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债螳蓟
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1 # 人参茸芝胶囊的制备工艺及质量控制 ** 赵岩, 妙志岩, 蔡恩博, 杨鹤, 刘双利, 张连学 ( 吉林农业大学中药材学院, 吉林, 长春,130118) 5 摘要 : 目的 : 建立人参茸芝胶囊的定性鉴别和含量测定的方法方法 : 采用薄层色谱法定性鉴别人参茸芝胶囊中人参灵芝孢子粉 ; 采用高效液相色谱法测定人参皂苷和灵芝酸 A 的含量人参皂苷色谱条件 : 流速 1.0 ml min-1, 柱温 35, 检测波长 203 nm, 流动相为乙腈 (A) 水 (B), 梯度洗脱 ; 灵芝酸 A: 流速 0.8 ml min-1, 柱温 25, 检测波长 254 nm, 10 流动相为乙腈 (B) 0.1% 醋酸水 (A) 溶液, 梯度洗脱结果 : 薄层鉴别荧光斑点清晰, 分离度好, 阴性对照无干扰 ; 人参皂苷在 0.5~50 µg 范围内呈良好的线性关系, 平均回收率在 98.53%~102.53% 之间, 相对标准偏差 (RSD) 在 0.84%~1.83% 之间 ; 灵芝酸 A 的线性范围 0.02~0.6 mg ml-1(r2=0.9998), 平均回收率为 98.80%,RSD 为 0.88% 结论: 所建立的定性含量测定分析方法可用于人参茸芝胶囊的质量控制 15 关键词 : 人参茸芝胶囊 ; 薄层色谱法 ; 高效液相色谱法 ; 质量控制中图分类号 :R Preparation Process and Quality Control of Renshen Rongzhi Capsules Zhao Yan, Miao Zhiyan, Cai En-bo, Yang He, Liu Shuangli, Zhang Lianxue (Chinese Medicine Material College of Jilin Agricultural University, Jilin, Changchun ) Abstract: Objective: To prepare Renshen Rongzhi Capsules and to establish its quality control method. Method: Qualitative identification of ginseng, ganoderma spore in Renshen Rongzhi Capsules was carried out by thin layer chromatograhy; Ginsenosides and Ganoderma acid A were determined by HPLC. Chromatography: LC 3000-C18 column, Ginsenosides: the flow rate was 1.0 ml min-1, the column temperature was 25 and the measurement wavelength was 203 nm, the moving phase was acetonitrile (A) and water (B), Gradient elute; Ganoderma acid A: the flow rate was 0.8 ml min-1, the column temperature was 25 and the measurement wavelength was 254 nm, the moving phase was acetonitrile (B) and 0.1% glacial acetic acid-water (A), Gradient elute. Results: The TLC spots were clear with high resolution, and the blank test showed no interference; Ginsenosides linear range was µg, the average