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1 山东科学 SHANDONG SCIENCE 第 29 卷第 5 期 2016 年 10 月出版 Vol.29 No.5 Oct.2016 DOI: / j.issn 中药与天然活性产物 HPLC 法测定首乌益智胶囊中大黄素和大黄素甲醚的含量 丁晓彦 ꎬ 刘青 ꎬ 贾元印 ꎬ 赵渤年 ( 山东省中医药研究院 ꎬ 山东省中药质量标准研究重点实验室 ꎬ 山东济南 ) 摘要 : 建立了高效液相色谱法 (HPLC) 同时测定首乌益智胶囊中大黄素和大黄素甲醚含量的方法 ꎮ 采用 C 18 (250 mm 4.6 mmꎬ5 μm) 色谱柱 ꎬ 以甲醇 0.1% 磷酸水 (82 : 18ꎬV / V) 为流动相 ꎬ 检测波长为 289 nmꎬ 流速为 1.0 ml / minꎬ 柱温 30 ꎮ 测得大黄素在 0.019~ 0.19 μg(r = ꎬn = 5) 大黄素甲醚在 0.021~ 0.21 μg(r = ꎬn = 5) 线性关系良好 ꎻ 大黄素和大黄素甲醚的平均回收率分别为 98.58% %ꎬ 分别为 2.66% 1.15%ꎮ 研究表明 ꎬ 该方法专属性强 结果准确 ꎬ 可作为同时测定首乌益智胶囊中大黄素和大黄素甲醚含量的方法 ꎮ 关键词 : 首乌益智胶囊 ꎻ 大黄素 ꎻ 大黄素甲醚 ꎻ 高效液相色谱法 ꎻ 含量测定中图分类号 :R284.1 文献标识码 :A 文章编号 : (2016) HPLC based content determination of emodin and emodin monomenthyl ether from Shouwuyizhi capsule DING Xiao yanꎬ LIU Qingꎬ JIA Yuan yinꎬ ZHAO Bo nian ( Shandong Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine Quality Standard Researchꎬ Shandong Academy of Traditional Chinese Medicineꎬ Jinan ꎬ China) Abstract We constructed a HPLC based content determination method for emodin and emodin monomenthyl ether from Shouwuyizhi capsule. Samples were separated by C 18 (250 nm 4.6 nmꎬ 5 μm) column with methanol 0.1% phosphoric acid water ( 82 : 18ꎬ V / V) as mobile phase. Determination conditions were determination wavelength of 289 nmꎬ flow rate of 1.0 ml / minꎬ and column temperature of 30. Better linear relationship exists in the range 0.019~0.19 μg(r = ꎬn= 5) for emodinꎬ and in the range 0.021~ 0.21 μg(r = ꎬn = 5)for emodin monomenthyl ether. Their average recovery rates are respectively 98.58% and %ꎬ and RSDs are 2.66% and 1.15%. Results show that the method has strong specificity and accuracyꎬ so it can