目 录 实验项目一 : 加味香连丸的 TLC 鉴别... 3 实验项目二 : 紫外分光光度法测定加味香连丸中黄连生物碱的含量... 5 实验项目三 : 复方丹参滴丸中龙脑的含量测定... 6 实验项目四 : 中药制剂中橙皮苷的含量测定... 8 实验项目五 :HPLC 综合实验 一清颗粒测定 (1)

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1 天津中医药大学 现代中药分析实验讲义 ( 供中药专业使用 ) 天津中医药大学中药学院 分析化学教研室 2015 年 4 月 1

2 目 录 实验项目一 : 加味香连丸的 TLC 鉴别... 3 实验项目二 : 紫外分光光度法测定加味香连丸中黄连生物碱的含量... 5 实验项目三 : 复方丹参滴丸中龙脑的含量测定... 6 实验项目四 : 中药制剂中橙皮苷的含量测定... 8 实验项目五 :HPLC 综合实验 一清颗粒测定 (1)... 9 实验项目六 :HPLC 综合实验 一清颗粒测定 (2)

3 天津中医药大学 现代中药分析 实验讲义 所属课程 现代中药分析核心课程 学时 36 适用专业 中药学 1004 中药制药 1005 课程英文名称 Analysis of Chinese Medicinal Preparation Experiment 一 实验课程简介 中药制剂分析 是一门以中医药理论为指导, 运用现代分析理论和方法研究中药制剂质量的综合应用性学科, 是中药专业的核心主干课程之一 二 实验课程目标 通过实验, 加深对中药制剂分析基本理论 基本知识的理解, 正确 熟练地掌握中药制剂分析常用的法定方法及规范化的操作技能 现代中药分析实验 是 化学分析 仪器分析 中药学 方剂学 中药炮制 中药鉴定学 中药化学 和 中药制剂学 等相结合的一门具有很强实践性和综合性的应用科学 本课程实践教学既注重基本技能训练 又加强创新能力的培养 在实践教学内容的安排上, 既有验证性实验, 让学生掌握药物分析的一般方法与技术特点 ; 又有综合性试验, 使学生将理论知识和具体的药物分析测定技术融会贯通, 掌握解决实际药物分析技术问题的方法 ; 还包括设计性试验, 培养学生的研究创新能力 验证性 综合性和设计性试验分步骤逐步实施, 使学生的理论和实验技能得到不断的进步 三 实验项目 ( 一 ) 实验项目一 : 加味香连丸的 TLC 鉴别 1 实验项目学时:6 学时 2 实验项目类型: 验证性 综合性实验 3 实验项目内容:1. 加味香连丸中黄连总碱的提取 ; 黄连药味的薄层鉴别 2. 加味香连丸中挥发油的提取 ; 药味的薄层鉴别 4 实验项目学习要求:( 从运用知识 提高能力两个层次说明学习要求 ) (1) 运用知识 : 中药材及其复方制剂的 TLC 鉴别 中药有效部位的提取 对照液 供试液制备 TLC 基本操作技能练习 3

4 (2) 提高能力 : 掌握中药提取 净化操作 ;5 种 TLC 溶液配制操作 ;TLC 规范操作 ; 鉴别中药真伪操作技能 提高 TLC 法鉴别中药的能力及有效部位提取能力 5 主要仪器设备与材料: 千分之一天平 恒温水浴锅 层析缸 三用紫外分析仪 喷雾瓶 吹风机 加味香连丸 盐酸小檗碱对照品 黄连及木香对照药材,95% 乙醇 (AR) 6 与理论课程的关系: 本实验是在第二章鉴别基础知识教学基础上的实验教学 是中药鉴别主要方法的直接应用 是中国药典的最主要方法 7 实验步骤 1) 取本品 60mg, 研细, 加乙醇 5ml, 置水浴中加热回流 15 分钟, 滤过, 滤液补加乙醇使成 5ml, 作为供试品溶液 另取黄连对照药材 50mg, 同法制成对照药材溶液 再取盐酸小檗碱对照品, 加乙醇制成每 1ml 含 0.04mg 的溶液 照薄层色谱法试验, 吸取上述三种溶液各 2 微升, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以乙酸乙酯 : 氯仿 : 甲醇 : 氨水 : 二乙胺 (8:2:2:1:0.5) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 置紫外光灯 (365nm) 下检视 供试品色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上, 显相同的黄色荧光斑点 ; 在与对照品色谱相应的位置上, 显相同的一个黄色荧光斑点 2) 取本品 0.5g, 研细, 加乙醚 5ml, 放置 2 小时, 时时振摇, 滤过, 滤液挥去乙醚, 残渣加醋酸乙酯 0.5ml 使溶解, 作为供试品溶液 另取木香对照药材 0.2g, 加乙醚 5ml, 同法制成对照药材溶液, 照薄层色谱法试验, 吸取上述两种溶液各 2 微升, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以环己烷 : 丙酮 (10:3) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以 5% 香草醛硫酸溶液, 在 105 烘约 5 分钟 供试品色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上, 显相同的紫红色至蓝紫色斑点 8 数据处理: 给出鉴定结论如实记录, 画出薄层板 ( 黄连及木香 ) 9 思考题: 1) 定性鉴别需配置哪几种溶液? 为什么? 2) 定性鉴别对量有哪些要求? 4