recovery was between 98.53% %, and the relative standard deviation (RSD) was between 0.84%-1.83%; Ganoderma acid A linear range was mg ml-1 (R2=0.9998), the average recovery was 98.80%, and the RSD was 0.88%. Conclusion: The established qualitative and quantitative analysis method is applicable for the quality control of Renshen Rongzhi Capsules. Key words: Renshen Rongzhi Capsules; TLC; HPLC; quality control 0 引言 40 人参茸芝胶囊是在课题组多年来对人参鹿茸灵芝大蒜等重要中药材开展了广泛的科学研究的基础上研制出来的该产品以人参鹿茸灵芝孢子粉大蒜素等为主要原料, 具有抗疲劳功效其中, 人参具有复脉固脱大补元气补脾益肺生津养血安神益智等 [1] [2] 功效, 鹿茸具有壮肾阳益精血强筋骨调冲任托疮毒的功能, 灵芝具有扶正固本 [3] 延年益寿之功效, 大蒜素具有抗疲劳降胆固醇护肝预防心血管疾病降血压等生理基金项目 : 国家科技支撑计划项目 (2011BAI03B01); 国家公益性行业科研专项 ( ); 吉林省科技发展计划项目 ( ,YYZX201258); 吉林省产业技术体系项目 (201218) 作者简介 : 赵岩 (1979 ), 男, 满族, 副教授, 博士, 研究方向 : 天然药物化学成分与生物活性通信联系人 : 张连学 (1955 ), 男, 汉族, 教授, 博士, 研究方向 : 药用植物栽培与加工. zlx863@163.com - 1 -

2 45 [4] 学作用为了有效监测该制剂的生产质量, 本实验采用 TLC 对制剂中的人参和灵芝进行定性鉴别 ; 采用 HPLC 对制剂中人参皂苷和灵芝酸 A 的含量进行检查, 从而达到完善药品质量标准的目的, 在确保成方安全和提高疗效方面具有很重要的意义, 为新药的开发奠定了良好的基础 1 材料 LC 3000 高效液相色谱仪 C 18 色谱柱 (4.6 mm 250 mm,5 μm)( 北京创新通恒科技有限公司 ),LA 114 电子分析天平 ( 常熟市衡器厂 ),KQ-250 B 超声波清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公司 ), 真空干燥箱 ( 上海 - 恒科学仪器有限公司 ),DHG-9246 A 电热恒温鼓风干燥箱 ( 上海精宏实验设备有限公司 ),FW-200 高速万能粉碎机 ( 北京中兴伟业仪器有限公司 ),DSY-2-4 孔电热恒温水浴锅 ( 北京国华医疗器械厂 ), 试剂乙腈 ( 色谱纯, 霍尼韦尔 -B&J), 其他试剂为分析纯 ( 北京化工厂生产 ), 水为重蒸水, 单体人参皂苷对照品 ( 吉林大学化学院 ), 灵芝酸 A 对照品 ( 上海源叶生物科技有限公司 ) 2 制剂成型工艺研究 2.1 细粉休止角测定 60 取本品细粉 3 份, 分别经口径 7 cm 的长颈漏斗流下, 并呈圆锥形状, 测其休止角结果见表 1 表 1 细粉休止角测定结果序号实验 1 实验 2 实验 3 休止角 ( 度 ) 平均休止角 ( 度 ) 结论 : 本品休止角较大, 流动性不太好 2.2 辅料的选择由于本品为药材的混合细粉, 其流动性不太好, 所以须在细粉中加入适当的粘合剂, 改善药粉的流动性, 以保证装量更准确, 而一般常用的粘合剂有淀粉浆淀粉是葡萄糖的高聚体, 为轻质的白色粉末, 无臭无味, 不溶于冷水和乙醇, 有良好的流动性, 对药物有较大的吸附力, 亲水性能强, 有利于药物的吸收称取本品细粉 35 g(100 粒量 ), 加入淀粉, 混匀, 测定混合细粉的休止角, 比较其流动性差异, 试验结果如下表 2 表 2 辅料用量筛选结果项目实验 1 实验 2 实验 3 实验 4 细粉量 (g) 淀粉 (g) 休止角 ( 度 ) 流动性有明显的改善一般流动性好流动性好结果分析 : 处方 3 处方 4 加入淀粉后, 细粉流动性均好, 比较处方中加入的辅料量, 处方 3 比较理想 2.3 细粉堆密度测定取干燥粉碎的细粉 350 g, 加入淀粉 50 g, 混匀, 取适量装入 100 ml 量筒中, 以一定的高度落下 4 次 ( 每次保持条件一致, 松紧适宜 ), 称其细粉重量计算其堆密度, 结果见表 3-2 -