be applied to simultaneous content determination of emodin and emodin monomenthyl ether from Shouwuyizhi capsule. Key words Shouwuyizhi capsuleꎻ emodinꎻ emodin monomenthyl etherꎻ HPLCꎻ content determination 收稿日期 : 基金项目 : 山东省自主创新及成果转化专项 (20140ZZCX2303) 作者简介 : 丁晓彦 (1983 )ꎬ 女 ꎬ 助理研究员 ꎬ 研究方向为中药质量控制 ꎮ kate 66@ 163.com 通信作者 ꎬ 赵渤年 ꎬ 男 ꎬ 研究员 ꎬ 博士生导师 ꎮ bonianzh@ 163.com

2 第 5 期 丁晓彦 ꎬ 等 :HPLC 法测定首乌益智胶囊中大黄素和大黄素甲醚的含量 37 首乌益智胶囊主要由制何首乌 益智 黄芪等 10 种中药组成 ꎬ 具有补肾填精 化瘀通窍的功效 ꎬ 主要用于 治疗肾精亏虚 瘀血阻络型血管性痴呆 ꎮ 制何首乌为方中君药 ꎬ 而大黄素和大黄素甲醚是何首乌的主要成 分 ꎬ 也是 «中国药典» [1] 规定的制何首乌的含量测定检测项之一 ꎮ 现代药理实验研究证明 ꎬ 何首乌中蒽醌类 成分 (AGPMT) 具有抗肿瘤和提高免疫功能的作用 [2] ꎮ 其中 ꎬ 大黄素的药理作用有抑制胰酶活性 抑菌 抗 炎 免疫调节 保肝利胆 清除自由基 抗氧化 降低血液粘度 抑制血小板聚集 抗肿瘤及治疗急性胰腺炎 等 [3 5] ꎮ [6 7] 国内有大量关于大黄素含量测定的文献报道 ꎬ 但采用高效液相色谱法测定大黄素和大黄素甲醚含量 的文献并不多 ꎬ 该类报道中以测定中药成方制剂中二者含量方法为多 [8 11] ꎬ 但因组方 剂型等不同 ꎬ 其测定方 法也稍有不同 ꎮ 为了控制首乌益智胶囊的质量 ꎬ 使其在临床使用中更加安全有效 ꎬ 本文采用高效液相色谱法 对首乌益智胶囊中的大黄素和大黄素甲醚含量的测定方法进行研究 ꎬ 方法简便 准确 ꎬ 重现性好 ꎬ 为控制本制 剂质量提供了一种快速 便捷的科学方法 ꎮ 1 仪器 试剂与试药 1.1 仪器 高效液相色谱仪 ( 美国 Watersꎬ Waters e2695 )ꎻThermo Syncronis C 18 色谱柱 (250 mm 4.6 mmꎬ5μm)ꎻ 电 子天平 ( 德国 SartoriusꎬBP211D)ꎮ 1.2 试剂 纯水 ꎮ 盐酸 磷酸 甲醇 ( 提取用 ) 三氯甲烷 无水硫酸钠为分析纯 ꎬ 甲醇 ( HPLC 测定用 ) 均为色谱纯 ꎬ 水为超 1.3 试药 大黄素对照品 ( 批号 ) 大黄素甲醚对照品 ( 批号 ) 均由中国食品药品检定 研究院提供 ꎮ 制何首乌 益智 黄芪等中药饮片购自山东建联盛嘉中药有限公司中药饮片厂 ꎬ 首乌益智胶囊 样品为自制 3 批样品 ꎮ 2 方法与结果 2.1 色谱条件 采用 Thermo Syncronis C 18 色谱柱 (250 mm 4.6 mmꎬ5 μm)ꎻ 检测波长 289 nmꎻ 流速 1.0 ml / minꎻ 柱温 30 ꎻ 进样量 10 μlꎮ 以甲醇 0.1% 磷酸水溶液 (82 : 18ꎬV / V) 为流动相 ꎬ 理论板数按大黄素峰计算不低于 2 500ꎮ 2.2 混合对照品溶液制备 分别称取大黄素及大黄素甲醚对照品适量 ꎬ 精密称定 ꎬ 加甲醇制成每 1 ml 各含大黄素 大黄素甲醚 10 μg 的溶液 ꎬ 即得 ꎮ 2.3 供试品溶液制备 称取装量差异项下本胶囊内容物适量 ꎬ 研细 ꎬ 取约 1 gꎬ 精密称定 ꎬ 加硅藻土 2 gꎬ 拌匀 ꎬ 置索氏提取器中 ꎬ 加甲醇 100 mlꎬ 加热回流 3 hꎮ 将提取液蒸干 ꎬ 加 8% 盐酸溶液 40 ml 使溶解 ꎬ 转移至圆底烧瓶中 ꎬ 加三氯甲 烷 40 mlꎬ 水浴回流 2 