皂藻糟澡葬灶蚤泽皂泽遭赠憎澡蚤糟澡哉蕴圆猿责造葬赠泽葬灶蚤皂责燥则贼葬灶贼则燥造藻蚤灶贼澡藻造葬贼藻灶糟赠燥枣匀悦酝灾蚤灶澡燥泽贼援摇摇 [ 运耘再宰韵砸阅杂 ] 摇匀怎皂葬灶糟赠贼燥皂藻早葬造燥增蚤则怎泽 ; 晕鄄酝赠糟蚤灶贼藻则葬糟贼燥则 ; 郧杂栽鄄责怎造造凿燥憎灶贼藻泽贼 ; 悦燥鄄蚤皂皂怎灶燥责则藻糟蚤责蚤贼葬贼蚤燥灶 摇 [ 收稿日期 ] 圆园员愿鄄园圆鄄员圆摇摇摇 [ 修回日期 ] 圆园员愿鄄园缘鄄猿园 [ 基金项目 ] 国家重大科技专项 ( 晕燥援圆园员苑在载员园员园猿园员员鄄园园苑 ; 晕燥援圆园员猿在载园怨员园猿园园猿鄄园员愿 ); 国家自然科学基金资助项目 ( 晕燥援猿员苑苑园员苑愿 ); 广东省自然科学基金资助项目 ( 晕燥援圆园员远粤园猿园猿员员园源愿 ) 通讯作者栽藻造 : 园圆园鄄愿缘圆圆远猿远园 ; 耘鄄皂葬蚤造 : 贼造蚤澡躁岳躁灶怎援藻凿怎援糟灶

2 员圆苑员 摇摇人巨细胞病毒 ( 澡怎皂葬灶糟赠贼燥皂藻早葬造燥增蚤则怎泽, 匀悦酝灾 ) 属于 β 疱疹病毒, 在人群中感染率高, 在发达国家有缘园豫的感染率, 而在多数发展中国家感染率则高达 [ 员员园园豫 ] 在美国, 每年有圆耀耀耀耀耀耀耀耀猿万名婴儿感染匀悦酝灾, 而在印度等发展中国家, 则超过圆缘万名 ; 受 [ 圆感染婴儿中有猿园豫呈匀悦酝灾先天性感染 ] 感染匀悦酝灾是发达国家胎儿先天性畸形最常见的原因, 也会导致胎儿神经发育迟缓, 胎儿或新生儿死亡, 肺炎 支气管发育不良 神经系统后遗症和感觉神经性 [ 猿耳聋等疾病 ] 匀悦酝灾通常呈隐性感染, 健康的人群感染后没有明显症状 免疫功能不全的个体或者当机体免疫力低下时, 匀悦酝灾感染会导致视网膜炎 脑炎 肝炎 黄疸 听力损害, 动脉粥样硬化等疾病的 [ 源发生甚至危及生命 ] 摇摇哉蕴圆猿是匀悦酝灾的皮层蛋白, 聚集在细胞质中的核周边区域, 其基因属于哉杂圆圆基因家族的一员 哉杂圆圆基因家族包括员圆个成员 : 哉蕴圆猿 哉蕴圆源 哉蕴圆愿 哉蕴圆怨 哉蕴猿远 哉蕴源猿 栽砸杂员 陨砸杂员 哉杂圆圆 哉杂圆猿 哉杂圆源和 [ 缘哉杂圆远, 这些基因广泛参与病毒的生长增殖过程 ] 目前对哉蕴圆猿的功能研究并不多, 前期发现哉蕴圆猿可以和胰岛素样生长因子结合蛋白源 ( 蚤灶泽怎造蚤灶鄄造蚤噪藻早则燥憎贼澡枣葬糟贼燥则遭蚤灶凿蚤灶早责则燥贼藻蚤灶源, 陨郧云月孕源 ) 以及粤栽孕酶抑制因子员 ( 粤栽孕葬泽藻蚤灶澡蚤遭蚤贼燥则赠枣葬糟贼燥则员, 粤栽陨云员 ) 相互 [ 远鄄苑作用 ] 课题组前期工作中, 以人巨细胞病毒蛋白哉蕴圆猿为诱饵蛋白, 通过酵母双杂交系统筛选出与其相互作用的干扰素诱导蛋白晕鄄酝赠糟相互作用因子 ( 晕鄄酝赠糟蚤灶贼藻则葬糟贼燥则, 晕皂蚤 ) [ 愿 ] 摇摇晕皂蚤是干扰素诱导蛋白, 被首次发现于员怨怨远年 晕皂蚤的结构可分悦燥蚤造藻凿鄄悦燥蚤造 晕陨阅员和晕陨阅圆猿个部 [ 怨分 ] 晕皂蚤与人干扰素诱导蛋白陨云孕猿缘同源, 并通过 [ 员园相互作用增强陨云孕猿缘的稳定性 ] 除此之外, 晕皂蚤还会与多种蛋白相互作用, 包括陨云晕信号通路中的核心蛋白信号转导及转录激活因子 ( 泽蚤早灶葬造贼则葬灶泽凿怎糟鄄藻则泽葬灶凿葬糟贼蚤增葬贼燥则泽燥枣贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶, 杂栽粤栽 ; 除杂栽粤栽圆外 ) 乳腺癌员号基因 组蛋白乙酰化转移酶栽蚤责远园 读码框移位蛋白 ( 葬造贼藻则灶葬贼蚤增藻则藻葬凿蚤灶早枣则葬皂藻责则燥贼藻蚤灶, 粤砸云 ) 性别决定区再框蛋白员园和酪蛋白激酶圆鄄相 [ 怨互作用蛋白员等 ] 课题组前期通过酵母双杂交实验表明哉蕴圆猿可以与干扰素诱导蛋白晕皂蚤相互作用, 且晕皂蚤与哉蕴圆猿相互作用的关键区域位于晕皂蚤的 [ 愿晕陨阅圆结构上 ] 在此基础上, 本文的研究进一步证实干扰素诱导蛋白晕皂蚤与人巨细胞病毒皮层蛋白哉蕴圆猿相互作用的现象, 探讨了晕皂蚤与哉蕴圆猿相互作用的区域 本文的实验结果为研究哉蕴圆猿的功能奠定了基础, 也为研究匀悦酝灾的潜伏感染机制提供了思路 材摇料摇和摇方摇法员摇实验材料摇摇宫颈癌细胞匀藻蕴葬 大肠杆菌阅匀缘 α 和大肠杆菌砸燥泽藻贼贼葬 ( 阅耘猿 ) 感受态细胞为本实验室保存 质粒责郧耘载鄄源栽鄄员 责郧耘载鄄源栽鄄员鄄晕皂蚤 责糟阅晕粤源鄄酝赠糟 责糟阅晕粤源鄄晕皂蚤鄄酝赠糟和责糟阅晕粤猿援员 ( 垣 ) 鄄哉蕴圆猿鄄云造葬早本实验室保存 限制性内切酶月葬皂匀 Ⅰ 载澡燥 Ⅰ 及预染蛋白分子量标准酝葬则噪藻则购自栽澡藻则皂燥云蚤泽澡藻则杂糟蚤藻灶贼蚤枣蚤糟 ; 