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调端吉
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1 05 年 8 月第卷第 8 期中国中医药信息杂志 8 秦皮提取物中香豆素类成分含量测定方法研究叶迎,柏冬,包强,王瑞海,刘丽梅.中国中医科学院中医基础理论研究所,北京甘肃省中医院,甘肃兰州摘要目的分别建立秦皮提取物总香豆素和 4 种主要香豆素成分紫外分光光度法(UV)和高效液相色谱法 (HPLC)含量测定方法方法采用 UV,以秦皮甲素为对照品,在 4 nm 测定秦皮提取物总香豆素的含量采用 HPLC,用 Agilent ZORBAX SB-C8 色谱柱(4.6 mm 50 mm,5 μm),以乙腈-0.0%磷酸溶液为流动相梯度洗脱,在 4 nm 测定秦皮提取物中秦皮甲素秦皮苷秦皮乙素秦皮素 4 种主要香豆素成分的含量结果秦皮甲素的质量浓度在 μg/ml 范围内线性关系良好(r ),平均为 00.6%(.8%) 4 种香豆素成分秦皮甲素秦皮苷秦皮乙素秦皮素的质量分别在 μg(r ) μg(r ) μg(r ) μg(r )范围内线性关系良好,平均分别为 96.97%(.6%) 00.80%(.%) 99.04%(.47%) 98.77% (.94%) 结论种含量测定方法简便准确可靠,可用于秦皮提取物总香豆素和主要香豆素成分的质量控制关键词秦皮提取物香豆素紫外分光光度法高效液相色谱法含量测定 DOI 0.969/j.issn 中图分类号 R84. 文献标识码 A 文章编号 (05) Study on Content Determination of Coumarin in Fraxini Cortex Extract YE Ying, BAI Dong, BAO Qiang, WANG Rui-hai, LIU Li-mei (.Institute of Basic Theory Research of TCM, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 00700, China.Gansu Province Hospital of TCM, Lanzhou 70050, China) Abstract Objective To establish a UV spectrophotometry method and an HPLC method respectively for the determination of the total content of coumarin and contents of four main constituents of coumarin in Fraxini Cortex extract. Methods UV spectrophotometry was used for the determination of the content of total coumarin in Fraxini Cortex extract. The reference substance was Aesculin, and the maximum ultraviolet absorption wavelength was 4 nm. The HPLC method was used to determine the contents of Aesculin, Fraxin, Aesculetin and Fraxetin in Fraxini Cortex extract, using gradient elution with acetonitrile-phosphate solution (0.0%) as mobile phase on Agilent ZORBAX SB-C8 chromatographic column (4.6 mm 50 mm, 5 μm) at room temperature. Results For