hꎬ 立即冷却 ꎬ 转移至分液漏斗中 ꎬ 分出三氯甲烷层 ꎬ 酸水液层用三氯甲烷提取 2 次 ꎬ 每 次 40 mlꎬ 合并三氯甲烷液 ꎬ 用水 80 ml 洗涤一次 ꎬ 三氯甲烷液加无水硫酸钠 15 gꎬ 振摇 5 minꎬ 静置 30 minꎬ 滤过 ꎮ 用少量三氯甲烷洗涤残渣及滤器 ꎬ 合并滤液 洗液 ꎬ 蒸干 ꎬ 残渣加甲醇溶解 ꎬ 转移至 10 ml 量瓶中 ꎬ 加甲 醇至刻度 ꎬ 摇匀 ꎮ 精密量取该溶液 1 ml 至 10 ml 量瓶中 ꎬ 加甲醇至刻度 ꎬ 摇匀 ꎬ 即得供试品溶液 ꎮ

3 38 山东科学 2016 年 2.4 阴性对照溶液制备按处方组成及比例 ꎬ 剔除制何首乌 ꎬ 称取方中其他药味 ꎬ 按首乌益智胶囊的制备工艺和供试品溶液的制备方法 ꎬ 制得不含制何首乌的阴性对照溶液 ꎮ 2.5 专属性考察分别精密吸取对照品溶液 供试品溶液 阴性对照溶液各 10 μlꎬ 采用高效液相色谱法 ꎬ 按 2.1 项下的色谱条件进行测定 ꎬ 结果发现 ꎬ 阴性样品在大黄素和大黄素甲醚相同保留时间处无干扰 ꎬ 见图 1ꎮ a 大黄素和大黄素甲醚混合对照品 ꎻb 首乌益智胶囊样品 ꎻc 阴性样品图 1 对照品 首乌益智胶囊 阴性样品 HPLC 色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of Shouwuyizhi capsuleꎬcontrol and negative samples 2.6 线性关系考察取大黄素浓度为 9.58 μg / ml 大黄素甲醚浓度为 μg / ml 的对照品溶液 ꎬ 进样量分别为 μlꎬ 按上述色谱条件进行测定 ꎮ 以峰面积值为纵坐标 ꎬ 以进样量为横坐标进行回归分析 ꎬ 结果 ꎬ 大黄素进样量在 ~ 0.19 μg 范围内线性关系良好 ꎬ 回归方程为 ꎬY = X ꎬR = ꎻ 大黄素甲醚进样量在 ~ 0.21μg 范围内呈良好线性关系 ꎬ 回归方程为 ꎬY = X ꎬR = ꎮ 2.7 精密度实验吸取混合对照品溶液 ꎬ 按 2.1 项下色谱条件 ꎬ 连续进样 6 次 ꎬ 测定大黄素和大黄素甲醚的峰面积 ꎬ 计算得分别为 0.46% 和 1.47%ꎮ 2.8 重现性实验取同一批 ( 批号 1) 胶囊内容物 ꎬ 取样 6 份 ꎬ 分别制成供试品溶液 ꎬ 注入高效液相色谱仪 ꎬ 测定 ꎮ 计算得到样品中大黄素的平均含量为 毫克 / 粒 ꎬ 为 1.87%ꎻ 大黄素甲醚的平均含量为 毫克 / 粒 ꎬ 为 1.98%ꎮ 2.9 稳定性实验取同一批号 ( 批号 1) 胶囊内容物制成的供试品溶液 ꎬ 分别在 h 进样 ꎬ 测定大黄素和大黄素甲醚的峰面积值 ꎬ 共测 5 次 ꎮ 结果 ꎬ 大黄素的为 2.33%ꎬ 大黄素甲醚的为 0.89%ꎬ 这表明供试品溶液在 12 h 内稳定 ꎮ

4 第 5 期 丁晓彦 ꎬ 等 :HPLC 法测定首乌益智胶囊中大黄素和大黄素甲醚的含量 加样回收率实验取已测定含量的供试品 ( 批号 1) 适量 ꎬ 研细 ꎬ 称取约 0.5 gꎬ 精密称定 ꎬ 共取 6 份 ꎬ 精密加入分别含大黄素 0.41mg / ml 大黄素甲醚 0.40 mg / ml 的混合对照品溶液 1 mlꎬ 按 2.3 项下方法制备供试品溶液 ꎬ 计算加样回收率 ꎮ 结果大黄素的平均回收率为 98.58%ꎬ 为 2.66%(n = 6)ꎻ 大黄素甲醚的平均回收率为 %ꎬ 为 1.15%(n = 6)ꎬ 测定结果见表 1 ~ 2ꎮ 表 1 大黄素加样回收率实验结果 Table 1 Experimental results of emondin recovery rate 样品 取样量 / g 样品含量 加标量 测得量 单次 回收率 / % 平均 % Table 2 表 2 大黄素甲醚加样回收率实验结果 Experimental results of emondin monomenthyl ether recovery rate 样品 取样量 / g 样品含量 加标量 测得量 单次 回收率 / % 平均 % 样品的测定分别精密吸取对照品溶液 供试品溶液各 10 μlꎬ 进样 ꎬ 测定色谱峰面积 ꎬ 计算各样品中大黄素和大黄素甲醚的含量 ꎬ 样品测定结果见表 3ꎮ 表 3 样品测定结果表 Table 3 Determination results of samples 大黄素含量 大黄素甲醚含量 批号 单次测定 平均含量 单次测定 平均含量 % %