栽源阅晕粤连接酶购自栽葬运葬砸葬 ; 质粒小提试剂盒 琼脂糖凝胶回收试剂盒和孕悦砸产物清洁试剂盒购自韵皂藻早葬 ; 云葬泽贼孕枣怎阅晕粤高保真聚合酶购自全式金公司 ; 胎牛血清和阅酝耘酝培养基购自郧蚤遭糟燥 ; 阅晕粤分子量标准酝葬则噪鄄藻则购自广州东盛生物科技有限公司 ; 耘悦蕴发光液购自酝蚤造造蚤责燥则藻 ; 谷胱甘肽 ( 郧杂匀 ) 琼脂糖珠和孕则燥贼藻蚤灶粤辕郧购自蕴蚤枣藻 ; 蕴蚤责燥枣藻糟贼葬皂蚤灶藻圆园园园和酝赠糟单克隆抗体购自悦藻造造杂蚤早灶葬造蚤灶早栽藻糟澡灶燥造燥早赠 ; 云造葬早单克隆抗体购自孕则燥贼藻蚤灶贼藻糟澡 ; 羊抗鼠 Ⅱ 抗和羊抗兔 Ⅱ 抗购自碧云天公司 引物由生工生物工程有限公司合成, 引物序列见表员 圆 表员摇 截短突变型晕皂蚤孕悦砸引物 栽葬遭造藻员援 栽澡藻泽藻择怎藻灶糟藻燥枣责则蚤皂藻则泽枣燥则贼则怎灶糟葬贼藻凿晕皂蚤 晕葬皂藻 孕则蚤皂藻则泽藻择怎藻灶糟藻 ( 缘 鄄猿 ) 晕皂蚤赃员葬葬鄄员怨圆葬葬 云燥则憎葬则凿 : 悦粤栽粤栽悦郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧粤粤郧悦栽郧 砸藻增藻则泽藻 : 粤栽粤悦栽悦郧粤郧栽悦粤郧栽悦悦粤悦悦栽悦栽悦悦 晕皂蚤赃员葬葬鄄圆园圆葬葬 云燥则憎葬则凿 : 悦粤栽粤栽悦郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧粤粤郧悦栽郧 砸藻增藻则泽藻 : 郧栽悦栽悦郧粤郧栽栽粤粤悦栽悦悦悦郧郧粤悦栽郧栽 晕皂蚤赃员葬葬鄄圆员圆葬葬云燥则憎葬则凿 : 悦粤栽粤栽悦郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧粤粤郧悦栽郧砸藻增藻则泽藻 : 悦粤粤栽悦栽悦郧粤郧栽悦粤悦粤悦栽悦悦粤粤栽悦栽悦晕皂蚤赃员葬葬鄄圆圆圆葬葬云燥则憎葬则凿 : 悦粤栽粤栽悦郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧粤粤郧悦栽郧砸藻增藻则泽藻 : 郧粤悦郧悦粤栽悦栽悦郧粤郧栽悦粤郧栽粤栽栽悦栽栽栽悦 晕皂蚤赃员葬葬鄄圆猿圆葬葬云燥则憎葬则凿 : 悦粤栽粤栽悦郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧粤粤郧悦栽郧砸藻增藻则泽藻 : 郧粤郧粤悦栽悦郧粤郧栽悦粤栽悦栽粤栽郧郧悦粤郧郧栽晕皂蚤赃员葬葬鄄圆缘圆葬葬云燥则憎葬则凿 : 悦粤栽粤栽悦郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧粤粤郧悦栽郧砸藻增藻则泽藻 : 粤郧悦粤悦栽郧栽悦栽悦郧粤郧栽悦粤栽郧栽栽悦悦栽 晕皂蚤赃员葬葬鄄圆远圆葬葬云燥则憎葬则凿 : 悦粤栽粤栽悦郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧粤粤郧悦栽郧砸藻增藻则泽藻 : 郧栽栽郧悦栽悦郧粤郧栽悦粤悦粤栽栽悦悦栽郧栽悦晕皂蚤赃员葬葬鄄圆苑圆葬葬云燥则憎葬则凿 : 悦粤栽粤栽悦郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧粤粤郧悦栽郧砸藻增藻则泽藻 : 栽悦栽悦郧粤郧悦栽粤悦粤悦粤粤栽栽栽悦栽栽悦粤栽悦悦 晕皂蚤赃员葬葬鄄圆愿圆葬葬云燥则憎葬则凿 : 悦粤栽粤栽悦郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧粤粤郧悦栽郧砸藻增藻则泽藻 : 悦悦悦栽悦郧粤郧栽悦粤悦悦郧栽栽郧粤粤粤郧晕皂蚤赃员葬葬鄄圆怨圆葬葬云燥则憎葬则凿 : 悦粤栽粤栽悦郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧粤粤郧悦栽郧砸藻增藻则泽藻 : 郧粤郧粤悦栽悦郧粤郧栽悦粤悦粤悦粤栽悦栽粤悦栽栽悦栽悦 摇栽澡藻怎灶凿藻则造蚤灶藻凿蚤贼葬造蚤糟泽凿藻灶燥贼藻贼澡藻则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶藻灶扎赠皂藻糟怎贼贼蚤灶早泽蚤贼藻泽援

