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粉帖暨
4 years ago
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1 HPLC 测定注射用地西他滨的含量及有关物质吉同琴, 赵砚荣, 韩继永, 陈祥峰 ( 江苏奥赛康药业股份有限公司, 南京 ) 摘要 : 目的建立高效液相色谱法测定注射用地西他滨的含量及有关物质方法采用 Shimpack VP-ODS 色谱柱 (250 mm 4.6 mm,5 μm), 以 0.01 mol L 1 磷酸钾缓冲液 ( 用磷酸调节 ph 值至 6.8)- 甲醇 (98 2) 为流动相, 流速 :1.0 ml min 1, 检测波长 :220 nm, 柱温 :15, 进样量 :5 µl 结果主峰能与相邻杂质峰较好分离地西他滨浓度在 5.028~ µg ml 1 内与峰面积呈良好的线性关系,r= 低中高浓度平均回收率(n=3) 分别为 99.8%,100.2%,99.6%;RSD 分别为 0.27%,0.51%,0.60%; 测定 3 批样品的含量分别为 100.6%,99.3%,99.5%, 有关物质分别为 0.56%,0.49%,0.44% 作者简介 : 吉同琴, 女, 药师 Tel: (025) jitongqin@ask-pharm.com 352 Chin JMAP, 2012 April, Vol.29 No.4 中国现代应用药学 2012 年 4 月第 29 卷第 4 期

2 结论该方法简便准确专属性强, 可用于测定注射用地西他滨的含量及有关物质关键词 : 注射用地西他滨 ; 含量测定 ; 有关物质 ; 高效液相色谱法中图分类号 :R 文献标志码 :B 文章编号 : (2012) Determination of the Content of Decitabine for Injection and Its Related Substances by HPLC JI Tongqin, ZHAO Yanrong, HAN Jiyong, CHEN Xiangfeng(Jiangsu Aosaikang Pharmaceutical Co., Ltd., Nanjing , China) ABSTRACT: OBJECTIVE To establish an HPLC method to determine the content of decitabine for injection and its related substances. METHODS The assay was conducted on a Shimpack VP ODS column(250 mm 4.6 mm, 5 µm) with 0.01 mol L 1 solution of potassium phosphate buffer (adjust to ph 6.8 with phosphoric acid)-methanol (98 2) as mobile phase at the flow rate of 1.0 ml min 1. The detection wavelength was set at 220 nm. Temperature was 15. The injection volume was 5 µl. RESULTS Decitabine was completely separated from impurities. The linear concentration range of decitabine was µg ml 1 with the correlation coefficient of The recoveries(n=3) of low, medium and high concentration were 99.8%, 100.2%, 99.6%, and RSDs were 0.27%, 0.51%, 0.60%, respectively. Determination of the content of three samples were 100.6%, 99.3%, 99.5%, the related substances were 0.56%, 0.49%, 0.44%. CONCLUSION The method is simple, accurate, specific and suitable for the determination of the content and the related substances of decitabine for injection. KEYWORDS: decitabine