the UV method, the linear range of the mass concentration of Aesculin was μg/ml (r ), and the average recovery was 00.6% (.8%). For the HPLC method, the linear ranges of the mass of Aesculin, Fraxin, Aesculetin and Fraxetin were μg (r ), μg (r ), μg (r ), and μg (r ), respectively, and the average recoveries were 96.97% (.6%), 00.80% (.%), 99.04% (.47%), and 98.77% (.94%), respectively. Conclusion Both of the two methods are simple, accurate and reliable, and can be used for the quality control of total coumarin and the main constituents of coumarin in Fraxini Cortex extract. Key words Fraxini Cortex extract coumarin UV spectrophotometry HPLC content determination 基金项目中国中医科学院基本科研业务费自主选题项目(YZ-4) 通讯作者刘丽梅, liulimeihrb@sina.com

2 84 Chinese Journal of Information on TCM Aug.05 Vol. No.8 秦皮, 神神农本草经将其列为上上品 00 年版中华人民共和和国药典规规定秦皮为木木犀科植物苦苦枥白蜡树 Fraxinus rhynchophylla Hance 白蜡树 F.chinensis Roxb. 尖叶白蜡树 F.szaboana Lingelsh. 或宿宿柱白蜡树 F.stylosa Lingelsh. 的干燥枝枝皮或干皮研究表明, 秦皮的主要要有效成分为为香豆素素类化合物 [] 药理研究发现, 秦皮提提取物能够保保护小鼠急性肝损伤 [], 对辐射射所致脂质过过氧化反应有有明显的抑制作用 [], 对大鼠实实验性脂肪肝肝有一定治疗疗作用 [4] 目前对于于秦皮药材中中香豆素类成成分的含量测测定方法法已有报道 [5-6], 而秦皮提提取物中总香香豆素和主要要香豆素素成分含量测测定方法未见见报道本实实验室从秦皮皮药材中提取分离出 6 种香豆豆素类成分 [7-9], 其中秦皮皮甲.. 测定波长长的选择取秦皮甲素对对照品溶液和.. 项下供试试品溶液, 以甲醇为空白, 按 00 年版中华人民共和国药典 ( 一部 ) 分光光光度法, 在 00~500 nm 进行行扫描, 光谱图见图由由图可见, 对照品溶溶液和供试品品溶液在 4 nm 处均有最最大吸收, 故选择 4 nm 作为为测定波长素秦皮苷秦秦皮乙素秦秦皮素含量较较高 [0] 为此, 波长 /nm 本研究分别采用紫外分光光光度法 (UV) 和高效液相相色 A.5 谱法 (HPLC), 以秦皮总香豆豆素和 4 种主主要香豆素成成分.0 为质量控制指标, 建立秦皮皮提取物含量量测定方法, 为.5 秦皮皮的深入研究究开发奠定基基础.0 仪器与试药 0.5 Agilent 00 高效液液相色谱仪 ( 美国安捷伦 ), Agilent ZORBAX SB-C8 色谱谱柱 (4.6 mm 50 mm,5 µm, 波长 /nm 美国安捷伦 ),845 紫外 - 可见分光光度度计 ( 美国安安捷 B 伦 ),CX-50 超声波清洗机 ( 天海双龙医医疗设备有限限公注 :A. 对照品 ; B. 供试品司 ),CP0S 电子天平 ( 瑞士梅特勒 - 托利多 ) 图秦皮提取物及秦秦皮甲素光谱图秦皮提取物为中国中医科学院中中医基础理论论研..4 标准曲线线的制备精密量取.. 