5 ( 二 ) 实验项目二 : 紫外分光光度法测定加味香连丸中黄连生物碱的含量 1 实验项目学时:6 学时 2 实验项目类型: 验证性 综合性实验 3 实验项目内容:1. 利用氧化铝色谱柱净化加味香连丸中黄连生物碱 2. 利用紫外紫外分光光度法测定黄连总生物碱含量 4 实验项目学习要求:( 从运用知识 提高能力两个层次说明学习要求 ) (1) 运用知识 : 掌握用柱层析净化提取物的方法 ; 掌握紫外分光光度法测定复方中某一类物质的方法 (2) 提高能力 : 掌握中药提取 净化操作 ;UV-VIS 规范操作 ; 提高 UV-VIS 法测定中药成分含量的能力 5 主要仪器设备与材料: 1. 紫外 - 可见分光光度计 2. 小层析柱 : 高 13 cm, 内径 8 mm,2 个 3. 中性 Al 2 O 3 ( 目 ) 4. 样品 : 加味香连丸 5. 对照品 : 盐酸小檗碱 6 与理论课程的关系: 本实验是在第四单元含量测定基础知识教学基础上的实验教学 是 UV-VIS 法测定中药成分含量方法的直接应用 是中国药典的主要方法 7 实验步骤 1) 含量测定 : A 样品溶液配制: 取加味香连丸 0.5g, 研成细粉, 精密称取 0.1g( 实验中称取多少写多少 ), 置 60ml 索氏提取器中加 95% 乙醇 40ml 连续回流提取生物碱至无色 将提取液浓缩至 20ml, 定量转移到 25ml 容量瓶中, 用 95% 乙醇至刻度. 精密吸取样品液 1.0ml 通过 Al 2 O 3 柱, 用 95%EtOH 至洗脱完全, 收集洗脱液于 10ml 容量瓶中, 连续加 95% 乙醇至刻度, 于 λmax350nm 处测定吸收度 B 对照品溶液配制用 95% 乙醇溶液, 配制对照品溶液浓度为 0.006mg/ml 5

6 C 含量测定应用外标一点法测定加味香连丸中总生物碱的含量 8 数据处理计算出 100g 加味香连丸中含有盐酸小檗碱多少克? 9 思考题 1) 如何判断生物碱已被提取完全? 2) 以测定小檗碱为例, 除此方法外还有什么测定复方中黄连生物碱的方法? 3) 本实验中测定样品紫外吸收度时, 以什么作为空白对照液? 为什么? ( 三 ) 实验项目三 : 复方丹参滴丸中龙脑的含量测定 1 实验项目学时:6 学时 2 实验项目类型: 验证性 综合性实验 3 实验项目内容: 1. 色谱条件的选择 ; 2. 实验用溶液的配制, 包括内标溶液 对照溶液及样品溶液的配制 ; 3. 利用内标法测定复方丹参滴丸中龙脑的含量 4 实验项目学习要求:( 从运用知识 提高能力两个层次说明学习要求 ) (1) 运用知识 : 掌握气相色谱法测定中药制剂中成分含量的方法和原理 ; 熟悉气相色谱仪进行含量测定的操作过程 熟悉气相色谱仪各种操作条件的选择应用 (2) 提高能力 :GC 的基本操作 仪器条件确定 ; 提高运用 GC 进行药物含量测定的能力 5 主要仪器设备与材料: 1. 安捷伦 气相色谱仪 (FID 检测器 ) 微量进样器; 2.SPB-5 毛细管色谱柱 ( 弱极性 ) 3. 水杨酸甲酯 ( 内标 ) 醋酸乙酯(AR) 4. 龙脑对照品 ( 中国药品生物制品检定所 ) 5. 复方丹参滴丸 ( 天士力有限公司生产 ) 6 与理论课程的关系: 本实验是在第四单元有关气相色谱法教学基础上的实 6