3 表 3 堆密度实验数据 (n=4) 75 项目细粉重 (g) 体积 (ml) 堆密度 (g/ml) 项目平均值平均值结果分析 : 根据以上数据可知, 颗粒平均堆密度是 g ml -l 再根据上述的筛选处方, 每粒胶囊装量要求为 0.35g, 所以可选择 0 号胶囊 2.4 制剂成型工艺小试试验 80 按照上述工艺设计及预试验参数, 进行 2 次小试试验, 每次均以 300 粒胶囊处方量投料, 考察胶囊的装量差异及崩解时限, 小试结果见表 4 表 4 小试实验考察结果 (n=10) 平均装量 (g)n=10 装量差异 (%)n=10 崩解时限 (min) 第一次试验 %~0.1075% 3 第二次试验 %~0.1139% 4 结论 : 从以上两次实验结果分析, 药粉平均装量装量差异崩解时限均合格, 说明药粉适合直接填充胶囊, 确定本制剂成型工艺合理 3 方法与结果 3.1 人参的薄层鉴别取人参茸芝胶囊内容物 1.4 g, 加 40 ml 三氯甲烷, 加热回流 1 h, 弃去三氯甲烷液, 挥干药渣, 加 0.5 ml 水搅拌湿润, 加水饱和正丁醇 10 ml, 超声处理 30 min, 吸取上清液加 3 倍量氨试液, 摇匀, 静置分层, 取上层液蒸干, 向残渣中加甲醇 1 ml 溶解, 作为供试品溶液另取人参对照药材 1 g, 同法制成对照药材溶液再取人参皂苷 Re 对照品和人参皂苷 Rg 1 对照品, 加甲醇制成每 1 ml 各含 2 mg 的混合溶液, 作为对照品溶液照薄层色谱法 ( 中国药典 2010 年版一部附录 Ⅵ B) 试验, 吸取上述三种溶液各 1~2 μl, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以三氯甲烷 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 水 (15:40:22:10)10 以下放置的下层溶液为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以 10% 硫酸乙醇溶液, 在 105 加热至斑点显色清晰供试品色谱中, 在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上, 显相同位置的斑点, 阴性对照无干扰如图灵芝的薄层鉴别取人参茸芝胶囊内容物 2 g, 加 30 ml 乙醇, 加热回流 30 min, 过滤, 滤液蒸干, 向残渣中加 1 ml 甲醇溶解, 作为供试品溶液另取灵芝孢子粉对照药材 0.1 g, 同法制成对照药材溶液照薄层色谱法 ( 中国药典 2010 年版一部附录 Ⅵ B) 试验, 吸取上述两种溶液各 4 μl, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以石油醚 (60 ~ 90 )- 甲酸乙酯 - 甲酸 (12:8:1) 的上层溶液为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 在紫外光灯 365 nm 下检视供试品色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上, 显相同位置的荧光斑点, 阴性对照无干扰如图 2-3 -

1.2.3 人参茸芝胶囊样品 4. 人参对照 5. 阴性对照 6. 皂苷对照 1.2.3 人参茸芝胶囊样品 4. 灵芝对照 5. 阴性对照图 1 人参 TLC 图 2 灵芝 TLC 105 3.3 人参单体皂苷的含量测定 3.3.1 色谱条件 110 LC 3000-C 18 色谱柱 (4.6 mm 250 mm,5 μm); 乙腈 (A) 水 (B) 为流动相, 梯度洗脱 [0 min(19.