项下秦究所所中药分析实实验室自制, 分别为苦枥枥白蜡树枝皮皮采皮甲素素对照品溶液 ml, 用 75% 乙醇提取取的醇提取物, 以及水煎煎煮提取的水水提分别置置于 0 ml 量瓶中, 加甲醇醇溶解并稀释释至刻度, 摇取物物秦皮甲素素秦皮乙素素对照品购自自中国食品药药品匀, 以甲醇为空白, 按 00 年版中华人人民共和国药检定研究院, 批号分别为典 ( 一部 ) 分光光光度法, 在 4 nm 波长处测测定吸光度, 0004; 秦皮苷 (HPLC 纯度 >98%) 秦秦皮素 (HPLC 纯度 >98%) 为中国中医科学学院中医基础础理论研究所所中药分分析实验室自制乙腈为为色谱纯 (Fisher 公司 ), 其他试试剂为分析纯, 水为纯净净水方法与结果. 总香豆素素含量测定.. 对照品品溶液的制备精密称取取秦皮甲素对对照品.44 mg, 置于 5 ml 量瓶中, 加甲醇溶溶解并稀释至至刻度, 摇匀, 即得浓浓度为 88 μg/ml 的对照照品溶液.. 供试品品溶液的制备取秦皮醇醇提取物 0 mg, 精密密称定, 置锥锥形瓶中, 精密密加甲醇 0 ml, 密塞, 称定质量, 超声处理 ( 功率 50 W, 频率 00 Hz)0 min, 放冷, 再称定质量, 用甲醇补足足减失的质量, 摇匀, 过滤, 精密密量取续滤液.0 ml, 置于 0 ml 量瓶瓶中, 加甲醇醇溶解并并稀释至刻度, 摇匀, 即得得结果分分别为以吸光光度为纵坐标, 秦皮甲素素浓度 (μg/ml) 为横坐标, 绘制标标准曲线, 得回归方程 A =0.07 C , r = (n =5), 表明秦皮皮甲素在 5.76~.04 μg/mll 范围内线性性关系良好..5 精密度考考察精密量取..4 项下对照品溶液 (4.40 μg/ml), 以甲醇为为空白, 按 00 年版中华人民民共和国药典典 ( 一部 ) 分光光度法, 在 4 nm 波长处测测定吸光度, 连续测定 6 次, 结果分别别为对对照品溶液在 4 nm 处吸光度平均值为 0. 55,=.6%(n =6), 说明仪仪器精密度良良好..6 稳定性考察精密称定定秦皮醇提物 0.0 mg, 按.. 项下下方法制备供供试品溶液以甲醇为空白, 按 00 年版中华人民共共和国药典 ( 一部 ) 分光吸光度 /AU 吸光度 /AU

3 05 年 8 月第卷第 8 期中国中医药药信息杂志 85 光度法, 分别别于 h 在 4 nm 波长长处测定吸收度, 结果分别为供试试品溶液在 4 nm 处吸光度度平均值为 0.99, =.6%, 说明供试品溶液 8 h 内稳稳定性良好..7 重复复性考察取同一批次的的秦皮醇提取取物样品约 0 mg, 共 6 份, 精密密称定, 按.. 项下下方法制备供试品品溶液, 以甲醇醇为空白, 按 00 年版中华人民共和国国药典 ( 一部 ) 分光光度法, 在 4 nm 波长下测定吸光光度, 结果分别别为 ,=.5%(nn =6), 说明本本方法重复性良好好代入标准准曲线, 计算样样品中总香豆豆素的平均含量为.7%..8 加样样试验精密称取取同一批号已已知含量样品 6 份 ( 总香豆素含含量为.7% %) 各 5.0 mg, 置量瓶中, 分别加加入.06 8 mg 秦皮甲素 (0.88 mg/ /ml 秦皮甲素对照照品溶液.6 ml), 按.. 项下方方法制备供试品溶溶液, 按 00 年版中华人人民共和国药药典 ( 一部 ) 分光光光度法, 在 4 nm 波长长处测定吸光光度, 代入标准曲线线计算样品中中总香豆素的的含量, 计算总总香豆素, 结果见表平均率为 00.6%, =.8%(n =6) ), 说明本方法法准确性良好好表秦皮提取物中中总香豆素加样回试验样品品中含量平均回收率. 4 种主要要香豆素成分分含量测定.. 色谱条条件采用 Agilent ZORBAX SB-C8 色谱柱 (4.6 mm 50 mm,5 µm), 以乙腈 (A)-0.0% 磷酸 (B) 为流动相梯度度洗脱 (0~ min,8%~5%a;.0~. min,5% %~80%A;.~5 min,80%a); 柱温 5, 流速. 0 ml/min, 检测波长 4 nm.. 