第7期(定稿).FIT)

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1 窑苑苑愿窑 南京医科大学学报渊自然科学版冤 ACTA UNIVERSITATIS MEDICINALIS NANJING 渊 Natural Science 冤 第猿远卷第苑期 20 员远年苑月 在小鼠精原干细胞中的表达研究 高亭亭员袁邵彬彬圆袁张 茜员袁蔡金洋员袁黄晓燕员鄢 渊员南京医科大学生殖医学国家重点实验室袁组织胚胎学系袁江苏南京圆员员员远远曰圆南京医科大学第二附属医院妇产科袁江苏 南京 圆员园园员员冤 咱摘要暂目的院验证脂肪酰胺水解酶渊枣葬贼贼赠葬糟蚤凿葬皂蚤凿藻澡赠凿则燥造葬泽藻袁冤在小鼠精原干细胞渊泽责藻则皂葬贼燥早燥灶蚤葬造泽贼藻皂糟藻造造袁杂杂悦泽冤中的表达遥方法院构建稳定的小鼠杂杂悦泽培养平台袁宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼法检测在小鼠各组织脏器和杂杂悦泽的表达袁免疫荧光法检测在睾丸组织及杂杂悦泽中的定位情况遥结果院宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼结果表明在睾丸组织高表达遥免疫荧光显示定位于小鼠杂杂悦泽的细胞膜并且与已知的分选标记神经胶质细胞源性的神经营养因子渊郧阅晕云冤家族受体琢员渊郧阅晕云枣葬皂蚤造赠则藻糟藻责贼燥则葬造责澡葬鄄员袁郧云砸琢员冤共定位遥结论院可作为一个新的杂杂悦泽分选富集的表面分子标记袁为进一步研究在精子发生的作用打下基础遥咱关键词暂精原干细胞曰脂肪酰胺水解酶曰细胞分选咱中图分类号暂 R 猿猿怨援圆咱文献标志码暂 A 咱文章编号暂员园园苑鄄源猿远愿渊圆园员远冤园苑鄄苑苑愿鄄园缘凿燥蚤院员园援苑远缘缘辕晕再阅载月晕杂圆园员远园苑园猿 粤泽贼怎凿赠燥枣藻曾责则藻泽泽蚤燥灶蚤灶泽责藻则皂葬贼燥早燥灶蚤葬造泽贼藻皂糟藻造造泽郧葬燥栽蚤灶早贼蚤灶早员袁杂澡葬燥月蚤灶遭蚤灶圆袁在澡葬灶早载蚤员袁悦葬蚤允蚤灶赠葬灶早员袁匀怎葬灶早载蚤葬燥赠葬灶员鄢渊员杂贼葬贼藻运藻赠蕴葬遭燥则葬贼燥则赠燥枣砸藻责则燥凿怎糟贼蚤增藻酝藻凿蚤糟蚤灶藻袁阅藻责葬则贼皂藻灶贼燥枣匀蚤泽贼燥造燥早赠葬灶凿耘皂遭则赠燥造燥早赠袁晕允酝哉袁晕葬灶躁蚤灶早圆员员员远远曰圆阅藻责葬则贼皂藻灶贼燥枣郧赠灶葬藻糟燥造燥早赠葬灶凿韵遭泽贼藻贼则蚤糟泽袁贼澡藻晕燥援圆粤枣枣蚤造蚤葬贼藻凿匀燥泽责蚤贼葬造燥枣晕允酝哉袁晕葬灶躁蚤灶早圆员园园员员袁悦澡蚤灶葬冤 咱 Abstract 暂 Objective 