for injection; content determination; related substance; HPLC 地西他滨 (decitabine) 是一种去甲基化药物, 其化学名为 4- 氨基 -1-(2- 脱氧 -β-d- 赤型 - 呋喃核糖 )-1,3,5- 三嗪 -2(1H)- 酮, 具有独特的甲基化转移酶抑制剂的治疗机制 [1] 2006 年美国 FDA 批准了 MGI 制药和 SuperGen 公司的注射用地西他滨的上市申请, 商品名为 Dacogen, 用于治疗骨髓异常综合征 (MDS) 地西他滨通过磷酸化后直接掺入 DNA, 抑制 DNA 甲基化转移酶, 引起 DNA 低甲基化和细胞分化或凋亡来发挥抗肿瘤作用 [2] 2008 年国家食品药品监督管理局批准西安杨森制药有限公司的进口申请, 允许注射用地西他滨在国内上市采用高效液相色谱法测定地西他滨含量及有关物质的检测方法, 已有注射用地西他滨国家食品药品监督管理局药品注册标准 (JX ) [3] 以及地西他滨国外文献报道可参照, 以上 2 个色谱条件基本相似, 流动相均为纯水相, 由于采用纯水系统对色谱柱损伤较大, 本实验考虑在缓冲液中增加适量的有机相, 以保护色谱柱, 因此建立了另一种高效液相色谱法测定注射用地西他滨含量及有关物质的方法 1 仪器与试药 Agilent 1200 型高效液相色谱仪 ( 美国 Agilent 公司 ), 包括 G1312 二元泵,G1315D 二极管阵列检测器,G1316A 柱温箱,G1367B 自动进样器, G1322A 在线脱气机,ChemStation for LC 3D systems 工作站 (Rev.B.04.01);BP211D 电子分析天平 ( 德国赛多利斯仪器有限公司 );Sevenmuti 40 ph 计 ( 梅特勒托利多仪器有限公司 );EPED-20DC 超纯水仪 ( 南京易普益达科技发展有限公司 ) 地西他滨对照品 ( 南京海光应用化学研究所, 纯度 :100%, 批号 :081126) 地西他滨 α- 异构体 ( 南京海光应用化学研究所, 纯度 :99.64%, 批号 : ) 注射用地西他滨( 南京海光应用化学研究所, 批号 :090201,090202,090203, 规格 : 50 mg) 磷酸钾磷酸( 分析纯, 南京化学试剂有限公司 ); 水为超纯水 ( 自制 ) 2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱 :Shimpack VP-ODS(250 mm 4.6 mm, 5 μm) Agilent Zorbax SB-C 18 (250 mm 4.6 mm, 5 μm) Supelcosil LC-18-S(250 mm 4.6 mm, 5 μm); 流动相 :0.01 mol L 1 磷酸钾缓冲液 ( 用磷酸调节 ph 值至 6.8)- 甲醇 (98 2); 检测波长 : 220 nm; 流速 :1.0 ml min 1 ; 柱温 :15 ; 进样量 :5 µl 2.2 系统适用性试验称取地西他滨 α- 异构体与地西他滨适量, 加甲醇溶解并稀释制成每 1 ml 中各含 0.05 mg 混合溶液按 2.1 项下色谱条件, 取混合溶液 5 µl 注入液相色谱仪, 记录色谱图试验结果表明, 地西他滨与 α- 异构体之间的分离度为 3.81, 理论板数按地西他滨峰计算为 3 049, 见图 1 中国现代应用药学 2012 年 4 月第 29 卷第 4 期 Chin JMAP, 2012 April, Vol.29 No.4 353

3 图 1 地西他滨系统适用性试验图谱 1 地西他滨 ;2 α- 异构体 Fig 1 HPLC chromatograms of system applicability test 1 decitabine; 2 α-isomer 采用色谱柱 Agilent Zorbax SB-C 18, 地西他滨与 α- 异构体之间的分离度为 3.55, 理论板数按地西他滨峰计算为 2 767; 采用色谱柱 Supelcosil LC-18-S, 地西他滨与 α- 异构体之间的分离度为 3.09, 理论板数按地西他滨峰计算为含量测定有关物质检查精密称取注射用地西他滨适量, 加甲醇制成含地西他滨 0.5 mg ml 1 的溶液作为供试品溶液 ; 将供试品溶液用甲醇稀释 100 倍, 作为对照溶液按 2.1 项下色谱条件, 取对照溶液 5 µl 注入液相色谱仪, 调节检测灵敏度, 使主成分色谱峰的峰高为满量程的 20%~25%; 再量取供试品溶液 5 µl, 注入液相色谱仪, 记录色谱图至主成分峰保留时间的 3.5 倍扣除溶剂峰, 量取色谱图上除地西他滨色谱峰外各峰面积总和, 并与对照溶液主成分的峰面积比较, 