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帜淞班
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1 国际中医中药杂志 208 年 4 月第 40 卷第 4 期 Int J Trad Chin Med, April 208, Vol. 40, No 补肾通络颗粒质量标准研究实验与方药张海英王美玲杜梓萱尹兴斌倪健摘要目的建立补肾通络颗粒的质量标准方法利用薄层色谱法对该制剂中的骨碎补白芍川牛膝川芎进行定性鉴别 ; 利用 HPLC 法检测柚皮苷芍药苷含量, 色谱柱为 Agilent C8 色谱柱 (4.6 mm 250 mm,5 μm), 流动相为乙腈 -0.% 磷酸, 检测波长 nm, 柱温 30, 流速.0 ml/min 结果补肾通络颗粒中骨碎补白芍川牛膝川芎的薄层色谱鉴别专属性强 ; 柚皮苷在 ~ μg 范围内线性关系良好, 芍药苷在 ~ μg 范围内线性关系良好 ; 柚皮苷的平均回收率为 97.3% RSD 值为.9%, 芍药苷的平均回收率为 96.6% RSD 值为.5% 结论该定性定量检测方法简便可行专属性强重现性好灵敏度高, 可作为补肾通络颗粒的质量控制标准关键词色谱法, 薄层 ; 色谱法, 高压液相 ; 质量控制 ; 补肾通络颗粒 ; 柚皮苷 ; 芍药苷 Study on quality standard of Bushen-Tongluo granules Zhang Haiying, Wang Meiling, Du Zixuan, Yin Xingbin, Ni Jian. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 0002, China Corresponding author: Ni Jian, net Abstract Objective To establish the quality standard for Bushen-Tongluo granules. Methods Drynariae rhizoma, Paeoniae radix alba, Cyathulae radix, Chuanxiongin rhizome were identified by thin layer chromatography (TLC), and the content of naringin and paeoniflorin was determined by high performance liquid chromatography(hplc) with chromatographic column Agilent C8 (4.6 mm 250 mm, 5 μm), as the mobile phase was acetonitrile-0.% phosphoric acid and the scan wave length were 230 and 283 nm. The column temperature was 30. The flow rate was.0 ml/min. Results TLC could identify Drynariae rhizoma, Paeoniae radix alba, Cyathulae radix, Chuanxiongin rhizome effectively. Under the condition, there was a good linear relationship when the content of naringin was in μg. There is also a good linear relationship when the content of paeoniflorin was in μg. The average recovery rate of naringin was 97.3% and RSD was.9%. The average recovery rate of paeoniflorin was 96.6% and RSD was.5%. Conclusions The established methods are simple, specific, reproducible, and sensitive, and they can be used for the quality control of Bushen-Tongluo granules. Key words Chromatography, thin layer; Chromatography, high pressure liquid; Quality control; Bushen-Tongluo granules; Naringin; Paeoniflorin 补肾通络方为北京中医药大学附属东方医院的临床经验方, 临床上主要用于膝骨关节炎的治疗骨碎补为该处方的君药, 白芍川牛膝为臣药, 其余药共为佐使药在前期考察了补肾通络方的提取制备工艺, 为有效控制该制剂的质量, 本研究采用薄层色谱法对该处方中的骨碎补白 DOI: /cma.j.issn 基金项目 : 北京市科委计划项目 (Z ) 作者单位 :00029 北京中医药大学中药学院通信作者 : 倪健, njtcm@263.net 芍川牛膝川芎进行定性鉴别柚皮苷芍药苷分别为君药骨碎补及臣药白芍的含量测定指标成分, 因此选择柚皮苷芍药苷的含量作为制剂的含量控制指标成分 [-2] 虽然在 205 年版中华人民共和国药典中规定了白芍项下芍药苷的含量测定用的流动相为乙腈 -0.