院栽燥增葬造蚤凿葬贼藻枣葬贼贼赠葬糟蚤凿葬皂蚤凿藻澡赠凿则燥造葬泽藻渊冤藻曾责则藻泽泽蚤燥灶蚤灶皂燥怎泽藻泽责藻则皂葬贼燥早燥灶蚤葬造泽贼藻皂糟藻造造泽渊杂杂悦泽冤援酝藻贼澡燥凿泽院宰藻藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻凿葬泽贼葬遭造藻皂燥怎泽藻杂杂悦泽造蚤灶藻蚤灶增蚤贼则燥葬灶凿增藻则蚤枣蚤藻凿藻曾责则藻泽泽蚤燥灶蚤灶增葬则蚤燥怎泽贼蚤泽泽怎藻泽燥枣皂蚤糟藻葬灶凿贼澡藻糟藻造造造蚤灶藻遭赠宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早葬泽泽葬赠援陨皂皂怎灶燥枣造怎燥则藻泽糟藻灶糟藻憎葬泽责藻则枣燥则皂藻凿贼燥凿藻贼藻糟贼造燥糟葬贼蚤燥灶蚤灶贼澡藻贼藻泽贼蚤泽葬灶凿杂杂悦泽援砸藻泽怎造贼泽院宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早葬泽泽葬赠泽澡燥憎藻凿贼澡葬贼憎葬泽澡蚤早澡造赠藻曾责则藻泽泽藻凿蚤灶贼藻泽贼蚤糟怎造葬则贼蚤泽泽怎藻泽援阅燥怎遭造藻鄄蚤皂皂怎灶燥枣造怎燥则藻泽糟藻灶贼泽贼葬蚤灶蚤灶早泽澡燥憎藻凿贼澡葬贼造燥糟葬贼藻凿燥灶贼澡藻皂藻皂遭则葬灶藻燥枣皂燥怎泽藻杂杂悦泽葬灶凿糟燥鄄造燥糟葬造蚤扎藻凿憎蚤贼澡杂杂悦泽泽藻责葬则葬贼蚤燥灶皂葬则噪藻则袁郧阅晕云枣葬皂蚤造赠则藻糟藻责贼燥则葬造责澡葬鄄员渊郧云砸琢员冤援悦燥灶糟造怎泽蚤燥灶院蚤泽葬灶藻憎糟葬灶凿蚤凿葬贼藻泽藻责葬则葬贼蚤燥灶泽怎则枣葬糟藻皂葬则噪藻则燥枣杂杂悦泽袁憎澡蚤糟澡责则燥增蚤凿藻泽葬遭葬泽蚤泽枣燥则贼澡藻则藻泽藻葬则糟澡燥枣枣怎灶糟贼蚤燥灶蚤灶泽责藻则皂葬贼燥早藻灶藻泽蚤泽援咱 Keywords 暂泽责藻则皂葬贼燥早燥灶蚤葬造泽贼藻皂糟藻造造泽曰枣葬贼贼赠葬糟蚤凿葬皂蚤凿藻澡赠凿则燥造葬泽藻渊冤曰糟藻造造泽燥则贼蚤灶早咱 Acta Univ Med Nanjing 袁 20 员远袁猿远渊园苑冤院苑苑愿鄄苑愿圆暂 精子发生这一生物学事件依赖于比例很少的精原干细胞渊泽责藻则皂葬贼燥早燥灶蚤葬造泽贼藻皂糟藻造造袁杂杂悦泽冤袁成年睾丸中每员伊员园源个细胞中只有圆耀猿个杂杂悦泽咱员原圆暂遥虽然杂杂悦泽数量稀少袁但是它们是精子发生过程中唯一能够自我更新的生殖细胞袁从而维持雄性一生的精子发生遥近几年研究发现可以通过杂杂悦泽表面特异表达的蛋白分子标记来分选并且富集杂杂悦泽曰分选后荧光标记的小鼠杂杂悦泽经过体外移植实验咱猿暂移植到无咱基金项目暂国家自然科学基金面上项目渊猿员圆苑员缘猿苑冤鄢通信作者渊悦燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早葬怎贼澡燥则冤袁耘鄄皂葬蚤造院遭遭澡曾赠岳灶躁皂怎援藻凿怎援糟灶 