中图分类号 :R 文献标志码 :B 文章编号 : (2012) Determination of Content and Related Substances of Methylparaben Sodium by HPLC ZHENG Jinqi,

Size: px

Start display at page:

Download "中图分类号 :R 文献标志码 :B 文章编号 : (2012) Determination of Content and Related Substances of Methylparaben Sodium by HPLC ZHENG Jinqi,"

耸巴
5 years ago
Views:

1 HPLC 测定对羟基苯甲酸甲酯钠的含量及有关物质郑金琪, 韩加怡, 李会林 ( 浙江省食品药品检验所, 杭州 ) 摘要 : 目的建立对羟基苯甲酸甲酯钠的含量测定及有关物质检查方法方法采用高效液相色谱法, 色谱柱为 Shim-pack VP-ODS C 18 柱 (250 mm 4.6 mm,5 m), 以甲醇 -1% 醋酸溶液 (60 40) 为流动相, 流速 1.0 ml min 1, 柱温 35, 波长 254 nm 结果对羟基苯甲酸甲酯与各主要杂质及强制破坏产生的降解产物的杂质峰均分离良好, 对羟基苯甲酸甲酯在 21.64~194.8 g ml 1 内与峰面积呈良好线性关系,r=1.000, 回收率为 99.5%(RSD=0.64%,n=9), 最低检出限为 ng; 供试品溶液在 24 h 内稳定结论本法专属性强, 准确灵敏, 方法可靠, 可用于对羟基苯甲酸甲酯钠的含量测定和有关物质检查关键词 : 对羟基苯甲酸甲酯钠 ; 含量测定 ; 有关物质 ; 高效液相色谱法作者简介 : 郑金琪, 男, 硕士, 主管药师 Tel: (0571) jingqizheng@hotmail.com 72 Chin JMAP, 2012 January, Vol.29 No.1 中国现代应用药学 2012 年 1 月第 29 卷第 1 期