7 验教学 是中药含量测定重要方法的直接应用 是中国药典的主要方法 7 操作步骤 1. 色谱条件采用 SPB-5 毛细管色谱柱 ( 弱极性 ), 柱长 30m, 内径 0.32mm, 液膜厚度 0.25μm, 分流进样 1μL( 分流比 1:20); 柱温 : 初始温度 100, 保持 1min, 以 8 / min 升至 180, 保持 1min; 后进样口温度为 220 ; 前检测器温度为 300 ; 载气为 N 2, 柱前压 100kPa 左右 ;H 2 50kPa; 空气 50kPa;FID 检测器 理论塔板数按龙脑峰计算不低于十万 ;R S >1.5; 对称性因子 T= 校正因子测定内标溶液配制取水杨酸甲酯 125mg, 置 25mL 量瓶中, 加醋酸乙酯至刻度, 制成每 lml 含 5mg 的内标溶液 对照溶液配制取龙脑对照品 5mg, 精密称定, 置 10mL 量瓶中, 加内标溶液至刻度, 摇匀, 作为龙脑对照溶液 测定校正因子取龙脑对照液 1μL 注入气相色谱仪, 测定至少 5 次, 计算校正因子 3. 测定法取合成冰片 5mg, 精密称定, 置 10mL 量瓶中, 加入内标溶液使冰片溶解并稀释至刻度, 摇匀, 吸取 2μL, 注入气相色谱仪, 测定 按内标法计算含量 8 注意事项 1. 实验前, 必须对气相色谱仪整个气路系统进行检漏 如有漏气, 及时处理 2. 开机前先通气, 实验结束, 先降温 关机, 后关气 3. 由于样品中挥发性成分较多, 样品干燥时, 要注意方法和温度 9 思考题 1. 在建立一个中药制剂的测定方法时, 如何进行方法学考察? 2. 研究和设计中药制剂的分析方法时, 应根据哪几方面内容? 7

8 ( 四 ) 实验项目四 : 中药制剂中橙皮苷的含量测定 1 实验项目学时:6 学时 2 实验项目类型: 验证性 综合性实验 3 实验项目内容:1.HPLC 仪器使用及基本操作 ; 2. 色谱条件的选择 ; 3. 实验用溶液的配制, 包括橙皮苷对照品溶液及供试品溶液的制备 ; 4. 利用外标一点法进行定量分析 4 实验项目学习要求:( 从运用知识 提高能力两个层次说明学习要求 ) (1) 运用知识 :HPLC 的具体应用 掌握高效液相色谱仪的的基本操作及定量方法 ; (2) 提高能力 : 提高 HPLC 的基础操作能力 仪器条件选择能力 ; 提高运用 HPLC 进行药物定量分析能力 5 主要仪器设备与材料: 1. 高效液相色谱仪 ( 紫外检测器 ) 2.C18 反相色谱柱 (Hypersil ODS 5 µm 4.6 mm 250 mm); 3. 微量进样器 4. 一次性注射器 µm 微孔滤膜 6. 容量瓶 ml 7. 移液管, 洗耳球 ; 具塞三角瓶 (50 ml); 超声波清洗器 ; 天平 ; 滤纸 培养皿 ; 炮弹管 8. 橙皮苷对照 ( 中国药品生物制品检定所 ) 9. 陈皮 ( 天津市饮片厂 ) 6 与理论课程的关系:: 本实验是在第四单元有关高效液相色谱法教学基础上的实验教学 是中药含量测定重要方法的直接应用 是中国药典的主要方法 7 操作步骤 1) 色谱条件 : 色谱柱 :C 18, mm,5μm; 流动相 :43% 甲醇 ; 柱温 : 室温 ; 流速 :1ml/min; 8