3 员圆苑圆 表圆摇缺失突变型晕皂蚤孕悦砸引物栽葬遭造藻圆援栽澡藻泽藻择怎藻灶糟藻燥枣责则蚤皂藻则泽枣燥则晕皂蚤凿藻造藻贼蚤燥灶皂怎贼葬贼蚤燥灶泽摇摇摇晕葬皂藻孕则蚤皂藻则泽藻择怎藻灶糟藻 ( 缘 鄄猿 ) 晕皂蚤赃员葬葬鄄员怨员葬葬云燥则憎葬则凿 : 悦悦粤郧郧粤栽悦悦郧悦悦粤悦悦粤栽郧砸藻增藻则泽藻 : 悦粤悦悦栽悦栽悦悦郧悦悦栽悦悦粤栽栽栽悦晕皂蚤赃员怨愿葬葬鄄猿园苑葬葬云燥则憎葬则凿 : 郧郧粤郧郧悦郧郧粤郧粤郧郧栽郧粤郧粤悦粤郧栽悦悦郧郧砸藻增藻则泽藻 : 郧栽栽栽栽栽郧栽栽悦悦栽悦郧粤郧栽栽悦栽栽悦粤粤粤郧栽粤栽郧悦栽粤栽郧栽郧粤晕皂蚤赃员葬葬鄄员怨远葬葬云燥则憎葬则凿 : 郧粤悦郧粤栽粤粤郧郧栽粤悦悦粤郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧粤粤郧悦栽郧粤栽粤粤粤郧粤栽郧砸藻增藻则泽藻 : 粤悦栽粤栽粤郧栽悦悦粤悦郧悦郧郧栽悦悦粤悦悦栽悦栽晕皂蚤赃圆园圆葬葬鄄猿园苑葬葬云燥则憎葬则凿 : 栽郧郧粤悦悦郧悦郧栽郧郧粤悦栽粤栽粤郧栽郧悦粤郧栽悦粤栽悦粤悦郧栽栽栽郧砸藻增藻则泽藻 : 粤粤悦郧郧郧悦悦悦栽悦栽粤郧粤悦栽悦郧粤郧栽栽悦栽栽悦粤粤粤郧栽粤栽郧悦栽晕皂蚤赃圆园猿葬葬鄄猿园苑葬葬云燥则憎葬则凿 : 郧郧粤郧郧悦郧郧粤郧粤郧郧栽郧郧悦粤郧栽悦粤栽悦粤砸藻增藻则泽藻 : 郧栽栽栽栽栽郧栽栽悦悦栽悦郧粤郧栽栽悦栽栽悦粤粤粤郧栽粤栽郧悦栽粤栽郧栽郧粤 摇 栽澡藻怎灶凿藻则造蚤灶藻凿蚤贼葬造蚤糟泽凿藻灶燥贼藻贼澡藻则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶藻灶扎赠皂藻糟怎贼贼蚤灶早泽蚤贼藻泽援 圆摇 主要方法 圆援员摇截短突变型晕皂蚤克隆的构建摇根据晕悦月陨的 郧藻灶月葬灶噪中收录的晕皂蚤基因序列 ( 序列号晕酝赃园园源远愿愿 ) 设计引物, 引物设计如表员所示, 上游引物含月葬皂匀 Ⅰ 酶切位点, 下游引物含载澡燥 Ⅰ 酶切位点 以责糟阅晕粤源鄄晕皂蚤鄄酝赠糟为模板, 通过孕悦砸扩增两端带有酶切位点的目的片段 反应程序为 : 怨缘益缘皂蚤灶 ; 怨缘益猿园泽 缘源益猿园泽 苑圆益源园泽的程序进行猿缘个循环 ; 苑圆益员园皂蚤灶 纯化后的孕悦砸扩增产物和经过 月葬皂匀 Ⅰ 和载澡燥 Ⅰ 酶切后的表达载体质粒责郧耘载鄄源栽鄄员, 在栽源连接酶的作用下, 与带有黏性末端的目的片段员远益连接过夜制备克隆连接液 将连接液转化至大肠杆菌感受态细胞后, 挑取阳性克隆进行双酶切鉴定, 并对阳性质粒进行测序分析 圆援圆摇缺失突变型晕皂蚤克隆的构建摇分别以缘个 远 个和员员个氨基酸为单位, 设计晕皂蚤各个缺失型片段的上下游引物 ( 见表圆 ) 来构建缺失突变型晕皂蚤克隆 构建缺失员怨圆耀耀耀耀耀耀耀耀圆园圆葬葬这员员个氨基酸的晕皂蚤是以责糟阅晕粤源鄄晕皂蚤鄄酝赠糟为模板, 设计引物分别扩增晕 端带有月葬皂匀 Ⅰ 酶切位点的晕皂蚤赃员葬葬鄄员怨员葬葬和悦端带有载澡燥 Ⅰ 酶切位点的晕皂蚤赃圆园猿葬葬鄄猿园苑葬葬这两段基因片段, 扩增程序为 : 怨缘益缘皂蚤灶 ; 怨缘益猿园泽 缘源益猿园泽, 苑圆益源园泽的程序进行猿缘个循环 ; 苑圆益员园皂蚤灶 得到相应的目的片段纯化后和经过月葬皂匀 Ⅰ 和载澡燥 Ⅰ 双酶切过的载体质粒责糟阅晕粤源鄄酝赠糟, 利用同源重组方法缘园益反应员缘皂蚤灶 连接液转化至大肠杆菌感受态细胞后提取阳性质粒进行双酶切鉴定, 并对阳性质粒进行测序分析 其余圆个缺失突变型克隆的构建均参考以上方法 圆援猿摇细胞培养和转染摇匀藻蕴葬细胞使用含有员园豫胎牛血清的阅酝耘酝高糖培养液, 在猿苑益 缘豫悦韵圆的恒温培养箱里培养 细胞转染步骤严格按蕴蚤责燥鄄枣藻糟贼葬皂蚤灶藻圆园园园说明书操作 圆援源摇郧杂栽鄄责怎造造凿燥憎灶实验摇将责郧耘载鄄源栽鄄员和责郧耘载鄄 源栽鄄员鄄晕皂蚤以及截短突变型晕皂蚤原核表达载体分别转化至大肠杆菌砸燥泽藻贼贼葬 ( 阅耘猿 ) 感受态细胞, 挑取单克隆到带有氨苄抗性的蕴月液体培养基中, 猿苑益 圆缘园则辕皂蚤灶条件下培养, 直到粤远园园为园郾远耀耀耀耀耀耀耀耀园郾愿 加入陨孕栽郧至终浓度为园郾圆皂皂燥造辕蕴, 圆缘益 员缘园则辕皂蚤灶诱导缘澡, 收集菌体进行超声破碎 郧杂匀琼脂糖珠用预冷的细菌裂解液清洗猿次, 加入超声破碎后的上清, 源益条件下, 旋转培养器上孵育圆澡 孵育结束后清洗缘次, 加入转染有哉蕴圆猿鄄云造葬早的全细胞裂解液混合, 源益孵育过夜, 后清洗员园次 宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼法分析结果 圆援缘摇免疫共沉淀 ( 糟燥鄄蚤皂皂怎灶燥责则藻糟蚤责蚤贼葬贼蚤燥灶, 悦燥鄄陨孕 ) 摇将责糟阅晕粤猿郾员 ( 垣 ) 鄄哉蕴圆猿鄄云造葬早分别与责糟阅晕粤源赃晕皂蚤 Δ 员怨圆葬葬鄄员怨苑葬葬鄄酝赠糟 ( 缺失晕皂蚤的第员怨圆耀耀耀耀耀耀耀耀员怨苑位氨基酸 ) 责糟阅晕粤源鄄晕皂蚤赃 Δ 员怨苑葬葬鄄圆园员葬葬鄄酝赠糟 ( 缺失晕皂蚤的员怨苑耀耀耀耀耀耀耀耀圆园员位氨基酸 ) 和责糟阅晕粤源鄄晕皂蚤赃 Δ 员怨圆葬葬鄄圆园圆葬葬鄄酝赠糟 ( 缺失晕皂蚤的第员怨圆耀耀耀耀耀耀耀耀圆园圆位氨基酸 ) 质粒共转染入匀藻蕴葬细胞, 猿远澡后裂解细胞, 离心后收集上清, 加入云造葬早抗体, 源益孵育过夜 再与预处理后的孕则燥贼藻蚤灶粤琼脂糖珠在源益条件下孵育过夜 孵育结束后, 用宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼及陨孕裂解液清洗缘耀耀耀耀耀耀耀耀苑次, 最后用宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼法分析结果 圆援远摇宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼摇收集含有总蛋白的细胞裂解液, 或者收集附着有蛋白的谷胱甘肽琼脂糖珠和孕则燥贼藻蚤灶粤琼脂糖珠缓冲液, 按照比例加入缘伊杂阅杂蛋白上样缓冲液, 煮沸员园耀耀耀耀耀耀耀耀员缘皂蚤灶, 离心后取上清 经员园豫杂阅杂鄄孕粤郧耘分离后的蛋白转移至孕灾阅云膜上, 随后用含缘豫脱脂奶粉的栽月杂栽缓冲液封闭员澡 经过封闭的孕灾阅云膜分别与含有云造葬早抗体 酝赠糟抗体或 α 鄄贼怎鄄遭怎造蚤灶抗体的抗体稀释液在源益条件下孵育过夜 栽月杂栽洗膜猿次, 每次圆园皂蚤灶 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体或羊抗兔抗体源益孵育圆澡, 栽月杂栽洗膜猿次, 每次圆园皂蚤灶 耘悦蕴显色发光, 凝胶成像仪拍照分析

4 员圆苑猿 结摇摇果员摇截短突变型晕皂蚤目的基因的扩增和重组质粒的鉴定摇摇根据晕悦月陨上已公布的晕皂蚤 ( 郧藻灶月葬灶噪 : 晕酝赃园园源远愿愿 ) 的基因序列, 将晕皂蚤上晕陨阅圆结构域划分成员园个截短突变型片段 以责糟阅晕粤源鄄晕皂蚤鄄酝赠糟 ( 全长 ) 为模板, 分别通过孕悦砸进行扩增 员园个截短突变型晕皂蚤的孕悦砸产物经琼脂糖凝胶电泳后结果显示, 孕悦砸扩增出的基因条带均与目的基因条带分子量吻合, 见图员粤 挑取单克隆, 提取对应质粒进行双酶切鉴定, 鉴定结果如图员月所示, 表明各截短突变型晕皂蚤成功插入载体 经酶切鉴定后的质粒送生工生物公司测序, 测序结果显示截短突变型晕皂蚤重组质 粒构建成功 圆摇缺失突变型晕皂蚤目的基因的扩增和重组质粒鉴定摇摇根据实验结果, 将晕皂蚤上第员怨圆耀耀耀耀耀耀耀耀圆园圆位氨基酸划分成猿个缺失型片段, 以责糟阅晕粤源鄄晕皂蚤鄄酝赠糟 ( 全长 ) 为模板, 孕悦砸扩增出缘个不同长度的晕皂蚤片段, 孕悦砸产物分子量大小与预期一致, 结果显示不同长度的晕皂蚤片段通过孕悦砸扩增成功, 见图员悦 摇摇提取阳性单克隆的质粒进行双酶切鉴定, 结果如图员阅所示, 阳性重组质粒经双酶切得到的片段与缺失突变型晕皂蚤分子量一致, 表明目的片段成功插入载体 测序的结果证实缺失突变型晕皂蚤真核表达载体构建成功 责糟阅晕粤源鄄晕皂蚤赃 Δ 员怨圆葬葬鄄员怨苑葬葬鄄酝赠糟表示缺失晕皂蚤的第员怨圆位耀耀耀耀耀耀耀耀员怨苑位氨基酸, 其余圆个缺失突变型克隆均采用此法表示 云蚤早怎则藻员援陨灶凿蚤糟葬贼藻凿枣则葬早皂藻灶贼泽葬皂责造蚤枣蚤藻凿遭赠孕悦砸葬灶凿蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶燥枣则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼责造葬泽皂蚤凿泽憎蚤贼澡则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶藻灶扎赠皂藻援粤 : 贼则怎灶糟葬贼藻凿晕皂蚤枣则葬早皂藻灶贼泽葬皂责造蚤枣蚤藻凿遭赠孕悦砸援员耀耀耀耀耀耀耀耀员园 : 晕皂蚤赃员葬葬鄄员怨圆葬葬, 晕皂蚤赃员葬葬鄄圆园圆葬葬, 晕皂蚤赃员葬葬鄄圆员圆葬葬, 晕皂蚤赃员葬葬鄄圆圆圆葬葬, 晕皂蚤赃员葬葬鄄圆猿圆葬葬, 晕皂蚤赃员葬葬鄄圆缘圆葬葬, 晕皂蚤赃员葬葬鄄圆远圆葬葬, 晕皂蚤赃员葬葬鄄圆苑圆葬葬, 晕皂蚤赃员葬葬鄄圆愿圆葬葬, 晕皂蚤赃员葬葬鄄圆怨圆葬葬, 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援月 : 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼责造葬泽鄄皂蚤凿泽凿蚤早藻泽贼藻凿遭赠月葬皂匀 Ⅰ 葬灶凿载澡燥 Ⅰ 援员耀耀耀耀耀耀耀耀员园 : 责郧耘载鄄源栽鄄员鄄晕皂蚤赃员葬葬鄄员怨圆葬葬, 责郧耘载鄄源栽鄄员鄄晕皂蚤赃员葬葬鄄圆园圆葬葬, 责郧耘载鄄源栽鄄员鄄晕皂蚤赃员葬葬鄄圆员圆葬葬, 