% 磷酸, 扫描波长为 230 nm, 骨碎补项下柚皮苷含量测定的流动相为甲醇醋酸水 ( ), 扫描波长 283 nm 但本研究以节省试验时间提高效率, 简化含量测定步骤为目的, 以乙腈 -0.% 磷酸为流动相梯

2 346 国际中医中药杂志 208 年 4 月第 40 卷第 4 期 Int J Trad Chin Med, April 208, Vol. 40, No.4 度洗脱, 以 nm 双波长扫描, 同时检测柚皮苷和芍药苷含量, 为该制剂的质量控制提供参考仪器与试药. 试验仪器岛津 LC-20AT 高效液相色谱仪 ( 日本岛津 ); Agilent C8 色谱柱 (4.6 mm 250 mm,5 μm); DZKW-4 电子恒温水浴锅 ( 北京中兴伟业仪器有限公司 );Sartorious BT 25S 电子天平 ( 德国 Sartorious 公司 ); 薄层色谱硅胶 G 板 ( 青岛海洋化工集团公司 ).2 药品与试剂补肾通络颗粒 ( 实验室自制 ); 骨碎补白芍等药材购自北京本草方源药业有限公司, 经北京中医药大学鉴定系主任刘春生教授鉴定, 均符合 205 年版中华人民共和国药典规定柚皮苷 ( 中国食品药品检定研究院, 批号 ); 芍药苷 ( 中国食品药品检定研究院, 批号 ) 2 方法与结果 2. 薄层色谱法鉴别 2.. 骨碎补 ; 取本品颗粒约 g, 加甲醇 30 ml, 加热回流 h, 放冷, 滤过, 滤液蒸干, 残渣加甲醇 ml 溶解, 作为供试品溶液取不含骨碎补的阴性药材粉末约 5 g, 同法制成阴性对照溶液取柚皮苷对照品, 加甲醇制成 ml 含 0.5 mg 的溶液, 作为对照品溶液按照薄层色谱法试验, 吸取上述溶液各 4 μl, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以甲醇 - 乙酸乙酯 - 甲酸 - 水 ( ) 的上层溶液为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以三氯化铝试液, 置紫外灯下 (365 nm) 下检视 [3], 供试品色谱中, 在与对照色谱相应位置上, 显示相同颜色斑点, 阴性无干扰 2..2 白芍 : 取本品颗粒约 2 g, 加乙醇 50 ml, 超声 (00 Hz)30 min, 放冷, 滤过, 滤液蒸干, 残渣加水 20 ml 溶解, 用水饱和正丁醇萃取, 萃取 3 次,20 ml/ 次, 合并萃取液, 蒸干, 残渣加乙醇 ml 溶解, 作为供试品溶液取不含白芍的阴性药材粉末约 4 g, 同法制成阴性对照溶液取芍药苷对照品, 加乙醇制成 ml 含 mg 的溶液, 为对照品溶液按照薄层色谱法试验, 吸取上述溶液各 0 μl, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以三氯甲烷 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 甲酸 ( ) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以 5% 香草醛硫酸溶 [4-5] 液, 加热至斑点清晰供试品色谱中, 在与对照色谱相应的位置上, 显相同的颜色斑点, 阴性无干扰 2..3 川牛膝 : 取本品颗粒约 2 g, 加甲醇 50 ml, 加热回流 h, 放冷, 滤过, 滤液蒸干, 残渣加甲醇 ml 溶解, 加入中性氧化铝粉末 (00~200 目, 2 g), 拌匀, 上柱, 用甲醇 - 乙酸乙酯 ( )40 ml 洗脱, 收集洗脱液, 蒸干, 残渣加甲醇 ml 使溶解, 作为供试品溶液取不含川牛膝的阴性药材粉末约 8 g, 同法制成阴性对照溶液取杯苋甾酮对照品, 加甲醇制成 ml 含 0.5 mg 的溶液, 作为对照品溶液照薄层色谱法试验, 吸取上述溶液各 0 μl, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以三氯甲烷 - 甲醇 (0 3) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以 0% 硫酸乙醇溶液, 在 05 加热至斑点显示清晰, 置紫外灯下 (365 nm) 下检视供试品色谱中, 在与对照色谱相应位置上, 显示相同颜色斑点, 阴性无干扰 2..4 川芎 : 取本品颗粒约 g, 加乙醚 20 ml, 加热回流 h, 放冷, 滤过, 滤液蒸干, 残渣加乙酸乙酯 ml 溶解, 作为供试品溶液取不含川芎的阴性药材粉末约 4 g, 同法制成阴性对照溶液取川芎对照药材 g, 同法制成对照品溶液照薄层色谱法试验, 吸取上述溶液各 0 μl, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以正己烷 - 乙酸乙酯 (3 ) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 置紫外灯下 (365 nm)

