上海中医药大学学报第 30 卷第 4 期 2016 年 7 月 81 表 1 紫苏叶样品来源 编号 收集地 批号 收集时间 名称 1 广西玉林市 zsy Perilafrutescens(L.)Brit. 2 东北 P.frutes

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1 80 DOI: /j x 方药研究 HPLC 法测定紫苏叶中咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸的含量 胡惠军, 谷丽华, 鱺桂新上海中医药大学中药研究所, 上海中药标准化研究中心 ( 上海 ) 摘要 目的 : 建立同时测定紫苏叶中咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸的 HPLC 方法 方法 : 采用 FortisXi C 18 色谱柱 (250mm 4.0mm,5μm), 以乙腈 0.2% 冰醋酸为流动相进行梯度洗脱, 柱温为 25, 体积流量为 1ml/min, 检测波长 330nm, 进样量 10μl 结果:3 个被测成分在各自测定的线性范围内线性良好,r , 加样回收率范围分别为 97.74% 98.76% 101.5%,RSD 分别为 1.7% 3.1% 和 2.3% 结论: 所建立的方法操作简单, 稳定性和重复性好, 可用于紫苏叶药材中咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸含量的测定 关键词 紫苏叶 ; 含量测定 ;HPLC; 咖啡酸 ; 野黄芩苷 ; 迷迭香酸 紫苏叶是唇形科紫苏属植物紫苏 Perila frutescens(l.)brit. 的干燥叶, 为常用中药, 具有解表散寒 行气和胃之功效, 临床上用于风寒感冒 咳嗽呕恶 胸腹胀满 妊娠呕吐 鱼蟹中毒等症 [1] 紫 [2] 苏叶化学成分主要含挥发油和黄酮及酚酸类 [3], 其次含三萜酸 [4], 紫色紫苏叶还含有花青素 [3] 挥发油是紫苏叶的重要活性成分, 紫苏叶挥发油组 [5 7] [8 9] 分及药理报道已经很多, 但由于人们尚未发现其组分的巨大差异与活性有何相关性, 因此通常以总紫苏油作为紫苏叶的一个质量评价指标 值得一提的是, 除了挥发油, 黄酮和酚酸两大类成分在紫苏叶中所占比例非常大 [3,10], 且与其功效相关的药理活性研究报道也很多, 如抗炎 抗氧化等, 是紫苏叶质量评价不应忽视的部分 我们对市售的紫苏叶进行 LC MS 分析, 发现紫苏叶醇提取物中咖啡酸 木犀草素 7 O 二葡萄糖醛酸苷 [11] 野黄芩苷和迷迭香酸为所有紫苏叶中主要的共有成分, 但由于木犀草素 7 O 二葡萄糖苷对照品难以获得, 因此本研究拟建立高效液相含量测定方法, 对紫苏叶中 [ 基金项目 ] 国家中医药管理局中医药行业科研专项项目 ( ) [ 作者简介 ] 胡惠军, 女, 在读硕士生, 主要从事中药活性成分与质量标准研究 [ 通讯作者 ] 谷丽华, 副研究员, 硕士生导师 ; E mail:gulihua1228@163.com 咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸进行含量测定, 以期对紫苏叶质量标准的制定和提升提供参考和依据 1 材料与方法 1.1 仪器与材料 仪器 Agilent1100 高效液相系统 :G1322A 在线真空脱气机,G1311A 四元梯度泵,G1313A 自动进样仪,G1316A 柱温箱,G1315B 二极管阵列检测器,AgilentChemStation 工作站 ( 安捷伦科技有限公司, 美国 ); 电子天平 (SartoriusBP211D, 德国 ), 超声波清洗器 ( 型号 3510E DTH, 频率 40kHz, 美国 Branson),Mili QSynthesisA10System(MILLIPORE, 美国 Bedford) 材料乙腈 (FisherScientific,LOT141221) 和冰醋酸 (CNW Technologies,LOTM209K132) 为色谱级, 甲醇为分析级, 水为超纯水 咖啡酸 (LOT ) 野黄芩苷 (LOT ) 和迷迭香酸 (LOT ) 均购自上海中药标准化研究中心, 纯度 > 98% 紫苏叶药材信息见表 1, 标本存放在上海中药标准化研究中心标本室 1.2 实验方法 对照品溶液制备取咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸适量, 精密称定, 溶于甲醇, 分别配制成 1ml 各含 50μg 的咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸的单个对照品溶液和混合对照品溶液