责郧耘载鄄源栽鄄员鄄晕皂蚤赃员葬葬鄄圆圆圆葬葬, 责郧耘载鄄源栽鄄员鄄晕皂蚤赃员葬葬鄄圆猿圆葬葬, 责郧耘载鄄源栽鄄员鄄晕皂蚤赃员葬葬鄄圆缘圆葬葬, 责郧耘载鄄源栽鄄员鄄晕皂蚤赃员葬葬鄄圆远圆葬葬, 责郧耘载鄄源栽鄄员鄄晕皂蚤赃员葬葬鄄圆苑圆葬葬, 责郧耘载鄄源栽鄄员鄄晕皂蚤赃员葬葬鄄圆愿圆葬葬, 责郧耘载鄄源栽鄄员鄄晕皂蚤赃员葬葬鄄圆怨圆葬葬, 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援悦 : 晕皂蚤凿藻造藻贼蚤燥灶枣则葬早皂藻灶贼泽葬皂责造蚤枣蚤藻凿遭赠孕悦砸援员耀耀耀耀耀耀耀耀缘 : 晕皂蚤赃员葬葬鄄员怨员葬葬, 晕皂蚤赃员葬葬鄄员怨远葬葬, 晕皂蚤赃员怨愿葬葬鄄猿园苑葬葬, 晕皂蚤赃圆园圆葬葬鄄猿园苑葬葬, 晕皂蚤赃圆园猿葬葬鄄猿园苑葬葬, 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援阅 : 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶燥枣则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼责造葬泽皂蚤凿泽葬遭燥怎贼晕皂蚤凿藻造藻贼蚤燥灶皂怎贼葬灶贼泽凿蚤早藻泽贼藻凿遭赠月葬皂匀 Ⅰ 葬灶凿载澡燥 Ⅰ 援酝 : 皂葬则噪藻则援员耀耀耀耀耀耀耀耀猿 : 责糟阅晕粤源鄄晕皂蚤赃 Δ 员怨圆葬葬鄄员怨苑葬葬, 责糟阅晕粤源鄄晕皂蚤赃 Δ 员怨苑葬葬鄄圆园员葬葬, 责糟阅晕粤源鄄晕皂蚤赃 Δ 员怨圆葬葬鄄圆园圆葬葬援图员摇截短突变型晕皂蚤克隆和缺失突变型晕皂蚤克隆的构建 猿摇郧杂栽鄄责怎造造凿燥憎灶法探究晕皂蚤与哉蕴圆猿相互作用的位点摇摇将责郧耘载鄄源栽鄄员 ( 郧杂栽 ) 责郧耘载鄄源栽鄄员鄄晕皂蚤以及悦端截短突变型责郧耘载鄄源栽鄄员鄄晕皂蚤原核表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞 含原核表达载体责郧耘载鄄源栽鄄员 ( 郧杂栽 ) 责郧耘载鄄源栽鄄员鄄晕皂蚤以及截短突变型晕皂蚤的 砸燥泽藻贼贼葬菌株经异丙基鄄 β 鄄阅鄄硫代半乳糖苷 ( 蚤泽燥责则燥责赠造鄄 β 鄄阅鄄贼澡蚤燥早葬造葬糟贼燥泽蚤凿藻, 陨孕栽郧 ) 诱导后分别表达出分子量大小与预期相吻合的蛋白, 说明员圆个目的蛋白成功诱导表达 诱导前的菌种所表达的蛋白如图圆粤和图圆月所示, 诱导后的菌种蛋白表达如图圆悦和图圆阅所示

5 员圆苑源 云蚤早怎则藻 圆援 杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 枣怎泽蚤燥灶 责则燥贼藻蚤灶 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 蚤灶凿怎糟藻凿 憎蚤贼澡 陨孕栽郧援 粤 葬灶凿 月 遭葬糟贼藻则蚤葬 蚤灶凿怎糟藻凿 憎蚤贼澡燥怎贼 陨孕栽郧 悦 葬灶凿 阅 遭葬糟贼藻则蚤葬 蚤灶凿怎糟藻凿 憎蚤贼澡 园郾 圆 皂皂燥造 辕 蕴 陨孕栽郧援 图 圆摇 截短突变型 郧杂栽鄄晕皂蚤 蛋白的诱导表达 摇 摇 经 郧杂匀 琼脂糖珠亲和层析纯化之后 相应的目 示 郧杂栽 蛋白与融合蛋白 哉蕴圆猿鄄云造葬早 的 责怎造造凿燥憎灶 结 说明 郧杂栽 蛋 白 郧杂栽鄄晕皂蚤 蛋 白 和 截 短 突 变 型 郧杂栽鄄 的 责怎造造凿燥憎灶 结果为阳性对照 在所有的截短突变型 所示 郧杂匀 琼脂糖珠亲和层析纯化后的 员圆 个目的 不能 在 体 外 与 融 合 蛋 白 哉蕴圆猿鄄枣造葬早 相 互 作 用 图 的蛋白均有一定的富集 并且只含有目的蛋白条带 果为阴性对照 郧杂栽鄄晕皂蚤 蛋白与融合蛋白 哉蕴圆猿鄄云造葬早 晕皂蚤 蛋白在体外能够得到有效的纯化 结果如图 猿粤 蛋白与真核表达载体表达的融合蛋白 哉蕴圆猿鄄云造葬早 混 合 孵育 清洗 通过 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 进行检测 真核表 达载体表达的融合蛋白 哉蕴圆猿鄄云造葬早 结果如图 猿月 所 郧杂栽鄄晕皂蚤 蛋白中 只有 郧杂栽鄄晕皂蚤赃员葬葬鄄员怨圆葬葬 这段蛋白 猿粤 从而初步筛选出 晕皂蚤 与 哉蕴圆猿 相互作用的区域 为 晕皂蚤 上第 员怨圆 耀 圆园圆 位氨基酸 云蚤早怎则藻 猿援 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 凿燥皂葬蚤灶泽 燥灶 晕皂蚤 贼澡葬贼 皂藻凿蚤葬贼藻 贼澡藻 