3 国际中医中药杂志 208 年 4 月第 40 卷第 4 期 Int J Trad Chin Med, April 208, Vol. 40, No [6] 下检视, 供试品色谱中, 在与对照色谱相应位置上, 显示相同颜色斑点, 阴性无干扰 2.2 柚皮苷芍药苷含量测定 2.2. 供试品的制备方法考察 : 提取方法及提取溶剂的考察 : 精密称取等量的样品 4 份,2 份精密加入甲醇 50 ml 为溶剂, 考察 00 Hz,30 超声 h 及 80 加热回流 h;2 份精密加入去离子水 50 ml 为溶剂, 考察 00 Hz,30 超声 h 及 00 加热回流 h 条件下所测得的柚皮苷及芍药苷的峰面积结果显示, 以水为提取溶剂, 00 加热回流提取所测得的柚皮苷及芍药苷峰面积较大, 见表 2 提取时间的考察 : 精密称取等量的样品 3 份, 精密加入去离子水 50 ml 为溶剂, 00 下分别加热回流 h, 检测供试品中的柚皮苷及芍药苷的峰面积结果显示, 以水为溶剂, 加热回流 h, 柚皮苷和芍药苷峰面积均较大, 增加提取时间, 两者峰面积并不增加, 因此, 选择加热回流 h 为最佳提取时间, 见表 2 综上, 确定供试品的提取方法为以水为溶剂, 00 加热回流 h 表不同溶剂及不同提取方法所测得的供试品中柚皮苷及芍药苷的峰面积积分值比较提取方法提取溶剂柚皮苷芍药苷超声 h 甲醇加热回流 h 甲醇超声 h 水加热回流 h 水表 2 不同提取时间所测得的供试品中柚皮苷及芍药苷峰面积积分值比较提取时间柚皮苷芍药苷 0.5 h h h 溶液制备 : 柚皮苷对照品溶液 : 称取柚皮苷对照品约 7 mg, 精密称定, 置 0 ml 量瓶中, 加甲醇定容至刻度, 摇匀, 精密量取 0.4 ml, 置 0 ml 量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 即得柚皮苷对照品溶液 2 芍药苷对照品溶液 : 称取芍药苷对照品约 3 mg, 精密称定, 置 0 ml 量瓶中, 加甲醇定容至刻度, 摇匀, 精密量取 0.7 ml, 置 0 ml 容量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 即得芍药苷对照品溶液 3 供试品制备 : 将样品研细, 取细粉 g, 精密称定重量, 精密加入 50 ml 水, 称定重量水浴加热回流 h, 放冷, 称定重量, 补足减失的重量, 摇匀, 微孔滤膜滤过, 取续滤液即得 4 阴性溶液 : 取按处方量制备的缺骨碎补的空白样品缺白芍的空白样品, 按供试品溶液的制备方法制备阴性溶液色谱条件 : 色谱柱为 Agilent C8 色谱柱 (4.6 mm 250 mm,5 μm); 检测波长 nm; 柱温 30 ; 流动相为乙腈 -0.% 磷酸水溶液, 洗脱程序见表 3 流速.0 ml/min; 灵敏度 0.05; 理论塔板数按芍药苷和柚皮苷计算均不低于表 3 流动相梯度洗脱表 (%) 时间乙腈 0.% 磷酸水溶液 0~20 min ~35 min ~55 min 专属性实验 : 分别精密吸取供试品溶液对照品溶液阴性溶液各 0 μl, 按上述色谱条件进样测定结果显示, 阴性溶液在与对照品相应的保留时间处无峰出现, 可见阴性无干扰结果见图图线性关系考察 : 柚皮苷 : 分别取浓度为 μg/ml 的柚皮苷标准品溶液各 0 μl, 注入色谱仪中, 以柚皮苷峰面积积分值 (Y) 对溶液浓度 (X) 进行线性回归, 得回归方程 :Y= X ;r= , 表明柚皮苷在 ~ μg 范围内线性关系良好 2 芍药苷 : 分别取浓度为 μg/ml 芍药苷标准品溶液各 0 μl, 注入色谱仪中, 以芍药苷峰面积 (Y) 对浓度 (X) 进行线性回归, 得回归

4 348 国际中医中药杂志 208 年 4 月第 40 卷第 4 期 Int J Trad Chin Med, April 208, Vol. 40, No.4 A B C t/min 注 A: 柚皮苷对照品 ;B: 补肾通络颗粒供试品 ;C: 骨碎补阴性样品 ;: 柚皮苷图柚皮苷 HPLC 图 A B C t/min 注 A: 芍药苷对照品 ;B: 补肾通络颗粒供试品 ;C: 芍药苷阴性样品 ; : 芍药苷图 2 芍药苷 HPLC 图方程 Y= X ;r= , 表明芍药苷在 ~ μg 范围内线性关系良好精密度考察 : 精密吸取对照品溶液 0 μl, 按色谱条件进样测定, 重复进样 6 次, 测得柚皮苷平均峰面积积分值为 ,RSD 值为 0.85%, 测得芍药苷平均峰面积积分值为 , RSD 值为 0.46% 