4 1.2.3 人参茸芝胶囊样品 4. 人参对照 5. 阴性对照 6. 皂苷对照人参茸芝胶囊样品 4. 灵芝对照 5. 阴性对照图 1 人参 TLC 图 2 灵芝 TLC 人参单体皂苷的含量测定色谱条件 110 LC 3000-C 18 色谱柱 (4.6 mm 250 mm,5 μm); 乙腈 (A) 水 (B) 为流动相, 梯度洗脱 [0 min(19.5% A) 24 min(21.5% A) 26 min(21.5%a) 30 min(29% A) 52 min(31.5% A) 55 min(38% A) 65 min(38% A)], 流速为 1.0 ml min -1, 柱温 35, 检测波长 203 nm, 进样量 :20 µl 在上述色谱条件下, 处方中其他成分无干扰见图 3 A B C D 115 A 对照品 B 供试品 C 对照药材 D 阴性对照图 3 人参茸芝胶囊及对照药材人参的 HPLC 图溶液的制备 120 对照品溶液分别精密称定 5 mg 标准品人参皂苷 Rg1 Re Rf Rb1 Rg2 Rc Rb2 Rb3 Rd, 置 5 ml 容量瓶中, 用甲醇溶解并定容, 制成上述 9 种人参皂苷浓度为 1 mg ml -1 的混标标准品储备液供试品溶液精密称定人参茸芝胶囊内容物 0.7 g, 置索氏提取器中, 加三氯甲烷加热回流 3 h, 弃去三氯甲烷液, 药渣挥干溶剂, 连同滤纸筒移入 100 ml 锥形瓶中, 精密加水饱和正丁醇 25 ml, 密塞, 放置过夜, 超声处理 30 min, 滤过, 弃去初滤液, 精密量取续滤液 25 ml, - 4 -

5 125 置蒸发皿中蒸干, 残渣加甲醇溶解并转移至 5 ml 量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 以 0.45 μm 微孔滤膜过滤, 作为供试品溶液对照药材溶液取人参粉 0.5 g, 按照供试品溶液的制备方法, 制成对照药材溶液阴性对照品溶液取按处方除去人参的阴性样品, 按照供试品溶液的制备方法, 制成阴性对照品溶液线性关系考察 130 以进样量中人参皂苷质量 (µg) 对峰面积作图, 得到标准曲线本方法测定人参皂苷 Rg1 Re Rf Rb1 Rg2 Rc Rb2 Rb3 Rd 在 0.5~50 µg 范围内呈良好的线性关系 9 种人参皂苷的标准曲线见表精密度试验 135 按本方法液相色谱条件, 分别进样 20 µl, 重复进样 6 次,Rg1 Re Rf Rb1 Rg2 Rc Rb2 Rb3 Rd 的 RSD 分别为 0.53% 0.89% 0.62% 0.78% 0.59% 0.61% 0.73% 0.85% 0.69%, 均小于 2%, 表明仪器精密度良好稳定性试验按本方法液相色谱条件, 间隔 h 进行进样, 每次进样 20 µl, 结果供试品溶液中人参皂苷在 24 h 内峰面积无明显变化, 其测定值 RSD 为 0.86% < 2.0%, 表明本供试品溶液在室温 24 h 内其化学性质非常稳定重复性试验取同一批胶囊内容物, 分别按项下方法平行制备 6 份供试液, 按上述色谱条件进行测定, 记录色谱图, 将测得的峰面积代入回归方程中计算供试品中人参皂苷的含量, 测得其含量的 RSD 分别为 1.31% 1.25% 1.36% 1.53% 1.15% 1.47% 1.35% 1.64% 1.25%, 均小于 2%, 表明此方法重复性良好加样回收率试验精密称取一定量的对照品溶液加入到样品中, 按本方法液相色谱条件进行操作, 与样品溶液同时测定 Rg1 Re Rf Rb1 Rg2 Rc Rb2 Rb3 Rd 的回收率在 98.53%~102.53% 之间,RSD 在 0.84%~1.83% 之间见表样品含量的测定 150 按本方法液相色谱条件, 以外标法测定 3 批胶囊中人参单体皂苷含量, 结果如表 5 表 5 9 种人参皂苷的标准曲线及含量 (n=6) 单体皂苷回归方程 R 2 平均回收率 Rg1 Y=136537X Re Y=342404X Rf Y=292369X Rb1 Y=180325X Rg2 Y=174011X Rc Y=97372X Rb2 Y=283962X Rb3 Y=243335X Rd Y=248888X RSD - 5 -