2 上海中医药大学学报第 30 卷第 4 期 2016 年 7 月 81 表 1 紫苏叶样品来源 编号 收集地 批号 收集时间 名称 1 广西玉林市 zsy Perilafrutescens(L.)Brit. 2 东北 P.frutescens(L.)Brit. 3 河南辉县市 zsy P.frutescens(L.)Brit. 4 河北安国市 zsy P.frutescens(L.)Brit. 5 上海雷允上 HY P.frutescens(L.)Brit. 6 河南辉县市 zsy P.frutescens(L.)Brit. 7 安徽亳州市 P.frutescens(L.)Brit. 8 河南禹州市 zsy P.frutescens(L.)Brit. 9 安徽福春堂 zsy P.frutescens(L.)Brit. 10 安徽亳州市 zsy P.frutescens(L.)Brit. 11 北京同仁堂 zsy P.frutescens(L.)Brit. 12 东北 P.frutescens(L.)Brit. 13 广东天泰药业 zsy P.frutescens(L.)Brit. 14 河北安国市 zsy P.frutescens(L.)Brit. 15 安徽亳州市 zsy P.frutescens(L.)Brit. 16 河北安国市 zsy P.frutescens(L.)Brit. 17 广西玉林市 zsy P.frutescens(L.)Brit. 18 河北保定市 zsy P.frutescens(L.)Brit. 19 广西玉林市 zsy P.frutescens(L.)Brit. 20 安徽亳州市 zsy P.frutescens(L.)Brit. 21 河北安国市 zsy P.frutescens(L.)Brit. 22 广东广州市 zsy P.frutescens(L.)Brit. 23 不详 zsy P.frutescens(L.)Brit 供试品溶液制备取 0.5g 紫苏叶药材粉末 ( 过 2 号筛 ), 精密称定, 置 100ml 圆底烧瓶中, 加 60% 甲醇 50ml, 称定质量,80 回流 2h, 冷却至室温, 用 60% 甲醇补足质量, 混匀, 经 0.45μm 的微孔滤膜过滤, 取续滤液, 即得 色谱条件 FortisXiC 18 色谱柱 (250mm 4.0mm,5μm); 流动相为乙腈 (A) 0.2% 冰醋酸水溶液 (B) 梯度洗脱 (0~15min,15%~22%A;15~ 30min,22%~24%A); 检测波长为 330nm, 流速为 1ml/min; 柱温 25 ; 进样量 10μl 测定方法分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪, 记录色谱图 ( 图 1) 及咖啡酸 野黄芩苷 迷迭香酸的峰面积, 在 项色谱条件下, 紫苏叶供试品溶液在与咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸对照品色谱峰相应的保留时间处检测出色谱峰 2 结果 2.1 含量测定结果按 2010 年版 中国药典 一 部附录 Ⅸ H 水分测定法第二法 ( 甲苯法 ) 测定 23 批紫苏叶药材的含水量, 同时取 23 批紫苏叶样品按 项下方法制备供试品溶液, 并在 项色谱条件下测定供试品溶液中咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸的含量 按干燥品计算, 外标法计算结果见表 2 1: 咖啡酸 ;2: 野黄芩苷 ;3: 迷迭香酸图 1 对照品色谱图 (A) 和紫苏叶药材色谱图 (B)

3 82 表 2 紫苏叶样品中咖啡酸 野黄芩苷 迷迭香酸的含量比较 含量 (mg/g) 编号 咖啡酸 野黄芩苷 迷迭香酸 挥发油 (ml/50g) 水分 (%) 叶比例 (%) 含量测定方法学考察 重复性实验 分别取 11 号样品 6 份, 按 系统适应性确认 取混合对照品溶液连续 方法制备供试品溶液,6 份供试品溶液中的咖 进样 6 次, 咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸的峰面积 RSD 值均小于 1.5%, 分离度均大于 1.5, 理论塔板 啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸的峰面积的 RSD 分别为 2.2% 1.4% 和 1.6%, 说明重复性良好 数均大于 3000, 说明系统适应性良好 线性与范围 分别取咖啡酸 野黄芩苷和 专属性实验 按 色谱条件, 对空白 迷迭香酸, 精密称定, 分别置于 25ml 容量瓶中, 加 溶液 ( 甲醇 ) 咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸的单个对照品溶液 混合对照品溶液和供试品溶液分别进行检测, 在空白溶液的色谱图中, 各待测成分保留时间处均未出现干扰峰, 紫苏叶供试品溶液在与咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸对照品色谱峰保留时间处检测出相应色谱峰, 说明专属性良好 甲醇溶解并定容至刻度, 制成浓度分别为 和 mg/ml 对照品储备液 取咖啡酸对照品储备液适量, 加甲醇制成 和 1.055μg/ml 的稀释溶液 ; 取野黄芩苷对照品储备液适量, 加甲醇制成 精密度实验 按 和 方法分别 和 μg/ml 的稀释溶液 ; 取迷迭香酸对照品 制备咖啡酸 野黄芩苷 迷迭香酸对照品溶液和供试品溶液各 1 份, 连续进样 6 次, 记录各待测成分的峰面积 结果对照品咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸峰面积的 RSD 分别为 1.2% 1.2% 0.9%; 供试品溶液中各成分的 RSD 分别为 0.4% 0.2% 0.1%, 储备液适量, 加甲醇制成 和 μg/ml 的稀释溶液 分别取上述对照品溶液按 项色谱条件进行测定, 以各成分的峰面积 (Y) 对其浓度 (X) 进行线性回归, 回归方程见表 3 说明仪器精密度良好