计算有关物质含量图 2 注射用地西他滨有关物质检查图谱 A 注射用地西他滨 ;B 空白溶剂 Fig 2 HPLC chromatograms of related substances A decitabine for injection; B blank solvent 含量测定取本品内容物, 精密称定, 加甲醇制成含地西他滨 0.1 mg ml 1 的溶液, 滤过, 精密量取 5 µl 注入液相色谱仪, 记录色谱图 ; 另取地西他滨对照品适量, 同法测定按外标法以峰面积计算, 即得图 3 注射用地西他滨含量测定图谱 A 对照品 ;B 样品 Fig 3 HPLC chromatograms of content determination A control; B sample 2.4 方法学考察辅料干扰性试验取注射用地西他滨的处方比例的空白辅料适量, 用流动相溶解后, 按 2.1 项下色谱条件测定, 结果表明, 辅料在此色谱条件下不出峰, 对本品有关物质及含量测定无干扰破坏性试验 1 酸破坏 : 取注射用地西他滨 ( 约含地西他滨 10 mg), 置 20 ml 量瓶中, 加 0.1 mol L 1 盐酸溶液 5 ml, 摇匀, 置室温下放置 30 min 后, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 滤过 2 碱破坏 : 取注射用地西他滨 ( 约含地西他滨 10 mg), 置 20 ml 量瓶中, 加 0.1 mol L 1 氢氧化钠溶液 5 ml, 摇匀, 置室温下放置 5 min 后, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 滤过 3 氧化破坏 : 取注射用地西他滨 ( 约含地西他滨 10 mg), 置 20 ml 量瓶中, 加 10% 过氧化氢 5 ml, 摇匀, 置室温下放置 60 min 后, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 滤过 4 热破坏 : 取注射用地西他滨 ( 约含地西他滨 10 mg), 置 20 ml 量瓶中, 加适量水使溶解, 置 80 水浴上, 加热 10 min 后, 放冷并加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 滤过 5 强光破坏 : 取注射用地西他滨 ( 约含地西他滨 10 mg), 置 20 ml 量瓶中, 加甲醇适量使溶解后, 置强光条件下 (7 500 Lx) 照射 4 h, 再加甲醇至刻度, 摇匀, 滤过分别取上述破坏性试验溶液, 按 2.1 项下色谱条件测定, 结果表明本品在光照条件下较稳定, 在加酸加碱加热及氧化破坏条件下均不稳定, 在各条件下产生若干不同降解产物峰, 且主峰与各降解产物分离度良好, 结果见图线性关系考察精密称取于 105 干燥至恒重的地西他滨对照品约 100 mg, 置 50 ml 量瓶中, 加甲醇使溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为对照品储备液精密量取储备液 0.25,0.5,1.0,2.0, 5.0,7.0,10.0 ml, 分别置 100 ml 量瓶中, 加甲 354 Chin JMAP, 2012 April, Vol.29 No.4 中国现代应用药学 2012 年 4 月第 29 卷第 4 期

4 试品流动相溶液 1 h 有关物质变化较大, 溶液稳定性较差重复性试验取注射用地西他滨同一批号样品 ( 批号 :090201) 适量, 按 2.1 项下色谱条件分别测定含量和有关物质, 平行测定 6 份结果含量为 100.6%,RSD 为 0.26%(n=6); 有关物质含量为 0.46%,RSD 为 0.81%(n=6) 回收率试验按处方量称取空白辅料适量, 置 100 ml 量瓶中, 平行 9 份, 平均分成 3 组, 分别精密加入项下对照品储备液 4.0,5.0, 6.0 ml, 用甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为供试品溶液 ; 同时配制对照品溶液, 按 2.1 项下色谱条件测定, 计算回收率结果见表 1 图 4 破坏性试验样品色谱图 A 酸破坏 ;B 碱破坏 ;C 氧化破坏 ;D 加热破坏 ;E 强光破坏 ;F 未破坏 Fig 4 HPLC chromatograms of destroyed samples A destroyed by acid; B destroyed by alkali; C destroyed by oxidation; D destroyed by heating; E destroyed