蚤灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶 憎蚤贼澡 哉蕴圆猿 遭赠 郧杂栽鄄责怎造造凿燥憎灶 贼藻泽贼援 粤 杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 责怎则蚤枣蚤藻凿 枣怎泽蚤燥灶 责则燥贼藻蚤灶泽 贼燥责 责葬灶藻造 泽贼葬蚤灶藻凿 遭赠 悦燥燥皂葬泽泽蚤藻 遭则蚤造造蚤葬灶贼 遭造怎藻 葬灶凿 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎蚤灶早 葬遭蚤造蚤贼蚤藻泽 葬遭燥怎贼 枣怎造造鄄造藻灶早贼澡 晕皂蚤 葬灶凿 蚤贼泽 皂怎贼葬灶贼泽 贼燥 蚤灶贼藻则葬糟贼 憎蚤贼澡 哉蕴圆猿鄄云造葬早 遭燥贼贼燥皂 责葬灶藻造 月 责糟阅晕粤猿援 员 垣 鄄哉蕴圆猿鄄云造葬早 葬灶凿 责糟阅晕粤猿援 员 垣 贼则葬灶泽枣藻糟贼藻凿 蚤灶贼燥 匀藻蕴葬 糟藻造造泽援 栽澡藻 糟藻造造 造赠泽葬贼藻泽 憎藻则藻 蚤皂皂怎灶燥遭造燥贼贼藻凿 憎蚤贼澡 葬灶贼蚤鄄云造葬早援 图 猿摇 郧杂栽鄄孕怎造造凿燥憎灶 检测 晕皂蚤 与 哉蕴圆猿 的相互作用区域 源摇 免疫共沉淀法验证 晕皂蚤 与 哉蕴圆猿 相互作用的区 域 摇 摇 将 责糟阅晕粤猿援 员 垣 鄄哉蕴圆猿鄄云造葬早 分 别 与 责糟阅晕粤源 晕粤源 与 哉蕴圆猿鄄云造葬早 的体内相互作用作为阴性对照 融 合蛋白 酝赠糟鄄晕皂蚤 与融合蛋白 哉蕴圆猿鄄云造葬早 的体内相互 作用作为阳性对照 实验结果如图 源 所示 融合蛋白 和野生型 晕皂蚤 及缺失突变型 晕皂蚤 共转染到 匀藻蕴葬 细 哉蕴圆猿鄄云造葬早 能够在各实验组中表达 野生型 晕皂蚤 和缺 云造葬早 抗体孵育后检测蛋白的相互作用情况 以 责糟阅鄄 明 阳 性 对 照 中 融 合 蛋 白 酝赠糟 鄄 晕皂蚤 能 与 融 合 蛋 白 胞中 收集 细 胞 裂 解 液 与 孕则燥贼藻蚤灶 粤 辕 郧 琼 脂 糖 珠 失型突变 晕皂蚤 均能表达 免疫共沉淀实验结果表

6 员圆苑缘 哉蕴圆猿鄄云造葬早相互作用, 再一次证实晕皂蚤可与哉蕴圆猿相互作用 过表达酝赠糟鄄晕皂蚤赃 Δ 员怨圆葬葬鄄员怨苑葬葬 ( 即酝赠糟鄄晕皂蚤缺失第员怨圆耀耀耀耀耀耀耀耀员怨苑位氨基酸 ) 和酝赠糟鄄晕皂蚤赃 Δ 员怨苑葬葬鄄圆园员葬葬 ( 即酝赠糟鄄晕皂蚤缺失第员怨苑耀耀耀耀耀耀耀耀圆园员位氨基酸 ) 均能与哉蕴圆猿鄄云造葬早相互作用 融合蛋白酝赠糟鄄晕皂蚤赃 Δ 员怨圆葬葬鄄圆园圆葬葬 ( 即酝赠糟鄄晕皂蚤缺失第员怨圆耀耀耀耀耀耀耀耀圆园圆位氨基酸 ) 不能与融合蛋白哉蕴圆猿鄄云造葬早在体内发生相互作用, 与郧杂栽鄄责怎造造凿燥憎灶实验的结果相一致, 见图缘 讨摇摇论摇摇人巨细胞病毒在人群中呈普遍性感染, 同时匀悦酝灾也与多种疾病的发生均有密切关联, 因而匀悦酝灾感染的诊断和治疗显得尤其重要 本研究通过郧杂栽鄄责怎造造凿燥憎灶和悦燥鄄陨孕实验证实了晕皂蚤与哉蕴圆猿在体内存在相互作用并且进一步确定了晕皂蚤与哉蕴圆猿相互作用的区域 免疫共沉淀实验结果表明, 云蚤早怎则藻源援灾藻则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶燥枣晕皂蚤凿藻造藻贼蚤燥灶皂怎贼葬灶贼泽蚤灶蚤灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶憎蚤贼澡哉蕴圆猿遭赠悦燥鄄陨孕葬泽泽葬赠援匀藻蕴葬糟藻造造泽憎藻则藻贼则葬灶泽枣藻糟贼藻凿憎蚤贼澡云造葬早鄄贼葬早早藻凿哉蕴圆猿葬灶凿蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿遭赠酝赠糟鄄贼葬早早藻凿责造葬泽皂蚤凿泽援栽澡藻糟藻造造造赠泽葬贼藻泽憎藻则藻蚤皂皂怎灶燥责则藻糟蚤责蚤贼葬贼藻凿憎蚤贼澡葬灶贼蚤鄄云造葬早援陨皂皂怎灶燥责则藻糟蚤责蚤贼葬贼藻泽憎藻则藻葬灶葬造赠扎藻凿遭赠蚤皂皂怎灶燥遭造燥贼憎蚤贼澡葬灶贼蚤鄄酝赠糟燥则葬灶贼蚤鄄云造葬早援图源摇免疫共沉淀方法验证缺失突变型晕皂蚤与哉蕴圆猿相互作用 云蚤早怎则藻缘援杂糟澡藻皂葬贼蚤糟凿蚤葬早则葬皂燥枣晕皂蚤凿燥皂葬蚤灶泽贼澡葬贼皂藻凿蚤葬贼藻贼澡藻蚤灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶憎蚤贼澡哉蕴圆猿援图缘摇晕皂蚤与哉蕴圆猿相互作用位点示意图 缺失员员个氨基酸的融合蛋白酝赠糟鄄晕皂蚤赃 Δ 员怨圆葬葬鄄圆园圆葬葬不会与融合蛋白哉蕴圆猿鄄云造葬早相互作用, 而缺失 缘个氨基酸的融合蛋白酝赠糟鄄晕皂蚤赃 Δ 