对照品品溶液的制备精密称取取秦皮甲素秦皮苷秦皮乙素素秦皮素对对照品适量, 分别置于 0 ml 量瓶中, 以甲醇醇溶解, 定容, 得浓度分别别为 mg/ml 的 4 种成分对照照品溶液 ; 另精密称取上述 4 种对照品适适量, 加甲醇配配制成含秦皮甲素 mg/ ml 秦皮苷 mg/ml 秦皮乙素 mg/ml 秦皮素 mg/ml 的溶液, 作为混合对对照品溶液.. 供试品品溶液的制备取秦皮提提取物适量, 粉碎, 过 80 目筛, 精密称取 0 mg, 加甲醇 0 ml, 称定定质量, 超声 40 min( 功率 50 W, 频率 00 Hz), 放冷, 用甲醇补足减失的质量, 摇匀, 滤过, 取续滤滤液作为供试试品溶液..4 专属性性考察精密密吸取混合对对照品溶液和和供试品溶液各 8 μl 进样分析, 色谱图见图图可见, 在该色谱条件下, 空白溶剂没有有影响, 可以将将秦皮中 4 种香豆素成分检测出来, 专属性性良好 A 样品品测定取秦皮醇提取物水提取物样样品各份, 约 0 mg, 精密称定, 按.. 项下方法法制备供试品溶液, 按 00 年版中华人民民共和国药典典 ( 一 4 部 ) 分光光度度法, 在 4 nm 波长处测测定吸光度, 代入标准曲线, 计算算样品中总香香豆素的含量, 结果见表 B 表秦皮醇提取物和水水提取物总香豆素含量测定结果样品试验号含量平均值醇提取物水提取物 t/m in C 注 : A. 对照品 ;B. 供试品 ;C. 空白溶溶剂 ; 秦皮皮甲素 ;. 秦皮苷 ;. 秦皮乙素 ;4. 秦皮素 9.7 图秦皮提取物中 4 种主要香豆素成分 HPLC 图

4 86 Chinese Journal of Information on TCM Aug.05 Vol. No.8..5 线性关系考察精密吸取秦皮甲素对照品溶液 ( mg/ml) µl, 秦皮苷对照品溶液 ( mg/ml) µl, 秦皮乙素对照品溶液 ( mg/ml) µl, 秦皮素对照品溶液 (0.056 mg/ml) µl, 按上述色谱条件测定峰面积以峰面积为纵坐标, 进样量为横坐标, 绘制标准曲线, 计算回归方程 Y 秦皮甲素 =.7X ,r = , 表明秦皮甲素在 ~ µg 范围内与峰面积呈良好的线性关系 ;Y 秦皮苷 =56.5X -4.74,r = , 表明秦皮苷在 ~.77 0 µg 范围内与峰面积呈良好的线性关系 ;Y 秦皮乙素 =X , r = , 表明秦皮乙素在 ~ µg 范围内与峰面积呈良好线性关系 ;Y 秦皮素 =.7X +.75,r= , 表明秦皮素在 ~0.68 µg 范围内与峰面积呈良好的线性关系..6 精密度试验精密吸取混合对照品溶液 ( 含秦皮甲素 mg/ml 秦皮苷 mg/ml 秦皮乙素 mg/ml 秦皮素 mg/ml)8 μl, 在所确定的色谱条件下, 重复进样 6 次, 计算秦皮甲素秦皮苷秦皮乙素秦皮素峰面积分别为 0.% 0.9% 0.74% 0.5%, 说明本法精密度良好..7 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液 8 μl, 分别于 h 依次进样, 计算各成分含量及其结果秦皮甲素秦皮苷秦皮乙素秦皮素平均含量分别为 %(= %) %(=.478 5%).07 8%(=.779 9%).406%(=.549 4%), 说明供试品溶液在 h 内稳定..8 重复性试验精密称取同一批样品按供试品制备 6 份供试品溶液, 分别精密吸取 8 μl 进样分析, 计算各成分含量及其结果秦皮甲素秦皮苷秦皮乙素秦皮素平均含量分别为 %(=.574 9%) 7.8 7%(=.4 %).054 0% (=.85 7%),.46 4%(=.74 %), 说明本法重复性良好..9 加样试验取同一批号已知含量样品 6 份 ( 含秦皮甲素 8.84 % 秦皮苷 % 秦皮乙素.0 6% 秦皮素.45 6%) 各 5 mg, 精密称定, 分别精密加入 mg/ml 秦皮甲素.0 ml mg/ml 秦皮苷.0 ml mg/ml 秦皮乙素 0.6 ml mg/ml 秦皮素 0.5 ml, 精密加入 6.90 ml 甲醇, 称定质量, 超声 40 min, 放冷, 再称定质量, 用甲醇补足减失的质量, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 精密吸取 8 μl 进样分析, 计算 4 种成分的及其, 结果见表 ~ 表 6 秦皮甲素秦皮苷秦皮乙素秦皮素的平均分别为 96.97% 00.80% 99.04% 98.77%,(n =6) 分别为.6%.