under strong light; F unbroken 表 1 地西他滨回收率 (n=3) Tab 1 Recovery of Decitabine(n=3) 加入量 / mg 测得量 / mg 回收率 / % 平均回收率 /% RSD/ % 醇稀释至刻度, 摇匀, 分别精密量取 5 µl 注入液相色谱仪, 记录色谱图以进样浓度 (X) 为横坐标, 峰面积 (Y) 为纵坐标, 绘制标准曲线回归方程为 : Y= X ,r= 结果表明, 地西他滨进样浓度在 5.028~ μg ml 1 内与峰面积呈良好的线性关系仪器精密度试验精密称取地西他滨对照品适量, 加甲醇溶解并稀释成 0.1 mg ml 1 的溶液, 按 2.1 项下色谱条件测定, 连续进样 6 次, 计算峰面积的 RSD 为 0.51%(n=6), 结果表明本法仪器精密度良好检测限与定量限试验取地西他滨对照品适量, 加甲醇配制成适宜浓度, 并用甲醇逐步稀释, 按 2.1 项下色谱条件测定, 以信噪比约为 10 1 时作为定量限, 信噪比约为 3 1 时作为检测限, 结果表明地西他滨的定量限为 5.02 ng, 检测限为 1.67 ng 稳定性试验取注射用地西他滨适量, 分别加甲醇和流动相使溶解并稀释成 0.5 mg ml 1 的溶液, 滤过, 取续滤液作为供试品溶液, 于室温放置分别于 0,1,2,4,6,8 h, 按 2.1 项下色谱条件测定, 考察有关物质的变化情况结果表明, 供试品甲醇溶液在 8 h 内稳定性良好 ; 供样品测定按 2.1 项下色谱条件和 2.3 项下方法, 对 3 批样品的含量和有关物质进行测定, 结果见表 2 表 2 注射用地西他滨有关物质与含量测定结果 (n=3) Tab 2 Results of determination of decitabine for injection content and its related substances(n=3) 有关物质地西他滨批号总量 /% RSD/% 含量 /% RSD/% 讨论 3.1 流动相的选择流动相筛选过程中发现, 地西他滨对有机相比较敏感, 在流动相中添加 5% 以上的甲醇或乙腈中国现代应用药学 2012 年 4 月第 29 卷第 4 期 Chin JMAP, 2012 April, Vol.29 No.4 355

5 后会使地西他滨主峰的保留时间显著提前, 导致与有关物质无法完全分离由于普通的 C 18 柱对纯水系统的耐用性差, 因此在流动相中适当添加少量的甲醇, 以保护色谱柱, 同时确保各有关物质有良好的分离度 3.2 溶剂的选择由于本品在水溶液中容易水解, 经试验, 本品在甲醇中的稳定性比在流动相中好, 故采用甲醇作为溶剂 3.3 柱温的选择研究中发现地西他滨在水溶液中容易水解, 并且存在温度依赖性, 故将色谱条件中柱温设定为 15, 地西他滨溶液在低温下保存, 并在 4 h 内使用 3.4 进样体积的选择采用甲醇作溶剂, 溶剂效应明显, 使地西他滨主峰发生严重变形为消除溶剂对分离效果的影响, 减小甲醇的进样量, 将进样体积由 20 µl 减少到 5 µl, 以降低溶剂效应的影响 3.5 检测波长的选择采用二极管阵列检测器对注射用地西他滨破坏性试验中产生的杂质进行全波长扫描, 数个杂质峰均在 220 nm 的波长处有吸收, 注射用地西他滨色谱峰及其前后的杂质峰在 220,244 nm 的波长处均有吸收, 为了能检测到更多的杂质, 确定将杂质的吸收波长 220 nm 作为检测波长 REFERENCES [1] KE Q, CEN H, HU X H. Treatment evolution in hematopoietic malignancies with an hypomethylating agent decitabine [J]. Med Recapit( 医学综述 ), 2010, 16(7): [2] WANG J C, LI M J. Decitabine of treatment of myelodysplastic syndrome research progress [J]. J Chin Pract Diagn Therap( 中华实用诊断与治疗杂志 ), 2008, 22(8): [3] KUN-TSAN L, RICHARD L M, GEORGES E R. Highperformance liquid chromatographic analysis of chemical stability of 5-Aza-2 -deoxycytidine [J]. J Pharm Sci, 1981, 70(11): 收稿日期 :

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.