2 中图分类号 :R 文献标志码 :B 文章编号 : (2012) Determination of Content and Related Substances of Methylparaben Sodium by HPLC ZHENG Jinqi, HAN Jiayi, LI Huilin(Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou , China) ABSTRACT: OBJECTIVE To establish a method to determine the content and related substances of methylparaben sodium. METHODS HPLC was adopted on a Shim-pack VP-ODS C 18 column (250 mm 4.6 mm, 5 μm) using an isocratic mobile phase consisting of methanol-0.1% acetic acid solution (60 40) with a flow rate of 1.0 ml min 1. The column temperature was kept at 35 and the detection wavelength was set at 254 nm. RESULTS The separation of methyl parahydroxybenzoate and other impurities was achieved within four times of the major peak retention time. The concentration-response relationship was linear over the range of g ml 1 (r=1.000). The average recovery was 99.5%(RSD=0.64%, n=9) and the limit of detection was ng. The solution was stable for 24 h. CONCLUSION The method is specific, accurate, sensitive and suitable for the determination of content and related substances of methylparaben sodium. KEY WORDS: methylparaben sodium; content determination; related substances; HPLC 对羟基苯甲酸甲酯钠 (methylparaben sodium) 是水溶性防腐剂, 主要特点是安全高效广谱抗菌, 广泛应用于医药工业食品工业纺织工业以及其他如化妆品饲料日用工业品 [1-2] 对羟基苯甲酸甲酯钠由对羟基苯甲酸甲酯和氢氧化钠水溶液反应制得 [1], 生产过程中可能产生副产物对羟基苯甲酸 ; 贮藏过程中亦可能水解生成降解产物对羟基苯甲酸虽然对羟基苯甲酸亦为防腐剂, 但增加了本品的毒性 [3-5] 国外药典采用 TLC 测定本品的有关物质, 操作复杂灵敏度低 ; 采用化学滴定法测定本品含量, 若本品的纯度不高, 含量测定结果易受样品中可能含有的杂质对羟基苯甲酸及本品同系物的干扰国内外未有文献报道采用 HPLC 测定本品的有关物质本试验首次建立了 HPLC 测定本品含量和有关物质的方法, 测得的结果准确可靠 1 仪器与试药 Waters 高效液相色谱仪 (2695 泵,2996 二极管阵列紫外检测器, 美国 Waters 公司 ), 操作软件为 Empower 色谱工作站对羟基苯甲酸甲酯对照品 ( 批号 : ) 对羟基苯甲酸乙酯对照品( 批号 : ) 对羟基苯甲酸丙酯对照品( 批号 : ) 和对羟基苯甲酸丁酯对照品 ( 批号 : ) 均由中国药品生物制品检定所提供, 纯度均为 100%; 对羟基苯甲酸 ( 国药集团化学试剂有限公司, 批号 :T , 分析纯 ); 对羟基苯甲酸甲酯钠 ( 批号 : , , ) 由国内某化工厂提供甲醇为色谱纯, 水为重蒸水, 其余试剂均为分析纯 2 方法与结果 2.1 色谱条件及测定方法色谱柱 :Shim-pack VP-ODS C 18 柱 (4.6 mm 250 mm,5 μm); 流动相 : 甲醇 -1% 醋酸溶液 (60 40); 检测波长 :254 nm; 流速 :1.0 ml min 1 分别取对照品溶液和供试品溶液各 20 μl, 注入液相色谱仪, 按外标法以峰面积计算对羟基苯甲酸甲酯的含量, 并将结果乘以 1.144, 得对羟基苯甲酸甲酯钠的含量 2.2 溶液的制备供试品溶液的制备取本品约 11 mg, 精密称定, 置 100 ml 量瓶中, 加流动相溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为供试品溶液对照品溶液的制备取对羟基苯甲酸甲酯对照品约 10 mg, 精密称定, 置 100 ml 量瓶中, 加流动相溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为对照品溶液 2.3 专属性试验各杂质的分离及最低检出限本品为对羟基苯甲酸甲酯与氢氧化钠水溶液反应制得, 可能产生的副产物是对羟基苯甲酸, 原料对羟基苯甲酸甲酯中可能带来的杂质是对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯取对羟基苯甲酸对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯各适量, 用流动相配制成浓度各约为 10 g ml 1 的混合溶液, 按 2.1 项下色谱条件进样, 结果见图 1-A 各已知物质峰之间的分离度均大于 1.5, 理中国现代应用药学 2012 年 1 月第 29 卷第 1 期 Chin JMAP, 2012 January, Vol.29 No.1 73