%.47%.94% 说明本法准确性良好表秦皮甲素加样试验样品中含量平均表 4 秦皮苷加样试验样品中含量平均表 5 秦皮乙素加样试验样品中含量表 6 秦皮素加样试验平均回收率样品中含量平均样品测定取秦皮醇提取物水提取物样品各份, 约 5 mg, 精密称定, 按.. 项下方法制备

5 05 年 8 月第卷第 8 期中国中医药信息杂志 87 供试品溶液, 进样 0 μl, 在上述色谱条件下进行样品测定, 结果见表 7 表 7 秦皮醇提取物和水提取物 4 种香豆素成分含量测定结果样品试验号秦皮甲素秦皮乙素秦皮苷秦皮素总含量醇提取物均值水提取物均值讨论秦皮提取物中香豆素类成分是其发挥药效作用的物质基础, 其中秦皮甲素秦皮苷秦皮乙素秦皮素具有明确的药理活性, 所以, 以秦皮提取物中总香豆素含量及 4 种主要香豆素成分作为其质量控制指标, 是发挥其药效的重要保证本研究采用 UV 测定秦皮提取物总香豆素含量, 采用 HPLC 测定秦皮提取物 4 种主要香豆素成分的含量, 种方法线性关系良好, 精密度稳定性好, 重复性和加样符合规定, 可用于秦皮提取物总香豆素和主要香豆素成分的质量控制本课题组已建立了秦皮药材中秦皮甲素秦皮苷秦皮乙素秦皮素的含量测定方法, 本研究根据 [6] 以往工作基础以甲醇作为提取溶媒 ; 试验对超声处理加热回流种提取方法进行了比较, 测得秦皮提取物 4 种成分含量总和的结果显示, 超声法略优于回流法 ; 对甲醇用量 ml 提取进行比较试验, 结果显示不同甲醇用量测得 4 种成分含量总和相近, 故采用 0 ml 进行提取 ; 对超声提取 min 测得 4 种成分含量总和进行比较, 结果超声 40 min 提取效果最佳本研究参考前期药材检测方法及药典方法, 对甲醇 -0.5% 醋酸水溶液甲醇 -0.0% 醋酸水溶液乙腈 -0.0% 磷酸水溶液等流动相系统进行考察, 最终确定乙腈 -0.0% 磷酸水溶液系统, 并采用梯度洗脱, 缩短了检测时间, 使 4 个成分在 0 min 内达到良好分离参考文献 : [] 汪国松, 杨亚滨, 李璠, 等. 秦皮的研究进展 [J]. 国外医药 : 植物药分册, 007,():08-. [] 尹明浩, 吕惠子, 姜丽君, 等. 秦皮提取物对小鼠急性肝损伤保护作用的实验研究 [J]. 时珍国医国药,007,8(): [] 王波. 秦皮提取物的抗辐射研究 [J]. 陕西农业科学,00,56(4):40-4. [4] 杨宗辉, 魏征人, 尹建元, 等. 秦皮提取物对实验性脂肪肝的治疗作用及其机制 [J]. 中国老年学杂志,007,7(6): [5] 张秀琴, 徐礼燊. 秦皮中香豆素的含量测定 [J]. 药学通报,98,6(9):56. [6] 刘丽梅, 李曼玲, 冯伟红, 等.HPLC 法测定秦皮中香豆素类成分的含量 [J]. 中草药,004,5(7):89-8. [7] 刘丽梅, 陈琳, 王瑞海, 等. 秦皮化学成分的研究 [J]. 中草药,00, (): [8] 刘丽梅, 王瑞海, 陈琳, 等. 秦皮化学成分的研究 [J]. 中草药,00, 4(0): [9] 刘丽梅, 王瑞海, 陈琳. 苦枥白蜡树化学成分的研究 [J]. 中国民族民间医药,009,8(6):5. [0] 陈琳, 刘丽梅, 王瑞海, 等.HPLC 测定不同品种秦皮药材中香豆素成分 [J]. 中国中药杂志,008,(): ( 收稿日期 :05-0-) ( 修回日期 :05-0-6; 编辑 : 陈静 )

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.