6 3.4 灵芝酸 A 的含量测定色谱条件 155 LC 3000-C 18 色谱柱 (4.6 mm 250 mm,5 μm); 以乙腈 (B) 0.1% 醋酸水溶液 (A) 为流动相, 梯度洗脱 [0 min(35% A) 18 min(35% A) min(100%a) 30 min (100% A) min(35%a) 40 min(35%a)], 流速为 0.8 ml min -1, 柱温为 25, 检测波长为 254 nm, 进样量为 20 µl 在上述色谱条件下, 处方中其他成分无干扰见图 4 A B C D 160 A. 对照品 B. 供试品 C. 对照药材 D. 阴性对照 1. 灵芝酸 A 图 4 人参茸芝胶囊及对照药材灵芝孢子粉的 HPLC 图溶液的制备对照品溶液取灵芝酸 A 对照品适量, 置于 5 ml 容量瓶中, 精密称定, 加甲醇溶解并定容, 摇匀, 即得 0.06 mg ml -1 的对照品溶液供试品溶液方法一 : 精密称定人参茸芝胶囊内容物 2 g, 置于 250 ml 圆底烧瓶中, 用 100 ml 无水乙醇浸泡 2 h, 然后水浴加热回流提取 3 h, 抽滤, 所得滤液蒸干, 再向残渣中加水 10 ml, 以 20 ml 乙酸乙酯进行萃取, 取上层液蒸干, 残留物以甲醇溶解, 定容于 10 ml 容量瓶中, 摇匀, 以 0.45 μm 微孔滤膜过滤, 作为供试品溶液方法二 : 精密称定人参茸芝胶囊内容物 2 g, 置具塞锥形瓶中, 加入 150 ml 甲醇, 超声处理 30 min, 取出放冷, 滤过, 滤液蒸干, 残留物置 10 ml 容量瓶中, 以甲醇溶解, 并加至刻度, 摇匀, 以 0.45 μm 微孔滤膜滤过, 即得对照药材溶液取灵芝孢子粉 2, 按照供试品溶液的制备方法, 制成对照药材溶液阴性对照品溶液取按处方除去灵芝的阴性对照品, 按照供试品溶液的制备方法, 制成阴性对照品溶液线性关系考察精密吸取灵芝酸 A 0.1,0.3,0.5,1.0,3.0 mg, 置于 5 ml 容量瓶中, 精密称定, 加甲醇溶解并定容, 摇匀, 即得精密吸取上述溶液各 20 µl 注入高效液相色谱仪中, 按上述色谱条件进行测定, 记录峰面积, 以峰面积 (Y) 为纵坐标, 浓度 (X) 为横坐标, 线性回 - 6 -

7 180 归方程为 Y= X ,R 2 = 结果表明灵芝酸 A 进样浓度在 0.02~0.6 mg ml -1 线性关系良好精密度试验按本方法液相色谱条件, 取对照品溶液 ( 浓度 :0.06 mg ml -1 ), 连续进样 6 次, 每次 20 µl, 记录峰面积, 结果峰面积的 RSD 为 0.53% < 2.0%, 表明仪器精密度良好稳定性试验按本方法液相色谱条件, 间隔 h 进行进样, 每次进样 20 µl, 结果供试品溶液中灵芝酸 A 在 24 h 内峰面积无明显变化, 其测定值 RSD 为 0.72% < 2.0%, 表明本供试品溶液在室温 24 h 内其化学性质非常稳定重复性试验 190 取同一批胶囊内容物, 分别按项下方法平行制备 6 份供试液, 按上述色谱条件进行测定, 记录色谱图, 将测得的峰面积代入回归方程中计算供试品中灵芝酸 A 的含量, 测得其含量的 RSD 为 1.71%, 表明此方法重复性良好加样回收率试验 195 取已知含量的同一批胶囊样品 0.35 g( 灵芝酸 A 的含量为每粒 mg), 分别加入灵芝酸 A 对照品适量, 再按供试品溶液的制备方法平行操作 