在线过滤器 ( 孔径 10 μm) 水为蒸馏水 ; 乙腈为色谱纯 ; 磷酸二氢钠戊烷磺酸钠均为分析纯 ; 芦丁对照品 ( 中国食品药品检定研究院, 批号 : , 含量 :91.1); 二维芦丁片及空白辅料 ( 杭州华东医药集团五丰制药厂, 规格 :10, 批号 :160620

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1 HPLC 测定二维芦丁片复方制剂中芦丁的溶出度和含量文春梅 1, 郑舒娴 1, 王建 2* (1. 浙江工业大学, 杭州 ;2. 浙江省食品药品检验研究院, 杭州 ) 摘要 : 目的建立 HPLC 测定二维芦丁片中芦丁溶出度和含量的方法方法溶出度测定以水 ( 含 0.5 SDS) 为溶出介质, 浆法, 转速为 75 r min 1,45 min 取样, 取样后采用 HPLC 测定 ; 含量测定采用 Thermo C 18 柱 (4.6 mm 250 mm,5 μm), 以磷酸盐缓冲液 (0.l mol L 1 磷酸二氢钠溶液, 用磷酸调节 ph 值至 4.4)- 乙腈 (80 20) 为流动相, 检测波长为 254 nm 结果芦丁在 2.26~22.56 μg ml 1 内与峰面积线性关系良好 (r= ), 平均回收率为 98.2(RSD=0.4), 溶出液稳定 3 批样品在 45 min 时平均溶出度均 >75, 并且有较好的均一性 ; 含量测定线性关系良好, 芦丁回收率为 100.6(RSD=0.4, n=9) 结论该法简单准确重复性好, 可用于二维芦丁片中芦丁的溶出度及含量的测定关键词 : 二维芦丁片 ; 芦丁 ; 溶出度 ; 含量 ; 高效液相色谱法中图分类号 :R 文献标志码 :B 文章编号 : (2018) DOI: /j.cnki.issn 引用本文 : 文春梅, 郑舒娴, 王建. HPLC 测定二维芦丁片复方制剂中芦丁的溶出度和含量 [J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(2): Determination of Dissolution and Content of Two-dimensional Rutin Tables by HPLC WEN Chunmei 1, ZHENG Shuxian 1, WANG Jian 2* (1.Zhejiang University of Technology, Hangzhou , China; 2.Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou , China) ABSTRACT: OBJECTIVE To determine dissolution and content of rutin in Two-dimensional Rutin tablets by HPLC. METHODS The dissolution medium of determination of dissolution was water (containing 0.5 SDS ). Apparatus 2 was used with 75 r min 1. The dissiution medium was taken and analyzed by HPLC at 45 min. Determination of content was measured using a Thermo C 18 column. The mobile phase was treated with phosphate buffer (0.l mol L 1 sodium dihydrogen phosphate solution and adjusted to ph 4.4 with phosphoric acid) - acetonitrile (80 20). The detection wavelength was 254 nm. RESULTS Dissolution determination: it showed that stardard curve was linear in the range of μg ml 1 (r= ). The average recovery was 98.2 (RSD=0.4) for rutin. The disslution of Two-dimensional Rutin tablets from three batches were >75. Determination of content: the method for determination of rutin had a good linearity, and the recovery was 100.6(RSD=0.4, n=9). CONCLUSION The method is simple, sensitive and reproducible, and it can be used for the determination of dissolution and content of Two-dimensional Rutin tablets. KEY WORDS: Two-dimensional Rutin tablets; rutin; dissolution; content; HPLC 芦丁具有降低毛细血管异常通透性和脆性的作用, 临床主要用于高血压病的辅助治疗二维芦丁片是由维生素 C 维生素 B6 芦丁制成的复方制剂, 用于高胆固醇血症及动脉粥样硬化治疗亚油酸维生素 E 胶丸 / 二维芦丁片由杭州华东医药集团五丰制药厂生产目前执行国家药品监督管理局国家药品标准试行 WS (HD-1263)- 2002, 国内外药典 ( 中国药典 USP BP EP 和 JP) 均未见收载试行标准中采用 UV 法测定芦丁含量, 专属性差, 前处理过程产生的误差很大, 因此本实验将芦丁的含量测定方法由 UV 法改为 HPLC; 试行标准二维芦丁片中未设溶出度检查项, 考虑到芦丁为水难溶性药物, 因此本实验研究了芦丁的溶出度检查方法本实验参照中国药典 2015 年版曲克芦丁的液相色谱条件, 和相关的 [1-3] [4-5] 含量和溶出度文献, 研究建立了 HPLC 测定二维芦丁片中芦丁溶出度和含量的方法, 并在标准中增订了芦丁的溶出度检查, 将芦丁的含量测定方法由 UV 法改为了 HPLC, 经方法学试验, 方法简便可行, 可用于本品的质量控制 1 仪器与试药 LC-20AD 液相色谱仪 ( 日本岛津, 包括在线真空脱气机, 二元泵, 自动进样系统等 );AT7 型溶出仪 ( 瑞士 SOTAX, 采用针式取样方式 );Hanson 基金项目 : 国家药品标准提高研究项目 ( 食药监药化管便函 [2015]1057 号 ) 作者简介 : 文春梅, 女, 硕士生 Tel: @qq.com (0571) wangjianhw2000@aliyun.com * 通信作者 : 王建, 男, 博士, 主任药师, 博导 Tel: 188 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 February, Vol.35 No.2 中国现代应用药学 2018 年 2 月第 35 卷第 2 期

2 在线过滤器 ( 孔径 10 μm) 水为蒸馏水 ; 乙腈为色谱纯 ; 磷酸二氢钠戊烷磺酸钠均为分析纯 ; 芦丁对照品 ( 中国食品药品检定研究院, 批号 : , 含量 :91.1); 二维芦丁片及空白辅料 ( 杭州华东医药集团五丰制药厂, 规格 :10, 批号 : , , ) 槲皮素对照( 中国食品药品检定研究院, 批号 : , 纯度为 98.6) 2 方法与结果 2.1 色谱条件二维芦丁片为复方制剂, 且芦丁规格小, 因此采用专属性强的 HPLC 测定本品中芦丁的溶出度和含量含量测定色谱条件色谱柱 :Thermo C 18 柱 (4.6 mm 250 mm,5 μm), 以磷酸盐缓冲液 (0.l mol L 1 磷酸二氢钠溶液, 用磷酸调节 ph 值至 4.4)- 乙腈 (80 20) 为流动相, 检测波长为 254 nm; 流速 :1.0 ml min 1, 柱温 :30, 进样量 :10 µl 溶出度色谱条件进样量 :20 µl, 其他条件同含量测定色谱条件 2.2 溶出度测定二维芦丁片在 4 种溶出介质中的溶出曲线和溶出条件的选择取本品, 照溶出度与释放度测定法 ( 中国药典 2015 年版通则 0931 第二法 [6] ), 分别以 4 种溶剂 [ 分别为水 ph 1.2 的盐酸溶液 2 mol L 1 醋酸溶液 (ph 4.0) ph 6.8 磷酸盐缓冲液, 4 种溶出介质中均含 0.5SDS]900 ml 为溶出介质, 转速为 75 r min 1, 依法操作, 经 5,10,15, 30,45,60 min 时, 取溶出液 5 ml, 作为供试品溶液, 并及时补足溶出介质另精密称取芦丁对照品 11, 置 20 ml 量瓶中, 加甲醇适量, 超声使芦丁溶解并稀释至刻度, 摇匀, 精密量取 2 ml, 置 100 ml 量瓶中, 用溶出介质稀释至刻度, 摇匀, 