3 论板数按对羟基苯甲酸甲酯峰计算大于取上述溶液采用逐步稀释的方法, 得对羟基苯甲酸对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯的检出限分别为 , , , ,1.066 ng(s/n 3) 上述各成分相对样品的最低检出均 0.01% 强酸破坏试验取对羟基苯甲酸甲酯钠约 100 mg, 置 100 ml 量瓶中, 加流动相 10 ml 使溶解, 加 3.0 mol L 1 盐酸溶液 5.0 ml, 放置 24 h, 用 3.0 mol L 1 氢氧化钠溶液调节 ph 至中性, 用流动相稀释至刻度, 摇匀, 取 20 μl 进样, 结果见图 1-B 强碱破坏试验取对羟基苯甲酸甲酯钠约 100 mg, 置 100 ml 量瓶中, 加流动相 10 ml 使溶解, 加 0.3 mol L 1 氢氧化钠溶液 5.0 ml, 放置 2 h, 用 0.3 mol L 1 盐酸溶液调节 ph 至中性, 用流动相稀释至刻度, 摇匀, 取 20 μl 进样, 结果见图 1-C 热破坏试验取对羟基苯甲酸甲酯钠约 100 mg, 置 100 ml 量瓶中, 加流动相 75 ml 使溶解, 在 80 水浴中加热 6 h, 冷却至室温, 用流动相稀释至刻度, 摇匀, 取 20 μl 进样, 结果见图 1-D 氧化破坏试验取对羟基苯甲酸甲酯钠约 100 mg, 置 100 ml 量瓶中, 加流动相 10 ml 使溶解, 加 30% 过氧化氢溶液 5.0 ml, 放置 24 h, 用流动相稀释至刻度, 摇匀, 取 20 μl 进样, 结果见图 1-E 光破坏试验取对羟基苯甲酸甲酯钠约 100 mg, 置 100 ml 量瓶中, 加流动相 75 ml 使溶解, 在 (4 500±500)Lx 照度下放置 24 h, 用流动相稀释至刻度, 摇匀, 取 20 μl 进样, 结果见图 1-F 图 1 专属性试验图谱 A 对羟基苯甲酸甲酯和各主要杂质 ;B 强酸破坏 ;C 强碱破坏 ;D 热破坏 ;E 氧化破坏 ;F 强光破坏 1 对羟基苯甲酸 ;2 对羟基苯甲酸甲酯 ;3 对羟基苯甲酸乙酯 ;4 对羟基苯甲酸丙酯 ;5 对羟基苯甲酸丁酯 Fig 1 Chromatograms of specificity test of methylparaben sodium A Methyl parahydroxybenzoate and other mainly impurities; B treated with 1.0 mol L 1 HCl; C treated with 0.1 mol L 1 NaOH; D treated with heat; E treated with 10% H 2 O 2 ; F treated with strong light 1 ρ-hydroxybenzcic acid; 2 methyl parahydroxybenzoate; 3 ethyl parahydroxybenzoate; 4 propyl parahydroxy benzoate; 5 butyl parahydroxybenzoate 2.4 线性关系考察取对羟基苯甲酸甲酯对照品约 50 mg, 精密称定, 置 50 ml 量瓶中, 加流动相溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为标准贮备液分别精密量取该溶液 0.2,0.5,0.8,1.0,1.2,1.5,1.8 ml 置 10 ml 量瓶中, 用流动相稀释至刻度, 摇匀, 分别取上述溶液 20 μl 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 以浓度 C( g ml 1 ) 对峰面积 A 作标准曲线, 线性回归方程为 :A= C ,r=1.000 由此可见对羟基苯甲酸甲酯浓度在 21.64~194.8 g ml 1 范围内, 与峰面积呈良好的线性关系 2.5 回收率试验取批号为的样品各约 4.4 mg, 分别置 9 个 100 ml 量瓶中, 分别加入一定量对羟基苯甲酸甲酯对照品各 3 份, 按 2.2 项下方法分别配制成低中高 3 种不同浓度的溶液 (80%,100%,120%) 各 3 份, 分别取上述溶液 20 μl, 注入液相色谱仪, 以外标法测定并计算含量, 平均回收率与 RSD 值分别为 99.5% 和 0.64% 结果见表 1 74 Chin JMAP, 2012 January, Vol.29 No.1 中国现代应用药学 2012 年 1 月第 29 卷第 1 期