5 40 山东科学 2016 年 3 讨论供试品溶液制备方法的确定既参考了 «中国药典» 何首乌总蒽醌含量测定的制备方法 ꎬ 又结合本样品自身的特点 ꎬ 样品前处理方法在完全提取目标成分的同时 ꎬ 尽量排除制剂辅料及其他成分 ꎬ 使样品测定时免受杂质峰干扰 ꎮ 在供试品溶液制备方法中 ꎬ 有研究采用不同浓度甲醇或乙醇提取的方法 ꎬ 该方法操作简单 ꎮ 实验前期 ꎬ 也曾考虑采用甲醇回流提取方法制备供试液 ꎬ 但结果显示 ꎬ 没经过水解得到样品的大黄素和大黄素甲醚提取率低 ꎬ 且测定图谱中其他与测定无关成分较多 ꎬ 故最终采用 2.3 所述方法制备供试液 ꎮ 实验对大黄素和大黄素甲醚水解时间及温度进行了考察 ꎬ 结果表明 ꎬ 沸水浴回流 2 h 可实现结合蒽醌完全水解 ꎬ 提取出大黄素和大黄素甲醚 ꎮ 实验对样品检测进行了全波长扫描 ꎬ 发现大黄素和大黄素甲醚在 289 nm 附近有最大吸收 ꎬ 故选择波长 289 nm 作为大黄素和大黄素甲醚含量测定的检测波长 ꎮ 本方法测定首乌益智胶囊中大黄素和大黄素甲醚的含量 ꎬ 结果可靠 ꎬ 且处理方法简便 ꎬ 流动相组成简单 ꎬ 可用于控制其质量 ꎮ 参考文献 : [1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 2015 年版一部 [M]. 北京 : 中国医药科技出版社 ꎬ2015: [2] 刘凯 ꎬ 郑海生 ꎬ 李应东. 大黄酸的药理作用研究述略 [J]. 中医药学刊 ꎬ2004ꎬ22(9): [3] 董东 ꎬ 董顺福 ꎬ 韩丽琴 ꎬ 等. 何首乌中总黄酮与微量元素含量分析及其药效机理研究 [J]. 时珍国医国药 ꎬ2008ꎬ19(9): [4] 楼招欢 ꎬ 吕圭源 ꎬ 俞静静. 何首乌成分 药理及毒副作用相关的研究进展 [J]. 浙江中医药大学学报 [J].2014ꎬ38(4) : [5] 杨红莉 ꎬ 葛珍珍 ꎬ 孙震晓. 何首乌药理研究新进展 [J]. 中药材 ꎬ2013ꎬ 36(10) : [6] 高燃 ꎬ 任爱农 ꎬ 许珍珍 ꎬ 等.RP HPLC 法同时测定五味首乌片中淫羊藿苷 大黄素和大黄素甲醚的含量 [ J]. 药物分析杂志 ꎬ 2009ꎬ29(9): [7] 曾亮 ꎬ 赵文静 ꎬ 罗展远 ꎬ 等.HPLC 法测定人参首乌首乌胶囊中大黄素 大黄素甲醚的含量 [ J]. 广东药学院学报 ꎬ2015ꎬ31 (1): [8] 毕云生 ꎬ 范云飞 ꎬ 王英萍 ꎬ 等.HPLC 法同时测定消氮颗粒中芦荟大黄素大黄酸大黄素大黄酚和大黄素甲醚五种成分的含量 [J]. 解放军药学学报 ꎬ2014ꎬ30(4): [9] 程茜菲 ꎬ 常青 ꎬ 刘琦 ꎬ 等. 高效液相色谱法同时测定维血宁中虎杖苷 大黄素 8 O β D 葡萄糖苷 大黄素 大黄素甲醚的含量 [J]. 中南药学 ꎬ2013ꎬ11(9): [10] 方既明 ꎬ 章怀奋. 高效液相色谱法同时测定麻仁丸中大黄素 大黄酚 大黄酸 大黄素甲醚 芦荟大黄素的含量 [ J]. 中南药学 ꎬ2011ꎬ9(5): [11] 乔立业 ꎬ 方李 ꎬ 曹燕丽 ꎬ 等. 高效液相色谱法测定新保肾片中芦荟大黄素 大黄酸 大黄素 大黄酚和大黄素甲醚的含量 [ J]. 药学实践杂志 ꎬ2015ꎬ33(5):

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