作为对照品溶液按项下色谱条件测定, 取供试品溶液和对照品溶液各 20 μl, 分别注入液相色谱仪, 记录色谱图, 按外标法以峰面积计算每片芦丁的溶出量, 结果见图 1 通过上述研究, 确定溶出度检查的条件为 : 桨法, 以水 ( 含 0.5 SDS)900 ml 为溶出介质, 转速为 75 r min 1,45 min 取样图 1 二维芦丁片在 4 种溶出介质中的溶出曲线图 A ph 1.2;B ph 4.0;C ph 6.8;D 水 Fig. 1 The dissolution profile of Two-dimensional Rutin tablets in four dissolution media A ph 1.2; B ph 4.0; C ph 6.8; D water 溶出度测定方法取本品, 照溶出度与释放度测定法 ( 中国药典 2015 年版通则 0931 第二法 ), 以 0.5 SDS 900 ml 为溶出介质, 转速 75 r min 1, 依法操作, 经 45 min 时, 取溶液 10 ml, 滤过, 取续滤液作为供试品溶液另取芦丁对照品约 11, 精密称定, 置 20 ml 量瓶中, 加甲醇适量, 超声使溶解并稀释至刻度, 摇匀, 精密量取 2 ml, 置 100 ml 量瓶中, 用溶出介质稀释至刻度, 摇匀, 作为对照品溶液按项下色谱条件, 取供试品溶液和对照品溶液各 20 μl, 分别注入液相色谱仪, 记录色谱图, 按外标法以峰面积计算每片芦丁 (C 27 H 30 O 16 3H 2 O) 的溶出量限度为标示量的 75, 应符合规定方法学试验线性关系精密称取芦丁对照品适量, 用甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 精密量取适量, 加水 ( 含 0.5 SDS) 稀释制成系列浓度溶液, 按项下色谱条件测定结果回归方程 :A= C, 相关系数 r= 结果表明, 对照品溶液浓度在 2.26~22.56 μg ml 1 内与峰面积有良好的线性关系溶出度其他成分的干扰试验按处方比例, 制成不含芦丁的空白样品, 取适量, 加水 ( 含 0.5 SDS) 适量, 超声振荡, 并稀释至规定浓度, 摇匀滤过, 取滤液照项下色谱条件测定, 结果表明其他成分对芦丁的溶出度测定无干扰, 见图回收率试验按处方比例, 分别精密称取相当于样品标示量的 50,70,100 的芦丁对照品及相应量的空白辅料, 加甲醇适量, 超声振中国现代应用药学 2018 年 2 月第 35 卷第 2 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 February, Vol.35 No.2 189

3 荡使芦丁溶解, 并加水 ( 含 0.5 SDS) 至规定浓度, 摇匀, 滤过, 按项下色谱条件测定, 对本法的回收率进行考察结果见表 1 可见本法的回收率较高, 可用于溶出度的测定精密量取续滤液 5 ml, 置 25 ml 量瓶中, 用流动相稀释至刻度, 摇匀, 作为含量测定的供试品溶液表 1 溶出度的回收率测定结果 (n=9) Tab. 1 The results of recovery for dissolution(n=9) 模拟浓度 / 加入量 / 测定量 / 回收率 / 平均值 / RSD/ 图 2 3 批二维芦丁片的溶出曲线 A ;B ;C Fig. 2 Dissolution curves of two batchs of Two-dimensional Rutin tablets. A ; B ; C 溶液的稳定性取供试品溶液, 按项下色谱条件测定, 于 0,2,4,8 h 测定, 结果 RSD 为 1.3, 溶液在 8 h 内稳定样品的溶出度测定结果取杭州华东医药集团五丰制药厂样品 3 批, 照溶出度测定法 ( 中国药典 2015 年版通则 0931 第二法 ), 以水 ( 含 0.5SDS) 为溶出介质, 转速为 75 r min 1, 依法操作, 在 5,10,15,30,45,60 min 时, 分别取溶液 10 ml, 滤过, 并及时在操作容器中补充上述溶剂 10 ml 另精密称取芦丁对照品 11, 置 20 ml 量瓶中, 加甲醇适量, 超声使芦丁溶解并稀释至刻度, 摇匀, 精密量取 2 ml, 置 100 ml 量瓶中, 用溶出介质稀释至刻度, 摇匀, 作为对照品溶液按项下色谱条件测定, 取供试品溶液和对照品溶液各 20 μl, 分别注入液相色谱仪, 记录色谱图, 按外标法以峰面积计算每片的溶出量结果见图 2~3 根据溶出曲线试验结果, 将取样时间定为 