4 表 1 回收率试验结果 Tab 1 Results of recovery test 浓度加入量 / mg 样品量 / mg 回收率 / % 平均回收率 /% 低总平均回收率 /% RSD/% 表 2 对羟基苯甲酸甲酯钠含量及有关物质测定结果 (n=2) Tab 2 Determination results of contents and related substances of methylparaben sodium(n=2) 有关物质 /% 样品批号含量 /% 对羟基苯甲酸其他杂质中高仪器精密度试验取对羟基苯甲酸甲酯对照品溶液, 连续重复进样 6 次, 结果 RSD 为 0.07% 2.7 重复性试验取批号为的样品, 连续测定含量 6 次, 进行重复性实验,RSD 为 0.62% 2.8 稳定性试验取批号为的供试品溶液分别在 0,1, 3,6,12,24 h 进样, 记录液相色谱图, 结果不同时间色谱峰面积一致,RSD 为 0.72%, 表明供试品溶液在室温条件下放置 24 h 内稳定 2.9 有关物质检查取本品适量, 用流动相溶解并稀释制成每 1 ml 中含 1.0 mg 的溶液, 作为供试品溶液精密量取适量上述溶液, 用流动相稀释制成每 1 ml 中含 10 µg 的溶液, 作为对照溶液 ; 取对羟基苯甲酸对照品适量, 加流动相溶解并稀释制成每 1 ml 中含 40 µg 的溶液, 作为对照品溶液精密量取对照溶液 20 µl, 注入液相色谱仪, 调节检测灵敏度, 使主成分色谱峰的峰高约为满量程的 20% 再分别精密量取对照溶液对照品溶液与供试品溶液各 20 µl, 分别注入液相色谱仪, 记录色谱图至主成分峰保留时间的 4 倍供试品溶液的色谱图中如显杂质峰, 杂质对羟基苯甲酸不得过 4.0%, 其他杂质不得过 0.5% 2.10 样品测定取对羟基苯甲酸甲酯钠样品, 按 2.2 及 2.8 项下制备供试品溶液, 测定含量和有关物质, 结果见表 2 和图 2 图 2 对羟基苯甲酸甲酯钠有关物质的 HPLC 色谱图 1 对羟基苯甲酸 ;2 对羟基苯甲酸甲酯 ;3,4,5 杂质 Fig 2 HPLC chromatogram of related substances of methylparaben sodium 1 ρ-hydroxybenzcic acid; 2 methyl parahydroxybenzoate; 3,4,5 impurity 3 讨论 3.1 色谱方法的选择 [6] 周晶等采用气相色谱法测定食品中对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯, 因食品中对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯均以钠盐的形式存在, 而钠盐的熔点很高, 很难气化, 故在样品处理过程中进行酸化和提取处理, 操作复杂, [7] 实验影响因素多张春泓等采用 HPLC 同时测定阿达帕林凝胶剂中主药阿达帕林和两种防腐剂苯氧乙醇和对羟基苯甲酸甲酯, 使用四氢呋喃乙睛和 0.02 mol L 1 醋酸盐缓冲液 (ph 3.0) 为流动相, 采用线性梯度洗脱本实验参考文献 [8], 使用甲醇 -1% 醋酸溶液 (60 40) 为流动相, 流速 1.0 ml min 1, 避免使用了毒性和环境污染均较大的四氢呋喃, 简化了流动相, 同时对对羟基苯甲酸甲酯钠直接进行测定, 简化了实验操作, 提高了实验准确度 3.2 测定波长的选择由结构分析可知, 对羟基苯甲酸对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯的基本结构是一个苯环, 亦是产生紫外吸收的基本基团通过 PDA 检测, 分别在线提取紫外图谱, 对羟基苯甲酸对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸中国现代应用药学 2012 年 1 月第 29 卷第 1 期 Chin JMAP, 2012 January, Vol.29 No.1 75