荧光标记的白消安处理的受体小鼠睾丸网袁可以重建受体小鼠的精子发生过程袁从而能进一步研究杂杂悦泽的功能遥因此杂杂悦泽的富集具有重要的生物学研究意义和临床应用价值遥在前期研究工作中袁参照日本杂澡蚤灶燥澡葬则葬课题组培养体系咱源暂袁构建了稳定带有红色膜荧光标记的小鼠杂杂悦泽体外培养平台袁并对杂杂悦泽自我更新和分化能力进行了体内外各项鉴定袁进而构建了小鼠杂杂悦泽蛋白表达谱系并筛选出一批与杂杂悦泽自我更新和分化调控相关的蛋白质及网络袁共鉴定出远愿圆个蛋白质咱缘暂袁脂肪酰胺水解酶渊枣葬贼贼赠葬糟蚤凿葬皂蚤凿藻澡赠凿则燥鄄

2 第猿远卷第苑期高亭亭袁邵彬彬袁张茜袁等援在小鼠精原干细胞中的表达研究咱允暂援 20 员远年苑月南京医科大学学报渊自然科学版冤袁圆园员远袁猿远渊苑冤院苑苑愿原苑愿圆窑苑苑怨窑 造葬泽藻袁冤就是其中的一员遥是存在于哺乳动物中完整的膜酶袁属于降解内源性大麻素等内源性信号脂质脂肪酸酰胺家族咱远暂遥被证实为将内源性大麻素渊葬灶葬灶凿葬皂蚤凿藻袁粤耘粤冤分解为花生四烯酸和乙醇胺的最主要关键酶咱苑暂遥的四级结构显示其每个结构单元的琢员愿鄄琢员怨二聚体同在细胞膜的外侧咱远暂袁与膜蛋白结构类似遥有员和圆两种亚型袁小鼠中只表达员遥敲除的小鼠精子穿越透明带的能力受损袁精子运动能力减弱咱愿暂袁但在杂杂悦泽中的功能未有报道遥本研究验证是否为小鼠杂杂悦泽表面表达的分子蛋白袁为提高杂杂悦泽富集效率增加新的标记物袁并为其基因和蛋白在精子发生中相关功能研究奠定基础遥 取出生后猿援缘凿小鼠睾丸全组织袁分离睾丸曲细精管袁源豫孕云粤固定猿园皂蚤灶袁孕月杂洗猿遍袁每遍缘皂蚤灶袁员豫牛血清白蛋白渊月杂粤冤室温封闭圆澡遥然后分别以一抗孕蕴在云渊员颐圆园园冤尧渊员颐圆园园冤尧郧云砸琢员渊员颐圆园园冤源益过夜袁粤造藻曾葬云造怎燥则缘缘缘标记的驴抗兔陨早郧尧粤造藻曾葬云造怎燥则缘缘缘标记的驴抗羊陨早郧尧粤造藻曾葬云造怎燥则源愿愿标记的驴抗鼠陨早郧渊员颐缘园园冤室温避光孵育圆澡袁孕月杂鄄栽洗猿遍袁每遍缘皂蚤灶遥阴参一抗使用兔陨早郧和鼠陨早郧遥使用缘滋早辕皂蕴的匀燥藻糟澡泽贼匀猿猿猿源圆染核猿园泽袁封片后共聚焦显微镜观察拍照遥杂杂悦泽以园援猿伊员园缘个辕皂蕴的密度种于提前员凿铺于平皿云藻藻凿藻则上袁隔天换液袁待缘耀苑凿后弃培养液袁阅孕月杂洗员遍遥源豫孕云粤固定猿园皂蚤灶后袁一抗尧二抗孵育袁染色观察袁步骤同前遥 员 材料和方法 圆结果 员援员材料小鼠杂杂悦泽系及培养试剂见参考文献咱缘暂袁小鼠品系悦阅鄄员渊陨悦砸袁清洁级冤袁雄性袁购自北京维通利华公司袁并经南京医科大学伦理学委员会同意后取材使用遥宰藻泽贼藻则灶及陨孕细胞裂解液渊孕园园员猿冤尧月悦粤蛋白浓度测定试剂盒渊南通碧云天公司冤袁预染蛋白皂葬则噪藻则渊圆远远员远袁栽澡藻则皂燥公司袁美国冤袁葬糟贼蚤灶单克隆鼠抗渊酝粤月员缘园员袁酝藻则糟噪酝蚤造造蚤责燥则藻公司袁美国冤袁单克隆鼠抗渊葬遭缘源远员缘袁粤遭糟葬皂公司袁美国冤袁山羊抗鼠渊猿员源猿