45 min, 限度定为含量测定溶液的配制精密称取芦丁对照品约 10, 精密称定, 置 50 ml 量瓶中, 加甲醇约 10 ml, 超声使溶解, 用流动相稀释至刻度, 摇匀, 作为含量测定的对照品溶液 ; 取本品 20 片, 精密称定, 研细, 取细粉适量 ( 约相当于芦丁 50 ), 精密称定, 置 50 ml 量瓶中, 加甲醇适量, 超声使芦丁溶解, 用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 滤过, 图 3 溶出色谱图 A 对照品溶液 ;B 供试品溶液 ( 批号 : );C 空白样品溶液 ; 1 芦丁 Fig. 3 Dissolution chromatogram A standard solution; B sample solution(batch ); C blank; 1 rutin 系统适用性试验取芦丁对照品和槲皮素对照品各适量, 加甲醇适量使溶解, 用流动相稀释制成每 l ml 中分别约含 0.2 和 2 µg 的溶液, 作为系统适用性溶液, 取 10 µl 按项下的色谱条件进行分析, 记录色谱图, 结果见图 4, 芦丁峰与槲皮素峰的理论板数分别为 8 967,9 521, 芦丁峰与槲皮素峰之间的分离度为图 4 系统适用性试验色谱图 1 芦丁 ;2 槲皮素 Fig. 4 Chromatogram of system suitability test 1 rutin; 2 quercetin. 190 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 February, Vol.35 No.2 中国现代应用药学 2018 年 2 月第 35 卷第 2 期

4 2.3.3 方法专属性试验芦丁与槲皮素的分离取项下的系统适用性溶液 10 µl, 按项下色谱条件测定, 确定芦丁和槲皮素的保留时间, 考察两者之间的分离度, 结果见图 4 结果表明, 在上述色谱条件下, 芦丁与槲皮素完全分离强力破坏试验分别取 5 份芦丁原料药和二维芦丁片细粉各适量, 其中 2 份分别加入 0.1 mol L 1 氢氧化钠溶液 0.5 ml 和 0.1 mol L 1 盐酸溶液 0.5 ml, 加入碱的那份放置 0.5 h 后中和, 加入酸的那份放置 1 h 后中和 ; 一份加 3 过氧化氢溶液 0.5 ml, 放置 2 h; 另外 2 份分别在 105 下放置 3 h 和于强光下 (4 500 lx) 照射 5 d, 分别加甲醇适量, 超声使芦丁溶解, 用流动相稀释制成每 1 ml 中约含 0.2 的溶液, 滤过, 取上述处理后的溶液各 10 μl 进样分析, 结果芦丁对强光碱氧化破坏基本稳定, 在酸高温破坏下, 有降解产物产生, 产生的主要降解产物是槲皮素, 对主峰含量测定无干扰其他峰干扰按二维芦丁片处方制备不含芦丁的缺味溶液, 进样, 记录色谱图结果表明二维芦丁片中的辅料维生素 C 和维生素 B6, 对芦丁的含量测定无干扰, 色谱图见图方法学试验线性关系精密称取芦丁对照品适量, 加甲醇适量, 超声使溶解, 用流动相定量稀释制成每 1 ml 中约含 0.04,0.10,0.20,0.30 和 0.40 的溶液按项下色谱条件测定得线性方程为 A= C ,r= (n=5) 结果表明, 芦丁在 0.04~0.40 ml 1 内线性良好回收率试验按处方比例, 分别精密称取相当于样品标示量的 80,100,120 的芦丁对照品及相应量的空白辅料, 加甲醇适量, 超声使芦丁溶解, 并加流动相稀释至规定浓度, 摇匀, 滤过, 按项下色谱条件测定, 对本法的准确度进行考察结果见表仪器精密度试验取批号为的样品 6 份, 照确定的含量测定方法测定, 结果 RSD 为样品含量测定取 3 批样品, 照确定的方法, 进样测定, 结果批号为 , , 的 4 批样品, 含量分别为 99.5,99.5,99.1, 含量测定 HPLC 色谱图见图 5 表 2 芦丁测定回收率测定结果 (n=9) Tab. 2 The results of recovery for rutin(n=9) 模拟浓度 / 加入量 / 测定量 / 回收率 / 平均值 / RSD/ 图 5 含量测定典型色谱图 A 对照品溶液 ;B 供试品溶液 ( 批号 : );C 空白样品溶液 ; 1 芦丁 Fig. 5 Typical chromatogram of content determination A standard solution; B sample solution(batch ); C blank; 1 rutin. 