员怨苑葬葬鄄圆园员葬葬和缺失远个氨基酸的融合蛋白酝赠糟鄄晕皂蚤赃 Δ 员怨圆葬葬鄄员怨苑葬葬均能与哉蕴圆猿鄄云造葬早发生相互作用, 猜测是因为晕皂蚤上 员怨圆耀耀耀耀耀耀耀耀圆园圆葬葬中有某几个间隔的氨基酸联合作用于 哉蕴圆猿, 也可能是该区域具有特殊的空间构象有助于 晕皂蚤与哉蕴圆猿结合 摇摇晕皂蚤可以增强干扰素 α 启动子的活性, 抑制水 [ 员员疱性口炎病毒的生长 ] 晕皂蚤与干扰素信号通路核心分子杂栽粤栽家族中的杂栽粤栽员和杂栽粤栽缘结合, 从而促进杂栽粤栽员与悦月孕辕责猿园园的相互作用, 放大干扰素 [ 员圆信号通路的生物学效应, 使得抗病毒蛋白生成 ] 由于晕皂蚤在抗病毒过程中发挥着重要角色, 病毒通 过干扰晕皂蚤的功能抵抗宿主的免疫反应来促进病毒自身的增殖 晕皂蚤增强干扰素信号通路中干扰素刺激应答元件陨砸杂耘启动子的转录活性, 而诺如病毒编码的小分子砸晕粤贼贼澡愿能减少晕皂蚤的表达, 并减弱 [ 员猿陨杂砸耘启动子的转录活性 ] 晕皂蚤与泡沫病毒的反式激活因子栽葬泽相互作用后, 阻碍栽葬泽进入细胞核, [ 员源干扰栽葬泽的激活功能, 从而抑制泡沫病毒的复制 ] 晕皂蚤与哉蕴圆猿相互作用的区域位于晕皂蚤上晕陨阅圆这个区域, 而晕皂蚤与栽蚤责远园相互作用区域与其部分重叠, 位于晕皂蚤上员圆远耀耀耀耀耀耀耀耀员怨苑葬葬区域 晕皂蚤与栽蚤责远园相互作用后可以增强自身的稳定性, 但晕皂蚤是否可以通过与哉蕴圆猿相互作用来促进自身的降解或者提高哉蕴圆猿的稳定性, 从而帮助病毒达到免疫逃避的目的有待进一步的研究

7 员圆苑远 摇摇蛋白相互作用缺失或者蛋白发生不恰当的相互作用都容易导致细胞或机体内环境稳态被破坏, 细胞或机体生命活动受影响, 从而引起疾病的发生甚至危害生命 哉蕴圆猿能与晕皂蚤发生相互作用, 前期实验结果也表明, 哉蕴圆猿能与多个宿主蛋白相互作 [ 远鄄苑用 ], 猜测匀悦酝灾可能利用哉蕴圆猿干扰宿主的生命活动, 达到免疫逃避的目的 晕皂蚤在细胞中主要定位在细胞核, 而在稳定表达哉蕴圆猿的细胞系中, 晕皂蚤与哉蕴圆猿主要定位于细胞质, 晕皂蚤和哉蕴圆猿相互作用后改变了晕皂蚤的核定位 感染匀悦酝灾病毒后, 晕皂蚤通过与哉蕴圆猿相互作用抑制晕皂蚤与杂栽粤栽员的相互作 [ 愿用, 阻止杂栽粤栽员进入细胞核 ] 杂栽粤栽员经过磷酸化后形成同源二聚体, 进入细胞核与郧粤杂启动子结合, [ 员缘起始抗病毒基因的转录 ] 哉蕴圆猿可能通过与晕皂蚤相互作用抑制杂栽粤栽员入核, 使杂栽粤栽员参与的允粤运鄄杂栽粤栽信号通路受到影响, 相应的抗病毒基因的转录被抑制, 这有利于匀悦酝灾进行免疫逃避 本研究确认了晕皂蚤与哉蕴圆猿的相互作用并且找到晕皂蚤与哉蕴圆猿相互作用的关键氨基酸为晕皂蚤上第员怨圆耀耀耀耀耀耀耀耀圆园圆位氨基酸, 这为阐明哉蕴圆猿帮助匀悦酝灾在宿主体内潜伏的分子机理提供了基础, 加深了我们对两者相互作用的认识, 为研究匀悦酝灾感染宿主的致病机理提供理论基础 [ 参摇考摇文摇献 ] [ 员 ] 摇郭丽丽, 许红梅援人巨细胞病毒感染的流行病学研究进展 [ 允 ] 援国际检验医学杂志, 圆园员园, 猿员 ( 员园 ): 员员猿员鄄员员猿猿援 [ 圆 ] 摇月则蚤贼贼宰允援悦燥灶早藻灶蚤贼葬造澡怎皂葬灶糟赠贼燥皂藻早葬造燥增蚤则怎泽蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶葬灶凿贼澡藻藻灶蚤早皂葬燥枣皂葬贼藻则灶葬造蚤皂皂怎灶蚤贼赠 [ 允 ] 援允灾蚤则燥造, 圆园员苑, 怨员 ( 员缘 ): 藻园圆猿怨圆鄄员远援 [ 猿 ] 摇砸葬憎造蚤灶泽燥灶宰阅, 匀葬皂蚤造贼燥灶杂栽, 增葬灶在怎赠造藻灶宰允援哉责凿葬贼藻燥灶贼则藻葬贼皂藻灶贼燥枣糟赠贼燥皂藻早葬造燥增蚤则怎泽蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶蚤灶责则藻早灶葬灶糟赠葬灶凿燥枣贼澡藻灶藻憎遭燥则灶憎蚤贼澡糟燥灶早藻灶蚤贼葬造糟赠贼燥皂藻早葬造燥增蚤则怎泽 [ 允 ] 援悦怎则则韵责蚤灶陨灶枣藻糟贼阅蚤泽, 圆园员远, 圆怨 ( 远 ): 远员缘鄄远圆源援 [ 源 ] 摇允蚤葬再允, 蕴蚤怎允, 匀葬灶云云, 藻贼葬造援悦赠贼燥皂藻早葬造燥增蚤则怎泽蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶葬灶凿葬贼澡藻则燥泽糟造藻则燥泽蚤泽则蚤泽噪 : 葬皂藻贼葬鄄葬灶葬造赠泽蚤泽 [ 允 ] 援允酝藻凿灾蚤鄄则燥造, 圆园员苑, 愿怨 ( 员圆 ): 圆员怨远鄄圆圆园远援 [ 缘 ] 摇粤凿葬蚤则砸, 阅燥怎早造葬泽耘砸, 酝葬糟造藻葬灶允月, 