Bp211D 分析天平 ;YIY ul300w C 型超声波清洗机机 ( 上海艺源超声设备有限公司 );CAMAG TLC VISUALIZER 薄层色谱成像系统 1 2 试药超纯水 色谱乙腈 (Honeywel,HPLCGrade); 薄层层析用硅胶 G( 青岛海洋化工厂生产, 化学纯 ); 其他

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1 年 月 第 卷 第 期 中国现代中药 M C M S V N 中药工业 补肾蠲毒丸质量标准研究 盛晓静 周鹤 赖杰仁 九江市食品药品检验所 江西 九江 九江市中医医院 江西 九江 摘要 目的 建立补肾蠲毒丸的质量控制标准 方法 采用显微鉴别法对山药 苦参 僵蚕 郁金进行定性 蒸发光散射检测法 HPLC 鉴别 采用薄层色谱法对菟丝子 虎杖 黄芩 赤芍进行定性鉴别 采用高效液相色谱 D 测定黄芪甲苷的含量 结果 本品显微鉴别特征明显 薄层色谱定性鉴别斑点清晰 专属性强 含量测定方 μ呈 良 好 线 性 关 系 相 关 系 数 平 均 回 收 率 为 法中 黄芪甲苷的量 在 结论 所建立的方法准确可靠 易于操作 可用于补肾蠲毒丸的质量控制 关键词 补肾蠲毒丸 质量标准 显微鉴别 薄层色谱法 高效液相色谱 蒸发光散射检测法 S Q S B J P S HENGX ZHOUH LAIJ J I F D C J J C J C H T C M J J C O T q B J P M T D R z A S F R B m B C m R w m T m C S m P C R z m R S R P R R w TLC w m HPLC DR T m w TLC w I m m w μ T w C T m q B J K w B J P q m TLC HPLC D 补肾蠲毒丸是在九江市中医医院肝病科邹必英 副主任医师的经验方基础上制成的中药浓缩丸 制剂处方以菟丝子 枸杞子 巴戟天 肉苁蓉 提取浓缩 具有药效缓和 作用持久 服用方便 利于携带等优点 为了有效控制制剂质量 本研究 建立了山药 苦参 僵蚕 郁金 菟丝子 虎杖 为君 补肾益精健脾 以虎杖 黄芩 胡黄连 青 黄芩 赤 芍 的 定 性 鉴 别 及 黄 芪 甲 苷 的 含 量 测 定 蒿 苦参为臣 清 热 化 湿 蠲 毒 配 以 黄 芪 山 药 方法 生麦芽 益 气 健 脾 助 运 郁 金 皂 角 刺 解 郁 行 气 化 仪器与试药 瘀 赤芍 僵蚕凉血 止 痛 散 结 全 方 味 补 泻 同 用 温凉并 施 益 阳 扶 正 不 碍 邪 达 蠲 邪 毒 不 伤 仪器 正 具补肾健脾 清化湿热的功能 临床用于脾肾 OLYMPUSCX三目显微镜 W 高效液相 阳虚兼夹湿热型慢性乙肝 乙肝病毒携带者的治疗 色谱仪 分离模块 检测器 m w 工 多年 效果 显 著 制 成 的 补 肾 蠲 毒 丸 除 山 药 郁 作站 TU 型 双 光 束 紫 外 可 见 光 分 光 光 度 计 金 苦参 僵蚕以原 粉 入 药 外 其 余 味 均 经 过 北 京 普 析 通 用 仪 器 有 限 责 任 公 司 S 基金项目 九江市社会发展与软科学类科研计划项目 九科字 号 通信作者 盛晓静 副主任中药师 研究方向 中药质量分析 T L E m L m