5 丙酯和对羟基苯甲酸丁酯均在 254 nm 波长附近有最大吸收专属性试验中, 记录强制破坏试验样品的三维液相色谱图, 各降解产物均在 254 nm 波长处有较大吸收, 各降解产物能够得到有效分离和检测, 故选择 254 nm 作为检测波长 3.3 折算系数的确定本方法的流动相为甲醇 -1% 醋酸溶液 (60 40), 偏酸性,pH 值约为 3, 对羟基苯甲酸甲酯钠在流动相中以对羟基苯甲酸甲酯的分子形式存在含量测定时使用的是对羟基苯甲酸甲酯对照品, 按外标法以峰面积计算后的结果乘以对羟基苯甲酸甲酯钠与对羟基苯甲酸甲酯的分子量比值 1.144, 即得本品的含量 3.4 有关物质限度的确定及样品质量的探讨取对羟基苯甲酸对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯 5 个化合物配制成浓度均约为 10 g ml 1 的混合溶液, 测定相对响应因子 ( 折算成相同浓度下的峰面积比值 ), 结果对羟基苯甲酸对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯与对羟基苯甲酸甲酯的相对响应因子为 0.8~1.2, 灵敏度相近故采用自身对照法测定有关物质考虑到对羟基苯甲酸是合成过程中的副产物, 且在样品放置过程中亦可能产生, 同时与主药的化学结构相近, 故采用外标对照品法测定, 同时对系统适用性进行考察参考国外药典 [3-4], 限度订为对羟基苯甲酸不得过 4.0%, 其他杂质不得过 0.5% 采用本实验建立的 HPLC 对国内某化工厂生产的 3 批对羟基苯甲酸甲酯钠进行了有关物质测定, 结果有关物质为 4.96%~5.17%, 其中含对羟基苯甲酸为 4.90%~5.13%, 其他杂质均小于 0.10%, 样品中均检出对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯, 均未检出对羟基苯甲酸丁酯 ; 同时进行了外标对照品法含量测定, 结果为 93.3%~ 94.1%, 有关物质和含量测定结果一致, 均不符合规定笔者对中检所提供的对羟基苯甲酸甲酯对照品进行了有关物质考察, 结果含对羟基苯甲酸为 0.76%, 总杂质为 0.78% 由此可知, 样品中的有关物质大大偏高, 样品可能发生水解, 同厂家联系后分析认为, 主要是生产过程中对羟基苯甲酸甲酯钠水解生成, 其次是样品在放置过程中产生 3.5 化学滴定法和 HPLC 测定含量的比较 [3-5] 国外药典均采用化学滴定法测定本品的含量,USP32-NF27 [5] 采用对羟基苯甲酸甲酯钠经皂化后与 Br 2 作用生成稳定的三溴苯酚沉淀, 多余的 Br 2 与 KI 作用置换出相当量的 I 2, 再用 Na 2 S 2 O 3 滴定液滴定, 操作复杂繁琐, 测定的目标物为对羟基苯甲酸钠而非对羟基苯甲酸甲酯钠, 容易引入偏差 EP6.0 [3] 和 BP2009 [4] 均采用非水滴定法直接测定, 方法简单易行, 准确, 可操作性强笔者使用非水滴定法对对羟基苯甲酸甲酯钠进行了含量测定, 结果本品的含量为 106.7%~107.4%, 样品纯度不高, 含量测定易受干扰 ( 主要是把杂质对羟基苯甲酸误认为是对羟基苯甲酸甲酯钠 ) HPLC 具有分离分析的作用, 简化了实验操作, 排除了杂质干扰, 提高了实验的准确度本试验首次建立了 HPLC 测定对羟基苯甲酸甲酯钠的含量及有关物质的方法, 能有效地控制对羟基苯甲酸甲酯钠的有关物质, 准确地测定对羟基苯甲酸甲酯钠的含量, 该方法为制订对羟基苯甲酸甲酯钠的国家辅料标准奠定了基础, 同时有助于控制对羟基苯甲酸甲酯钠的质量, 保障人民群众的饮食用药安全 REFERENCES [1] WAN S Y, L L, WANG H J. Food Antisepsis and Food Additive of Antiseptic( 食品防腐和食品防腐剂 ) [M]. Beijing: China Light Industry Press, 1998: 3. [2] Fransén N, Morin M, Björk E, et al. Physicochemical interactions between drugs and superdisintegrants [J]. J Pharm Pharmacol, 2008, 60(12): [3] EP 6.0 [S]. 2008: [4] BP [S]. 2009: [5] USP32 [S]. 2009: [6] ZHOU J, DAI F R, LI Y J. Simultaneous determination of nipagin and nipasol in food with gas spectrometry [J]. Occup Health( 职业与健康 ), 2005, 21(1): [7] ZHANG C H, ZHAO Y C, HAN C H, et al. Simultaneous determination of adapalene, 2-phenoxyethanol and methyl-4-hydroxybenzoate in adapalene gels using high performance liquid chromatography [J]. Chin J Chromatogr( 色谱 ), 2008, 26(5): [8] YUAN Y Z, QIAN W, HUANG M W, et al. Determination of related substance in methyparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben by HPLC [J]. Drug Stand China( 中国药品标准 ), 2008, 9(1): 收稿日期 : Chin JMAP, 2012 January, Vol.29 No.1 中国现代应用药学 2012 年 1 月第 29 卷第 1 期

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.