表明仪器精密度良好稳定性试验 : 取同一供试品溶液, 分别于制备后的第 h 进样, 测定柚皮苷峰面积积分值, 根据标峰面积求得柚皮苷平均含量为 0.87 mg/g,rsd 值为 2.34%, 表明供试品中柚皮苷在 24 h 内稳定测定芍药苷峰面积积分值, 根据标峰面积求得芍药苷平均含量为 4.35 mg/g,rsd 值为.08%, 表明供试品中芍药苷在 24 h 内稳定重复性试验 : 取同一批号样品, 平行制备 6 份, 在色谱条件下进行含量测定测得供试品中柚皮苷平均含量为 0.86 mg/g,rsd 值为.76%; 芍药苷的平均含量为 4.23 mg/g,rsd 值为.5%, 表明该方法重现性良好加样回收率试验 : 取 6 个 00 ml 锥形瓶, 每份各精密加入 mg/ml 柚皮苷对照品溶液 ml 和 mg/ml 芍药苷对照品溶液.4 ml 加入对照品溶液后水浴蒸干溶剂待锥形瓶干燥后, 取已知含量的样品 6 份, 精密称定, 分别加入锥形瓶中, 按供试品方法制备供试品溶液, 按色谱条件进样测定计算回收率, 结果见表 4 根据表中结果可得, 柚皮苷的平均回收率为 97.3%,RSD 为.9%; 芍药苷的平均回收率为 96.6%,RSD 为.5%, 结果表明本法加样回收率良好含量测定 : 按下供试品制备方法制备供试品溶液, 平行操作 6 份, 在色谱条件下进行含量测定得该批补肾通络颗粒中柚皮苷含量为 0.86 mg/g, 芍药苷含量为 4.23 mg/g

5 国际中医中药杂志 208 年 4 月第 40 卷第 4 期 Int J Trad Chin Med, April 208, Vol. 40, No 表 4 柚皮苷芍药苷加样回收率试验结果指标取样量 (g) 样品中含量 (mg) 加入量 (mg) 测得量 (mg) 回收率 (%) 平均回收率 (%) RSD(%) 柚皮苷芍药苷讨论本研究对补肾通络颗粒中主要药味进行了定性鉴别, 并进行了阴性对照试验, 结果表明该方法专属性强, 阴性无干扰, 可有效控制本品的质量在制备薄层色谱鉴别的供试品溶液的过程中发现, 以甲醇为溶剂提取的供试品溶液十分黏稠, 不利于展开剂展开通过调整供试品的制备方法, 增加正丁醇萃取过程, 可使供试品溶液黏稠度降低, 利于试验的进行在预实验过程中, 笔者曾尝试用甲醇 -0.% 磷酸乙腈 -0.2% 磷酸乙腈 -0.5% 磷酸作为流动相洗脱, 结果以 0.% 磷酸为流动相梯度洗脱, 以 nm 双波长扫描, 可同时测得柚皮苷芍药苷的峰面积, 结果阴性无干扰, 线性关系良好, 精密度良好, 稳定性良好, 加样回收率良好, 可为本制剂的质量标准提供参考, 并较大程度地简化了试验过程提高试验效率, 节约成本利益冲突申明除基金项目支持外, 本文全体作者未接受过第三方的资助或服务, 对文中所描述的药物材料或器械均无个人或企业的经济利益作者贡献声明张海英 : 设计试验实施研究采集数据分析 / 解释数据起草文章统计分析 ; 王美玲杜梓萱 : 实施研究采集数据统计分析 ; 尹兴斌 : 对文章的知识性内容作批评性审阅指导支持性贡献 ; 倪健 : 酝酿和设计试验对文章的知识性内容作批评性审阅获取研究经费行政和技术或材料支持指导支持性贡献参考文献 [] 白俊鹏, 尚振苹, 蒋晓文, 等. 骨碎补高效液相指纹图谱研究及主要成分含量测定 [J]. 国际药学研究杂志,205,42(3): DOI:0.3220/j.cnki.jipr [2] 金林, 赵万顺, 郭巧生, 等. 白芍饮片的化学成分测定及质量评价 [J]. 中国中药杂志,205,40(3): DOI:0.4268/ cjcmm [3] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 : 一部 [M]. 北京 : 中国医药科技出版社,205. [4] 张绍轩, 张红岩, 司云珊, 等. 痛经片中丹参香附及白芍的薄层色谱鉴别 [J]. 长春中医药大学学报,2009,25(6): [5] 李瑞丽, 王喜民, 张玉东. 薄层色谱法鉴别胃康灵胶囊中白芍三七和延胡索 [J]. 亚太传统医药,203,9(3):9-20. DOI:0.3969/j.issn [6] 陈剑锋. 温经克痹散中当归川芎的薄层色谱鉴别方法 [J]. 海峡药学,204(2): DOI:0.3969/j.issn ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 张琪 )

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Microsoft Word - 2拼版2-z 国际中医中药杂志 206 年 2 月第 38 卷第 2 期 Int J Trad Chin Med, February 206, Vol. 38, No.2 53 藏药二十五味珊瑚丸的质量标准研究方药研究周娟汪娟陈丽丽黄福开袁铭韩亚南摘要目的建立二十五味珊瑚丸的质量标准方法采用薄层色谱法鉴别二十五味珊瑚丸中打箭菊黑芝麻沉香丁香藏菖蒲诃子木香甘草 ; 采用 HPLC 法测定二十五味珊瑚丸中的羟基红花黄色素