9 检测 :UVD, 波长为 270nm; 进样量 :10μL 理论塔板数 n>3000 2) 橙皮苷对照品溶液的制备及测定 : 取橙皮苷对照品 1.6mg, 加甲醇置 100ml 容量瓶中, 制成 0.016mg/ml 的溶液, 作为对照品溶液 精密吸取 10μL 按上述色谱条件进样, 测定对照品峰面积 3) 供试品溶液的制备 : 取中药复方, 精密称取 0.3g 置锥形瓶中, 加入甲醇 50ml, 加塞称重, 超声提取 15 分钟后继续称重并用甲醇补足减少的重量 用 0.45μm 微孔滤膜过滤, 取续滤液, 作为供试品溶液 4) 测定精密吸取 10μL 供试品溶液, 注入液相色谱仪, 测定供试品中橙皮苷峰面积 5) 计算外标一点法计算 100 克中药复方中含有橙皮苷的克数 (%) ( 五 ) 实验项目五 :HPLC 综合实验 一清颗粒测定 1 实验项目学时:6 学时 2 实验项目类型: 综合性实验 3 实验项目内容:1. 实际运用 HPLC 仪器, 解决实际问题 2. 一清颗粒中黄芩苷的含量测定 4 实验项目学习要求:( 从运用知识 提高能力两个层次说明学习要求 ) (1) 运用知识 : 现代中药分析的特点以及一般程序, 掌握中药分析方法学考察的基本内容 (2) 提高能力 : 提高运用 HPLC 进行药物定量分析能力 5 主要仪器设备与材料: 1. 高效液相色谱仪 ( 紫外检测器 ) 2.C18 反相色谱柱 (Hypersil ODS 5 µm 4.6 mm 250 mm); 3. 微量进样器 4. 一次性注射器 µm 微孔滤膜 6. 容量瓶 ml 9

10 7. 移液管, 洗耳球 ; 具塞三角瓶 (50 ml); 超声波清洗器 ; 天平 ; 滤纸 培养皿 ; 炮弹管 8. 对照品 ( 中国药品生物制品检定所 ) 9. 一清颗粒 ( 自制 ) 6 与理论课程的关系: 本实验是在第四单元有关高效液相色谱法教学基础上的实验教学 是中药含量测定重要方法的直接应用 是中国药典的主要方法 7 实验步骤 1) 色谱条件与系统适用性试验色谱柱 :Hypersil ODS( mm,5 µm) 流动相 : 甲醇 -1% 冰醋酸水溶液 (52:48,v/v) 或 (54:46,v/v) 检测波长 :280 nm 流速 :1 ml/min 柱温 : 室温进样量 :5 μl 按黄芩苷计算理论塔板数不低于 ) 黄芩苷对照品溶液的制备精密称取在 105 干燥至恒重的黄芩苷对照品适量, 用 75% 乙醇配制成浓度为 20.5 µg/ml 的黄芩苷对照品溶液, 于 4 C 保存, 备用 3) 供试品溶液的制备取装量差异项下的内容物, 研细, 取约 0.1 g, 精密称定, 置 50 ml 量瓶中, 加 70% 乙醇 10 ml, 超声处理 20 分钟, 用 70% 乙醇稀释至刻度, 摇匀, 上清液用 0.45 µm 微孔滤膜过滤, 取续滤液, 即得 4) 阴性溶液的制备取不含黄芩的药材粉末照供试品溶液同法制备 5) 测定法分别吸取阴性溶液 对照品溶液与供试品溶液各 5 µl 注入液相色谱仪, 测定, 即得 本品每袋 (7.5 g) 含黄芩以黄芩苷 (C 21 H 18 O 11 ) 计不得少于 30.0 mg 8 黄芩苷含量测定的方法学考察 10