3 讨论 3.1 芦丁在 4 种溶出介质中的溶解度和表面活性剂 SDS 浓度的选择取芦丁原料药 10, 置带塞三角瓶中, 分别加入 ph 1.2 盐酸缓冲液 ph 4.0 醋酸缓冲液水和 ph6.8 磷酸缓冲液 4 种溶出介质 250 ml, 振摇, 在 37 水浴中放置 3 h, 其间每隔 0.5 h 取出振摇一次结果芦丁在 4 种溶出介质均未完全溶解, 在水和 ph 4.0 醋酸缓冲液中的溶解度大于 ph 1.2 盐酸溶液中的溶解度, 在 ph 6.8 磷酸缓冲液中的溶解度最差因此在溶出介质中需添加表面活性剂 SDS 试验了在 4 种溶出介质中分别添加 0.1,0.2, 0.3,0.4 和 0.5SDS, 结果添加 0.1,0.2, 0.3,0.4SDS, 芦丁在 4 种溶出介质均未完全中国现代应用药学 2018 年 2 月第 35 卷第 2 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 February, Vol.35 No.2 191

5 溶解 ; 添加 0.5SDS, 芦丁在水和 ph 4.0 醋酸缓冲液中溶解完全, 在 ph 1.2 盐酸溶液中未完全溶解, 在 ph 6.8 磷酸缓冲液中的溶解较差因此在溶出介质中添加 0.5SDS 3.2 溶出介质的选择根据二维芦丁片在 4 种溶出介质中 (ph 1.2 盐酸缓冲液,pH 4.0 醋酸缓冲液, 水和 ph 6.8 磷酸缓冲液且均含 0.5SDS) 的溶出曲线, 确定水 ( 含 0.5 SDS)900 ml 为溶出介质最佳 3.3 转速的选择比较了浆法转速为 75 r min 1 和转速为 50 r min 1 的溶出度, 结果表明, 转速为 50 r min 1, 溶出度低 ; 转速为 75 r min 1,45 min 可基本完全溶出因此转速选择 75 r min 滤膜的吸附作用考察水 ( 含 0.5 SDS) 为溶出介质的溶出液经滤膜过滤 ( 津隆 MICRO PES 聚醚砜, 水系,0.45 μm), 与离心过后的溶出液比较,HPLC 测定经滤膜过滤后峰面积为 , 离心后峰面积为 , 说明水 ( 含 0.5 SDS) 为溶出介质, 滤膜对芦丁无吸附 REFERENCES [1] ATTIA T Z. Simultaneous determination of rutin and ascorbic acid mixture in their pure forms and combined dosage form [J]. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2016(169): [2] MA J Y, ZHANG C X, ZHAO B T. Determination of Rutin tablets and Compound Rutin tablets from different manufacturers by RP-HPLC [J]. J Northwest Norm Univ(Nat Sci)( 西北师范大学学报 ), 2010, 46(5): [3] SUN Y H. Determination of vitamin C and rutin in Compound Rutin tablets by HPLC with dual-wavelength [J]. Anhui Med Pharm J( 安徽医药 ), 2012, 16(1): [4] ZHANG P, CHEN R, WANG Y, et al. Study on the dissolution determination of Compound Rutin tablets [J]. Pharm Care Res( 药学服务与研究 ), 2016, 16(3): [5] SHI J M, LIN L. Study on dissolution method of Troxerutin tablets [J]. J Guangdong Pharm Univ( 广东药学院学报 ), 2012, 28(3): [6] 中国药典. 四部 [S]. 2015: 收稿日期 : ( 本文责编 : 曹粤锋 ) 192 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 February, Vol.35 No.2 中国现代应用药学 2018 年 2 月第 35 卷第 2 期

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.