园袁栽澡藻则皂燥公司袁美国冤袁羊抗鼠孕蕴在云多克隆抗体渊粤云圆怨源源袁砸驭阅公司袁美国冤袁兔抗鼠郧云砸琢员多克隆抗体渊葬遭愿源员园远袁粤遭糟葬皂公司袁美国冤袁驴抗兔粤造藻曾葬云造怎燥则缘缘缘陨早郧渊粤猿员缘苑圆冤尧粤造藻曾葬云造怎燥则缘缘缘标记的驴抗羊陨早郧渊粤圆员源猿圆冤尧粤造藻曾葬云造怎燥则源愿愿标记的驴抗鼠陨早郧渊粤圆员圆园圆冤渊蕴蚤枣藻公司袁美国冤袁耘悦蕴试剂盒渊孕藻则噪蚤灶耘造皂藻则公司袁美国冤袁匀燥藻糟澡泽贼匀猿猿猿源圆渊杂蚤早皂葬公司袁美国冤遥员援圆方法员援圆援员宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼检测蛋白表达水平为检测在小鼠各组织脏器及不同周龄小鼠睾丸组织中的表达情况袁提取杂杂悦泽细胞尧园援缘凿和员周龄小鼠的睾丸组织以及成年小鼠心尧脾尧肾尧胃尧肠尧子宫尧卵巢尧睾丸尧肌肉尧脑组织蛋白用杂阅杂鄄孕粤郧耘分离袁转膜后用鼠单克隆抗体渊员颐缘园园冤和葬糟贼蚤灶鼠单克隆抗体渊员颐员园园园园冤源益孵育过夜袁辣根过氧化物酶渊匀砸孕冤标记的羊抗鼠陨早郧渊员颐缘园园园冤猿苑益孵育员澡袁用耘悦蕴化学发光检测试剂盒显色袁云造怎燥则悦澡藻皂缘缘园园渊粤造责澡葬陨灶灶燥贼藻糟澡冤成像系统检测杂交信号遥员援圆援圆小鼠睾丸组织和杂杂悦泽细胞免疫荧光染色 圆援员在小鼠和杂杂悦细胞中的表达情况宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼检测在小鼠各组织脏器中的表达袁结果显示袁是一种广泛表达于多脏器的蛋白质袁其在肠尧肾脏尧脑及睾丸组织中优势表达袁在胃尧脾脏尧子宫尧卵巢中较高表达袁而在心脏和肌肉中表达量较低渊图员冤遥宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼和灰度值分析结果显示在杂杂悦泽中有一定量的表达袁而在园援缘凿和员周龄小鼠睾丸中表达较高渊图圆冤遥心脾肾胃肠子宫卵巢脑肌肉睾丸葬糟贼蚤灶员援缘员援园园援缘园援园心脾肾胃肠子宫卵巢脑肌肉睾丸图员宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼检测小鼠各组织脏器中表达情况云蚤早怎则藻员耘曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣蚤灶凿蚤枣枣藻则藻灶贼贼蚤泽泽怎藻泽燥枣皂燥怎泽藻遭赠宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼葬泽泽葬赠圆援圆免疫荧光染色显示在小鼠睾丸和杂杂悦泽中的定位孕蕴在云是未分化的小鼠杂杂悦泽标志性标记袁定位于细胞核咱怨暂遥睾丸曲细精管免疫荧光结果显示袁的定位信号在猿援缘凿小鼠睾丸生精小管中袁与孕蕴在云基本一致袁主要定位在未分化的杂杂悦泽袁并且定位在