2 Bp211D 分析天平 ;YIY ul300w C 型超声波清洗机机 ( 上海艺源超声设备有限公司 );CAMAG TLC VISUALIZER 薄层色谱成像系统 1 2 试药超纯水 色谱乙腈 (Honeywel,HPLCGrade); 薄层层析用硅胶 G( 青岛海洋化工厂生产, 化学纯 ); 其他试剂均为分析纯 ; 菟丝子对照药材 大黄素对照品 黄芩苷对照品 芍药苷对照品 黄芪甲苷对照品 ( 中国食品药品检定研究院, 批号分别为 , 其中黄芪甲苷对照品含量以 95 8% 计 ); 补肾蠲毒丸 ( 九江市中医医院制剂室, 批号分别为 ) 2 方法与结果 2 1 显微鉴别本品粉末棕褐色 草酸钙针晶束存在于黏液细胞中, 针晶长 80~240μm, 粗 2~5μm( 山药 ); 纤维束周围的细胞中含草酸钙方晶, 形成晶纤维, 含晶细胞的壁不均匀木化增厚 ( 苦参 ); 菌丝体存在于体壁或淡棕色 半透明结晶块中, 菌丝近无色, 细长, 直径 1~5μm, 相互盘缠交织 ( 僵蚕 ); 含糊化淀粉粒的薄壁细胞单个散在或数个相连 ( 郁金 ) [1-2] 见图 1 注 :A 草酸钙针晶束 ( 山药 );B 晶纤维 ( 苦参 );C 菌丝体 ( 僵蚕 );D 含糊化淀粉粒的薄壁细胞 ( 郁金 ) 图 1 补肾蠲毒丸粉末显微特征图 (10 40 倍 ) 2 2 薄层色谱鉴别 菟丝子的鉴别取补肾蠲毒丸样品 2g, 研细, 加水 30mL, 搅匀, 用脱脂棉滤过, 滤液置分液漏斗中, 加石油醚 (30~60 )30mL, 振摇提取, 弃去石油醚提取液, 加乙酸乙酯振摇提取 2 次, 每次 30mL, 合并乙酸乙酯提取液, 蒸干, 残渣加甲醇 2mL 使溶解, 作为供试品溶液 另取菟丝子对照药材 0 5g, 加水 30mL, 煎煮 30min, 放冷, 滤过, 1306 滤液置分液漏斗中, 同法制成对照药材溶液 再取缺菟丝子阴性对照样品 2g, 与供试品溶液的制备方法同法制得阴性对照样品溶液 吸取上述 3 种溶液各 5μL, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以乙酸乙酯 甲酸 水 (10 1 2) 的上层溶液为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 置紫外灯 (365nm) 下检视 供试品色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上, 显相同颜色的荧光斑点, 阴性对照样品无干扰 [3] 见图 2

3 注 :1~3 补肾蠲毒丸样品 ;4 菟丝子对照药材 ;5 缺菟丝子的阴性对照 图 2 补肾蠲毒丸中菟丝子 TLC 鉴别图 供试品溶液 另取大黄素对照品, 加甲醇制成质量浓度为 1mg ml -1 的溶液, 作为对照品溶液 再取缺虎杖的阴性对照样品 5g, 与供试品溶液的制备方法同法制得阴性对照样品溶液 吸取上述供试品溶液及阴性对照样品溶液各 5μL 对照品溶液 2μL, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以石油醚 (30~ 60 ) 甲酸乙酯 甲酸 (15 5 1) 的上层溶液为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 置氨气中熏至斑点显色清晰 供试品色谱中, 在与对照品色谱相应的位置上, 显相同颜色的斑点, 阴性对照样品无干扰 [4] 见图 黄芩的鉴别取补肾蠲毒丸样品 5g, 研细, 加乙酸乙酯 甲醇 (3 1) 的混合溶液 30mL, 加热回流 30min, 放冷, 滤过, 滤液蒸干, 残渣加甲醇 1mL 使溶解, 作为供试品溶液 另取黄芩苷对照品, 加甲醇制成质量浓度为 1mg ml -1 的溶液, 作为对照品溶液 再取缺黄芩的阴性对照样品 5g, 与供试品溶液的制备方法同法制得阴性对照样品溶液 吸取上述 3 种溶液各 5μL, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以乙酸乙酯 丁酮 甲酸 水 ( ) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以 5% 三氯化铁乙醇溶液 供试品色谱中, 在与对照品色谱相应的位置上, 显相同颜色的斑点, 阴性对照样品无干扰 [5] 见图 4 注 :1~3 补肾蠲毒丸样品 ;4 大黄素对照品 ; 5 缺虎杖的阴性对照 图 3 补肾蠲毒丸中虎杖 TLC 鉴别图 虎杖的鉴别取补肾蠲毒丸样品 5g, 研细, 加甲醇 30mL, 超声处理 30min, 滤过, 滤液蒸干, 残渣加水 20mL 使溶解, 再加盐酸 2mL, 水浴加热 30min, 放冷, 用乙醚振摇提取 3 次, 每次 15mL, 合并乙醚液, 蒸干, 残渣加甲醇 1mL 使溶解, 作为 注 :1~3 补肾蠲毒丸样品 ;4 黄芩苷对照品 ; 5 缺黄芩的阴性对照 图 4 补肾蠲毒丸中黄芩 TLC 鉴别图 1307