4 上海中医药大学学报第 30 卷第 4 期 2016 年 7 月 83 表 3 咖啡酸 野黄芩苷与迷迭香酸的回归方程及线性范围比较 化合物 线性方程 r 值 线性范围 (μg/ml) 检测限 (μg/ml) 定量限 (μg/ml) 迷迭香酸 Y=33.184X ~ 野黄芩苷 Y=38.595X ~ 咖啡酸 Y=59.258X ~ 加样回收实验 分别取 11 号紫苏叶样品 9 品中待测成分质量分数的 50% 100% 150% 的对 份, 每份 0.5g, 精密称定, 加入 100ml 圆底烧瓶中, 按 项下测得咖啡酸 野黄芩苷 迷迭香酸含量的平均值作为加入对照品量的依据, 分别加入供试 照品各 3 份, 按 项下方法制备供试品溶液, 以 3 份供试品溶液平均峰面积计算 3 种待测成分的测得量和回收率, 结果见表 4 表 4 咖啡酸 野黄芩苷 迷迭香酸的加样回收率比较 (n=3) 化学成分 样品中含量 (μg) 加入对照品量 (μg) 测得量 (μg) 回收率 (%) RSD(%) 平均回收率 (%) RSD(%) ± ± 咖啡酸 ± ± ± ± ± ± 野黄芩苷 ± ± ± ± ± ± 迷迭香酸 ± ± ± ± 稳定性实验按 项和 项方法分别制备咖啡酸 野黄芩苷 迷迭香酸对照品溶液和供试品溶液各 1 份, 分别在供试品溶液制备后 和 24h 进样检测, 记录各时间点待测成分的峰面积, 计算得咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸对照品溶液峰面积的 RSD 值分别为 0.91% 2.16% 和 0.34%; 供试品溶液中的咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸峰面积的 RSD 值分别为 1.27% 0.59% 和 2.99%, 说明 24h 内供试品溶液和对照品溶液的稳定性良好 3 讨论 3.1 指标成分的选择从图 1 中可以看出, 紫苏叶醇提取物有 4 个主要色谱峰, 除了咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸, 根据 LC MS 数据和文献信息 [9], 咖啡酸和野黄芩苷之间的色谱峰确定为木犀草素 7 O 二葡萄糖醛酸苷 由于市场上无木犀草素 7 O 二葡萄糖醛酸苷对照品出售, 因此建议不宜作为质量评价指标 3.2 样品制备方法考察为了能充分提取紫苏叶中咖啡酸 野黄芩苷和迷迭香酸, 考察了 6 个主要因素 : 提取溶剂 ( 不同浓度的甲醇 乙醇和丙酮 ) 提取方法 ( 超声 回流和浸渍 ) 料液比 ( 和 1 200) 提取时间 (60min 120min 和 180min) 提 取温度 (70 80 和 90 ) 提取次数 (1 次 2 次和 3 次 ), 结果发现提取方法和提取溶剂影响较大, 60% 甲醇回流提取效率最高 因此选择 0.5g 药材粉末 加 50ml60% 甲醇 80 回流 120min 为提取方法 3.3 HPLC 方法系统性考察分别考察了不同色谱柱 (AgilentZorbaxSB C 18 AgilentEclipseXDB C 18 FortisXiC 18 ) 流动相系统 ( 甲醇 - 水 乙腈 - 水 ) 流动相含酸浓度 (0.2% 磷酸溶液 0.2% 甲酸溶液 0.1% 冰醋酸溶液 0.2% 冰醋酸溶液 0.3% 冰醋酸溶液 ) 柱温 ( ) 和流速 ( ml/min) 等因素 以保留时间和对称因子为依据, 结果选择 FortisXiC 18 (4.0mm 250mm, 5μm) 色谱柱, 乙腈 0.2% 冰醋酸水溶液为流动相系统, 柱温 25, 流速 1.0ml/min, 进样量为 10μl 因咖啡酸 (323nm) 野黄芩苷 (335nm) 和迷迭香酸 (330nm) 最大吸收波长接近, 故 330nm 作为共同检测波长 3.4 含量测定结果分析从含量测定结果可以看出, 紫苏叶中咖啡酸含量较其他两种成分含量低, 数据比较集中, 平均值为 mg/g( 数据分布 ~0.5041mg/g); 不同批次间野黄芩苷 ( 平均值 mg/g, 数据分布 ~4.3820mg/g) 和迷迭香酸 ( 平均值为 mg/g, 数据分布

5 ~9.5850mg/g) 含量差异较大 根据测定结果, 三个成分的含量与挥发油含量呈一定的正相关, 但由于贮藏时间和条件对紫苏油含量影响很大, 可能导致少数样品紫苏油含量异常 2015 年版 中国药典 对紫苏叶中挥发油含量限量标准为 : 饮片挥发油含量不得少于 0.20%(ml/g) 而从本研究所测的 23 批样品的挥发油来看,26% 的饮片不符合药典标准, 由此可见, 市售紫苏叶的质量控制有待进一步加强 2015 年版 中国药典 中紫苏叶含量测定项仅对挥发油含量作了规定, 缺乏大极性部分含量测定, 本研究建立的方法稳定可靠 重复性较好, 可为紫苏叶质量标准提供依据 参考文献 : [1] 国家药典委员会. 中国药典 ( 一部 )[S]. 北京 : 中国医药科技出版社,2010:339. [2] 杨军辉, 樊蓉, 刘训红, 等. 不同采收期紫苏叶挥发性成分 HSGC/MS 分析 [J]. 