11 8.1 线性关系考察 本实验采用外标一点法, 不做线性考察 8.2 精密度试验 密度 取同一对照品溶液 5 μl 注入高效液相色谱仪, 连续进样 6 次, 考察仪器精 Table 8.1 The results of precision test 测定次数保留时间 (t R ) 峰面积 (A) 峰面积平均值 RSD 重复性试验 取同一批号的一清颗粒供试品, 按照 3.3 项下供试品溶液的配制方法, 平行制备 6 份供试品溶液, 各取 5 μl, 注入高效液相色谱仪, 进样分析, 考察 方法的精密度 Table 8.2 The results of reproducibility test of Baicalin 样品 W 称重 峰面积 黄芩苷含量 含量平均值 RSD 号 (g) (A) (mg/7.5g) (mg/7.5g) (%) 8.4 专属性试验阴性溶液进样分析, 与对照品溶液和供试品溶液色谱图对比, 考察方法专属性 8.5 稳定性试验取同一份供试品溶液, 分别于样品制备后 及 24 h 进样分析 ( 依试验时间而定 ), 考察方法稳定性 11

12 8.6 加样回收试验精密称取已知含量的供试品 6 份 ( 依试验时间而定 ), 按黄芩苷已知量的 1 倍加入对照品, 与 3.3 项同法制备供试品溶液, 在上述色谱条件下进样分析, 计算加样回收率 ( 依试验时间而定 ) 9 一清颗粒中黄芩苷的含量测定( 可用重复性试验结果 ) 取同一批号的一清颗粒供试品, 按照 3) 项下供试品溶液的配制方法, 平行制备 3 份以上样品, 计算每袋 (7.5 g) 中黄芩苷的含量 (mg) ( 本次试验使用重复性试验结果计算一清颗粒中黄芩苷的含量 ) 含量测定结果计算公式 : C X = C R *A X *D*7.5*/(A R *W 称重 *1000) C X :mg/ 袋 (7.5 g) C R : 对照品溶液浓度 (µg/ml) A R : 对照品溶液黄芩苷峰面积 A X : 供试品溶液黄芩苷峰面积 D: 供试品溶液体积 ( 本次试验为 50 ml) W 称重 : 供试品实际称重量 ( 六 ) 实验项目六 :HPLC 综合实验 一清颗粒测定 1 实验项目学时:6 学时 2 实验项目类型: 综合性实验 3 实验项目内容:1. 实际运用 HPLC 仪器, 解决实际问题 2. 一清颗粒中黄芩苷的含量测定 4 实验项目学习要求:( 从运用知识 提高能力两个层次说明学习要求 ) (1) 运用知识 : 现代中药分析的特点以及一般程序, 掌握中药分析方法学考察的基本内容 (2) 提高能力 : 提高运用 HPLC 进行药物定量分析能力 5 主要仪器设备与材料: 1. 高效液相色谱仪 ( 紫外检测器 ) 2.C18 反相色谱柱 (Hypersil ODS 5 µm 4.6 mm 250 mm); 12

13 3. 微量进样器 4. 一次性注射器 µm 微孔滤膜 6. 容量瓶 ml 7. 移液管, 洗耳球 ; 具塞三角瓶 (50 ml); 超声波清洗器 ; 天平 ; 滤纸 培养皿 ; 炮弹管 8. 对照品 ( 中国药品生物制品检定所 ) 9. 一清颗粒 ( 自制 ) 6 与理论课程的关系: 本实验是在第四单元有关高效液相色谱法教学基础上的实验教学 是中药含量测定重要方法的直接应用 是中国药典的主要方法 实验步骤及结果计算同实验项目五 四 实验考核 ( 一 ) 实验考核项目和比例 : 实验考核成绩由每次试验的预习报告 实验操作 实验报告完成情况 次数及其质量确定 ; 实验缺勤 1/3, 实验成绩以零分记并取消参加考试资格 ( 二 ) 考核项目评分依据 : 序 项目成绩说明 号 1 课前预习 10% 实验前必须写出报告并查考实验中涉及的基本内 容 操及操作注意事项, 经教师检查, 方可参加 实验 2 实验操作 20% 3 原始数据 5% 指导老师签字 4 实验报告 20% 要求独立完成报告, 若发现抄袭, 均按不及格处 理 5 数据处理 10% 独立完成数据处理 绘图等 6 现象观察与讨 论 25% 对实验中观察到的现象做必要的分析 讨论 得 出结论 7 思考题 10% 要求完成实验后的思考题 13

14 ( 三 ) 实验考核结果反馈 :1 反馈实验考核项目学生成绩 ;2 反馈学生操作 讨论 实验报告的质量以及提高建议 张玉萍

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