4 2 2 4 赤芍的鉴别取补肾蠲毒丸样品 5g, 研细, 加甲醇 30mL, 超声处理 30min, 滤过, 滤液蒸干, 残渣加水 20mL 使溶解, 用水饱和的正丁醇振摇提取 3 次, 每次 20mL, 合并正丁醇液, 用正丁醇饱和的水洗涤 3 次, 每次 20mL, 取正丁醇液蒸干, 残渣加甲醇 2mL 使溶解, 作为供试品溶液 另取芍药苷对照品, 加甲醇制成质量浓度为 1mg ml -1 的溶液, 作为对照品溶液 再取缺赤芍的阴性对照样品 5g, 与供试品溶液的制备方法同法制得阴性对照样品溶液 吸取上述 3 种溶液各 5μL, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以三氯甲烷 甲醇 水 (13 7 2) 的下层溶液为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以 5% 香草醛硫酸溶液, 在 105 加热至斑点显色清晰 供试品色谱中, 在与对照品色谱相应的位置上, 显相同颜色的斑点, 阴性对照样品无干扰 [6 7] 见图 5 注 :1~3 补肾蠲毒丸样品 ;4 芍药 ; 苷对照品 ;5 缺赤芍的阴性对照 图 5 补肾蠲毒丸中赤芍 TLC 鉴别图 2 3 含量测定 色谱条件与系统适用性试验色谱柱 :Ther moscientifichypersilgold(250mm 4 6mm, 5μm); 柱温 :25 ; 流动相为乙腈 水 (31 69V/V); 流速 :1 0mL min -1 ; 蒸发光散射检测器 : 雾化器温度 35 ; 漂移管温度 80 ; 载气 N 2 ; 气体压力 0 207MPa 理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于 对照品溶液的制备取黄芪甲苷对照品适量, 精密称定, 加甲醇制成质量浓度为 0 13mg ml -1 的溶液, 即得 供试品溶液的制备取本品适量, 研细, 取约 10 g, 精密称定, 置索氏提取器中, 加甲醇 100mL, 加热回流提取 6h, 提取液回收溶剂并浓缩至干, 残渣加水 25mL, 微热使溶解, 用水饱和的正丁醇振摇提取 4 次, 每次 25mL, 合并正丁醇提取液, 用浓氨试液洗涤 2 次, 每次 25mL, 浓氨试液再用水饱和的正丁醇 25mL 提取, 合并正丁醇提取液, 回收正丁醇至干, 残渣用甲醇溶解并转移至 10mL 量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得 [8] 测定方法分别精密吸取对照品溶液 10 20μL, 供试品溶液 10μL, 注入液相色谱仪, 测定, 用外标两点法对数方程计算, 即得 阴性对照试验取按照本品制剂处方及生产工艺要求制备的缺黄芪的阴性样品, 按 项下供试品溶液的制备方法处理, 即得缺黄芪的阴性对照样品溶液, 分别精密吸取对照品溶液 供试品溶液及阴性对照样品溶液各 10μL 进行高效液相色谱试验, 所得阴性对照色谱图中, 在补肾蠲毒丸色谱图中黄芪甲苷的出峰位置上未出现色谱峰, 表明处方中其他药材对黄芪甲苷的含量测定无干扰 见图 线性关系的考察精密吸取黄芪甲苷对照品溶液 ( mg ml -1 ) μL, 分别注入液相色谱仪, 测定其峰面积, 以黄芪甲苷进样量的常用对数为横坐标, 以峰面积的常用对数为纵坐标, 绘制标准曲线, 计算回归方程 : Y=1 633X+6 516,r= 结果表明, 黄芪甲苷的进样量在 ~3 1500μg 呈良好的线性关系 精密度试验精密吸取同一对照品溶液 10μL, 重复进样 6 次, 按 项下色谱条件, 测定峰面积分别为 , 对应的常用对数值分别为 ,RSD 为 0 16%, 结果表明仪器的精密度良好 稳定性试验精密吸取供试品溶液 10μL, 分别于 h, 注入高效液相色谱仪, 测定黄芪甲苷含量,RSD 为 0 60%, 结果表明供试品溶液在 24h 内稳定