南京中医药大学学报,2013,29(1): [3]MengLH,LozanoY,BombardaI,etal.Polyphenolextractionfrom eightperilafrutescenscultivars[j].c R Chim,2009,12(5): [4]BannoN,AkihisaT,TokudaH,etal.Triterpeneacidsfrom the leavesofperilafrutescensandtheiranti inflammatoryandantitumor promotingefects[j].bioscibiotechnolbiochem,2004,68(1): [5]BumblauskienéL,JakstasV,JanulisV,etal.Preliminaryanaly sisonesentialoilcompositionofperilal.cultivatedinlithuania [J].ActaPolPharm,2009,66(4): [6] 唐英, 陈欣, 沈平砎. 紫苏叶中挥发油类成分的指纹图谱研究 [J]. 上海中医药杂志,2013,47(9): [7] 于, 陈川. 中药挥发油提取技术及生物活性的研究进展 [J]. 上海中医药大学学报,2014,28(2): [8]You CX,Yang K,Wu Y, etal.chemicalcomposition and insecticidalactivitiesoftheesentialoilofperilafrutescens(l.) Brit.aerialpartsagainsttwostoredproductinsects[J].EurFood ResTechnol,2014,239(3): [9]IgarashiM,MiyazakiY.AReviewonBioactivitiesofPerila:Progres inresearchonthefunctionsofperilaasmedicineandfood[j]. EvidBasedComplementAlternatMed,2013,2013: [10]Müler WaldeckF,SitzmannJ,SchnitzlerWH,etal.Determination oftoxicperilaketone,secondaryplantmetabolitesandantioxidative capacityinfiveperilafrutescensl.varieties[j].foodchem Toxicol,2010,1(48): [11] 陈永康, 赵志刚, 孙丽娟. 液相色谱 - 飞行时间质谱法快速鉴定紫苏叶中的化学成分 [J]. 医药导报,2013,23(3): 编辑 : 沈蕾收稿日期 : DeterminationofCafeicAcid,Scutelarinand RosmarinicAcidinPerilaeFolium byhplc HUHui jun 1,2,GULi hua 1,2,CHOUGui xin 1,2 1.InstituteofChineseMateriaMedica,ShanghaiUniversityofTraditional ChineseMedicine,Shanghai, ShanghaiR& DCenterforStandardizationofChineseMedicine,Shanghai, ABSTRACT Objective: Tomeasurethecontentsofcafeicacid,scutelarinandrosmarinicacidinPerilaeFolium by HPLC.Methods:FortisXiC 18 column(250mm 4.0mm,5μm)wasused.Themobilephaseconsistedofacetonitrileand watersolutionwith0.2% aceticacidwasusedasgradientelutionforseparation.thecolumntemperaturewas25.the flowingratewas1ml min -1.Thedetectingwavelengthwasat330nmandtheinjectvolumewas10μl.Results:Itshowed goodlinearitiesinthemeasuringrangeofthethreetestedconstitutions,r Therangesofrecoverieswere97.74%, 98.76% and101.5% respectively,andthecorespondingrsdwere1.7%,3.1% and2.3%.conclusion:theestablished methodshowssimpleoperation,goodstabilityandrepeatability,whichcanbeappliedinthedeterminationofcafeicacid, scutelarinandrosmarinicacidofperilaefolium. KEYWORDS PerilaeFolium;determination;HPLC;cafeicacid;scutelarin;rosmarinicacid

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