藻贼葬造援栽澡藻责则燥凿怎糟贼泽燥枣 澡怎皂葬灶糟赠贼燥皂藻早葬造燥增蚤则怎泽早藻灶藻泽哉蕴圆猿, 哉蕴圆源, 哉蕴源猿葬灶凿哉杂圆圆葬则藻贼藻早怎皂藻灶贼糟燥皂责燥灶藻灶贼泽 [ 允 ] 援允郧藻灶灾蚤则燥造, 圆园园圆, 愿猿 ( 责贼远 ): 员猿员缘鄄员猿圆源援 [ 远 ] 摇曾摇涛, 李实骞, 姚伙旺, 等援粤栽孕葬泽藻抑制因子员是与 匀悦酝灾责哉蕴圆猿蛋白相作用的宿主蛋白分子鄄酵母双杂交技术筛选与鉴定 [ 允 ] 援中国病理生理杂志, 圆园园怨, 圆缘 ( 苑 ): 员猿远园鄄员猿远源援 [ 苑 ] 摇肖小平, 周天鸿, 宫君原, 等援人巨细胞病毒皮层蛋白 责哉蕴圆猿与宿主蛋白陨郧云月孕源相互作用的鉴定 [ 允 ] 援中国病理生理杂志, 圆园员园, 圆远 ( 员圆 ): 圆猿苑愿鄄圆猿愿圆援 [ 愿 ] 摇云藻灶早蕴, 杂澡藻灶早允, 灾怎郧孕, 藻贼葬造援匀怎皂葬灶糟赠贼燥皂藻早葬造燥增蚤则怎泽 哉蕴圆猿蚤灶澡蚤遭蚤贼泽贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶燥枣蚤灶贼藻则枣藻则燥灶鄄早葬皂皂葬泽贼蚤皂怎造葬贼藻凿早藻灶藻泽葬灶凿遭造燥糟噪泽葬灶贼蚤增蚤则葬造蚤灶贼藻则枣藻则燥灶鄄早葬皂皂葬则藻泽责燥灶泽藻泽遭赠蚤灶贼藻则葬糟贼蚤灶早憎蚤贼澡澡怎皂葬灶晕鄄皂赠糟蚤灶贼藻则葬糟贼燥则责则燥贼藻蚤灶 [ 允 ] 援孕蕴燥杂孕葬贼澡燥早, 圆园员愿, 员源 ( 员 ): 藻员园园远愿远苑援 [ 怨 ] 摇孕则怎蚤贼贼匀悦, 阅藻增蚤灶藻阅允, 杂葬皂葬灶贼砸杂援砸燥造藻泽燥枣晕鄄酝赠糟葬灶凿 杂栽粤栽蚤灶贼藻则葬糟贼燥则蚤灶糟葬灶糟藻则 : 枣则燥皂蚤灶蚤贼蚤葬贼蚤燥灶贼燥凿蚤泽泽藻皂蚤灶葬贼蚤燥灶 [ 允 ] 援陨灶贼允悦葬灶糟藻则, 圆园员远, 员猿怨 ( 猿 ): 源怨员鄄缘园园援 [ 员园 ] 悦澡藻灶允, 杂澡责葬造造砸蕴, 酝藻赠藻则凿蚤藻则噪泽粤, 藻贼葬造援陨灶贼藻则枣藻则燥灶鄄蚤灶鄄 凿怎糟蚤遭造藻酝赠糟辕杂栽粤栽鄄蚤灶贼藻则葬糟贼蚤灶早责则燥贼藻蚤灶晕皂蚤葬泽泽燥糟蚤葬贼藻泽憎蚤贼澡陨云孕猿缘蚤灶贼燥葬澡蚤早澡皂燥造藻糟怎造葬则皂葬泽泽糟燥皂责造藻曾葬灶凿蚤灶澡蚤遭蚤贼泽责则燥贼藻葬泽燥皂藻鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿凿藻早则葬凿葬贼蚤燥灶燥枣陨云孕猿缘 [ 允 ] 援允月蚤燥造悦澡藻皂, 圆园园园, 圆苑缘 ( 源远 ): 猿远圆苑愿鄄猿远圆愿源援 [ 员员 ] 在澡藻灶早宰, 蕴蚤载, 宰葬灶早允, 藻贼葬造援粤糟则蚤贼蚤糟葬造则燥造藻燥枣蚤灶贼藻则枣藻鄄 则燥灶鄄蚤灶凿怎糟藻凿责则燥贼藻蚤灶陨云孕猿缘蚤灶贼澡藻贼赠责藻陨蚤灶贼藻则枣藻则燥灶则藻泽责燥灶泽藻蚤灶糟藻造造泽蚤灶凿怎糟藻凿遭赠枣燥燥贼鄄葬灶凿鄄皂燥怎贼澡凿蚤泽藻葬泽藻增蚤则怎泽 ( 云酝阅灾 ) 责则燥贼藻蚤灶圆悦 [ 允 ] 援粤则糟澡灾蚤则燥造, 圆园员源, 员缘怨 ( 员员 ): 圆怨圆缘鄄圆怨猿缘援 [ 员圆 ] 在澡怎酝, 允燥澡灶杂, 月藻则早酝, 藻贼葬造援云怎灶糟贼蚤燥灶葬造葬泽泽燥糟蚤葬贼蚤燥灶燥枣 晕皂蚤憎蚤贼澡杂贼葬贼缘葬灶凿杂贼葬贼员蚤灶陨蕴鄄圆鄄葬灶凿陨云晕 α 鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿泽蚤早鄄灶葬造蚤灶早 [ 允 ] 援悦藻造造, 员怨怨怨, 怨远 ( 员 ): 员圆猿鄄员猿园援 [ 员猿 ] 运蚤灶糟葬蚤凿砸孕, 月怎则噪藻允酝, 悦燥曾允悦, 藻贼葬造援粤澡怎皂葬灶贼燥则择怎藻 贼藻灶燥增蚤则怎泽藻灶糟燥凿藻泽葬皂蚤糟则燥砸晕粤贼澡葬贼蚤灶澡蚤遭蚤贼泽蚤灶贼藻则枣藻则燥灶泽蚤早鄄灶葬造蚤灶早 [ 允 ] 援孕蕴燥杂孕葬贼澡燥早, 圆园员猿, 怨 ( 员圆 ): 藻员园园猿愿员愿援 [ 员源 ] 匀怎载, 再葬灶早宰, 蕴蚤怎砸, 藻贼葬造援晕鄄酝赠糟蚤灶贼藻则葬糟贼燥则蚤灶澡蚤遭蚤贼泽 责则燥贼燥贼赠责藻枣燥葬皂赠增蚤则怎泽遭赠泽藻择怎藻泽贼藻则蚤灶早增蚤则葬造栽葬泽责则燥贼藻蚤灶蚤灶贼澡藻糟赠贼燥责造葬泽皂 [ 允 ] 援允灾蚤则燥造, 圆园员源, 愿愿 ( 员圆 ): 苑园猿远鄄苑园源源援 [ 员缘 ] 郧燥怎早澡阅允, 蕴藻增赠阅耘, 允燥澡灶泽贼燥灶藻砸宰, 藻贼葬造援陨云晕 γ 泽蚤早灶葬鄄 造蚤灶早 : 凿燥藻泽蚤贼皂藻葬灶允粤运鄄杂栽粤栽?[ 允 ] 援悦赠贼燥噪蚤灶藻郧则燥憎贼澡云葬糟贼燥则砸藻增, 圆园园愿, 员怨 ( 缘鄄远 ): 猿愿猿鄄猿怨源援 ( 责任编辑 : 林白霜, 余小慧 )