5 注 :A 黄芪甲苷对照品 ;B 样品 ;C 阴性对照品 ;1 黄芪甲苷 图 6 黄芪甲苷对照品 样品及阴性对照品 HPLC 图 重复性试验取同一批号样品 ( )6 份, 按 项下方法平行操作后, 分别测定黄芪甲苷含量, 结果含量平均值为 mg g -1, RSD 为 1 39% 结果表明, 在同一条件下,6 次测得样品黄芪甲苷含量一致 回收率试验采用加样回收法, 精密称取已知含量的补肾蠲毒丸样品 ( )6 份, 分别精密添加一定量的黄芪甲苷对照品, 按 项下方法制成供试品溶液, 各取 10μL 进样, 测定黄芪甲苷含量, 结果见表

6 年 月 第 卷 第 期 中国现代中药 M C M S V N 表 补肾蠲毒丸中黄芪甲苷回收率测定 序号 样品中含量 m 对照品添加量 m 测得量 m 回收率 平均回收率 RSD 样品测定 取 批样品 按上述色谱条件和 别考察了索氏提取 后萃取 次以及索氏提 方法测定黄芪甲苷的含量 测定结果见表 取后萃取 次的含量测定值 结果显示索 氏提取 后萃取 次已经能够充分提取待测成分 表 批补肾蠲毒丸含量测定结果 m 在实验过程中 还参考文献方法 对处方中 批号 黄芪甲苷含量 批号 黄芪甲苷含量 黄芪 枸杞子进行了薄层色谱研究 结果在与对照 药材色谱相应的位置上 缺黄芪的阴性对照样品除 黄芪甲苷外 其他主斑点均有干扰 缺枸杞子的阴 性对照样品主斑点有干扰 未能进行定性鉴别 参考文献 徐国均 徐珞珊 刘柏英 等 中药材粉末显微鉴定 M 讨论 补肾蠲毒丸处方配伍 味 其中山药 苦参 僵蚕 郁金 味以药材原粉入药 采用显微鉴别法 简单易行 可有效定性鉴别 通过薄层色谱法实验 研究 菟丝子 虎杖 黄芩 赤芍均可采用适宜的 提取方法和展开系统进行定性鉴别 且薄层色谱斑 点明显 阴性对照无干扰 考虑到本品重用黄芪补气 利水 用量占处方 总药量的 我们研究了采用高效液相色谱法 测定黄芪甲苷的含量 取黄芪甲苷对照品溶液进行 紫外光谱扫描 结果最大吸收峰在 m波长处属 于末端吸收 故选择用蒸发光散射检测器 D 进 北京 人民卫生出版社 陈俊华 舒光明 姜荣兰 中药粉末显微鉴别手册 第一 卷 M 重庆 四川省中药研究所 彭维 郑文燕 苏畅 等 安神补心颗粒质量标准提高研 中药材 究究 J 国家药典委员会 中华人民共和国药典 一部 S 北 京 中国医药科技出版社 傅应华 徐宏祥 消瘰合剂的质量控制项目研究 J 药 物分析杂志 于红艳 许成刚 崔永霞 退黄丸的质量标准研究 J 中 成药 程东岩 王隶书 程东红 等 赤丹肝纤颗粒的质量标准 J 中国药师 聂颖兰 范斌 郭娜 等 HPLC D法测定健脾益肾胶 行检测 选择不同品牌的十八烷基硅烷键合硅胶柱 囊中黄芪甲苷的含量 J 中国实验方剂学杂志 水 时 采 进行实验 结果当流动相为乙腈 TM 用 W S F C T mh L G L或 张凤瑞 周贤 刘炎 等 当归补血汤中黄芪的鉴别及黄 SHI MADZU GLW C ODS 等色谱柱时 均 芪甲苷 的 含 量 测 定 J 吉 林 中 医 药 能达到有效分离的目的 且峰形较好 阴性对照样 品无干扰 供试品溶液的制备主要包括索氏提取和 萃取两部分 为了优化供试品溶液的制备方法 分 唐柏平 李琼英 贺清源 阴阳和口服液的薄层色谱实验 研究 J 湖南中医杂志 收稿日期

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