6 份, 依法测定各自含量计算其加样回收率结果见表 6 表 6 灵芝酸 A 加样回收率试验样品取样量样品中含量加入量测得量回收率平均回收率 RSD (g) (mg) (mg) (mg) (%) (%) (%) 样品含量的测定 200 按上述两种提取方法测定, 以外标法计算灵芝酸 A 含量, 结果如表 7, 选取最优法测定 3 批胶囊中灵芝酸 A 的含量结果分别为 0.043,0.041,0.042 mg g-1,rsd =2.38% 表 7 两种方法测得灵芝酸 A 的含量不同方法测定质量 (g) 峰面积含量 (mg g -1 ) 胶囊内容物 ( 回流 ) 胶囊内容物 ( 超声 ) 灵芝孢子粉 ( 回流 ) 灵芝孢子粉 ( 超声 ) 讨论由表 7 可以得出加热回流提取供试品溶液的方法最佳, 适合胶囊内容物的提取胶囊剂外观光洁, 美观, 能够掩盖药物不适的异味 ; 胶囊剂药物生物利用度高, 辅料用量少, 甚至 - 7 -

8 不用辅料 ; 而且能有效地防潮隔光, 提高药品的稳定性, 保证药效胶囊剂崩解性良好, 易于患者吸收, 并且是固体剂型, 密封保存, 稳定性较液体剂型好, 比需要冲服的颗粒剂服用方便与片剂和丸剂相比, 制备时不需要加压力, 所以在胃肠道中崩解快吸收好此外, 胶囊剂可以掩盖药物的不良气味, 使胶囊剂的选择性更佳本实验对人参茸芝胶囊制剂中各味药进行了 TLC 定性鉴别, 通过试验, 确定了人参灵芝的薄层鉴别方法该方法专属性强, 阴性对照无干扰, 可以作为该制剂的鉴别方法人 [1] [1] 参薄层鉴别参照药典进行实验, 展开效果好, 斑点清晰灵芝鉴别实验参考药典进行鉴 [5-7] 别, 实验过程中发现阴性对照有干扰因此, 参照文献进行了反复实验, 最后确定展开剂为石油醚 (60 ~ 90 )- 甲酸乙酯 - 甲酸 (12:8:1), 展开效果最好试验过程中发现, 流动相的酸度对各组分的分离存在一定影响故通过调整醋酸用量和流动相中乙睛和醋酸溶液的比例, 在多次试验基础上最终确定醋酸溶液 ( 取冰醋酸 1 ml, 用水稀释至 1000 ml)- 乙睛 (65:35) 为最佳流动相, 采用该流动相时, 色谱分析时间可缩短至 18 min, 峰形及分离度均理想, 制剂中其他成分无干扰 [ 参考文献 ] (References) [1] 中华人民共和国药典委员会. 中国药典一部 [S] 年版. 北京 : 中国医药科技出版社, 2010:8,174. [2] 傅雷, 孙艺平, 赵心宇, 等. 鹿茸的化学成分以及药理作用研究进展 [J]. 时珍国医国药, 2007,18(4): [3] 刘思妤, 王艳, 何蓉蓉, 等. 灵芝的化学成分 [J]. 沈阳药科大学学报,2008,25(3): [4] 邵力钧, 单文卫. 大蒜素的临床应用进展 [J]. 中国现代医生,2009,47(3): [5] 金阳. 破壁灵芝孢子粉胶囊的 TLC 鉴别研究 [J]. 安徽医药,2006,10(2): [6] 赵晓立, 严国鸿, 毛德春, 等. 灵芝孢子胶囊薄层色谱鉴别 [J]. 福建分析测试,2005, 14(4): [7] 郭定海, 林晓. 薄层色谱法鉴别护肝宁片中丹参和灵芝 [J]. 海峡药学,2004,16(4):

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Microsoft Word 赵岩-二校 6 4 Vol. 6 No. 4 2015 4 Journal of Food Safety and Quality Apr., 2015 赵岩 1, 妙志岩 1, 牛淑静 2, 郜玉钢 1*, 蔡恩博 1, 杨鹤 1, 刘双利 1, 张连学 1* (1., 130118; 2., 130062) 摘要 : 目的 A 方法 (thin layer chromatography, TLC) ; (high