3 窑 苑愿园 窑 南 京 医 科 大 学 学 孕蕴在云 的 外 侧 曰 在 小 鼠 杂杂悦泽 中 袁 也 分 布 于 小鼠睾丸 孕蕴在云 的外周 员 圈渊图 猿冤袁提示可能为膜荧光信号遥 圆援猿 定位 细胞免疫荧光双标法观察 在 杂杂悦泽 中的 员援缘 进行了 郧云砸琢员 和 的定位比较遥 细胞免疫荧 员援园 为了验证 是否为新的膜蛋白袁 我们对 杂杂悦泽 光共染结果显示 郧云砸琢员 定位于 杂杂悦泽 胞膜袁 在 杂杂悦泽 的定位与 郧云砸琢员 基本一致袁为细胞膜定位 论 鉴于 杂杂悦泽 特殊的生物学功能袁 目前有很多关 园援园 于小鼠 杂杂悦泽 特异性分子标记物的研究袁如 倩远鄄蚤灶贼藻鄄 图圆 子在其他干细胞中也有表达遥 造血干细胞中表达 云蚤早怎则藻 圆 早则蚤灶尧茁员鄄蚤灶贼藻早则蚤灶尧悦阅圆源尧贼澡赠鄄员尧悦阅怨 等 咱员员原员缘暂袁但这些分 贼澡赠鄄员 和 茁员鄄蚤灶贼藻早则蚤灶 袁胚胎干细胞中表达倩远鄄蚤灶贼藻鄄 咱员远原员苑暂 粤 孕蕴在云 园援缘 凿 员周 园援缘 渊图 源冤遥 讨 杂杂悦泽 葬糟贼蚤灶 郧云砸琢员 是小鼠 杂杂悦泽 表面公认的膜蛋白之一咱员园暂遥 猿 第 猿远 卷第 苑 期 20员远 年 苑 月 报 杂杂悦泽 园援缘 凿 小鼠睾丸 员周 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 检测 杂杂悦泽 和小鼠睾丸组织中 的 表达情况 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 蚤灶 皂燥怎泽藻 杂杂悦泽 葬灶凿 贼澡藻 贼藻泽贼蚤泽 遭赠 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 葬泽泽葬赠 阅粤孕陨 酝藻则早藻 月 粤院猿援缘 凿 睾丸曲细精管 定位于 杂杂悦泽曰月院小鼠精原干细胞系 杂杂悦泽 免疫荧光袁 定位于 孕蕴在云 外周 员 圈遥 图猿 免疫荧光检测睾丸和 杂杂悦泽 中 的定位渊伊圆园园冤 云蚤早怎则藻 猿 造燥糟葬贼蚤燥灶 蚤灶 贼澡藻 贼藻泽贼蚤泽 葬灶凿 杂杂悦泽 遭赠 蚤皂皂怎灶燥枣造怎燥则藻泽糟藻灶糟藻渊伊圆园园冤 郧云砸琢员 图源 云蚤早怎则藻 源 阅粤孕陨 酝藻则早藻 免疫荧光双标法检测比较 与 郧云砸琢员 在 杂杂悦泽 的定位情况渊伊源园园冤 悦燥皂责葬则蚤泽燥灶 燥枣 造燥糟葬造蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 葬灶凿 郧云砸琢员 责燥泽蚤贼蚤燥灶蚤灶早 蚤灶 杂杂悦泽 遭赠 凿燥怎遭造藻 蚤皂皂怎灶燥枣造怎燥则藻泽糟藻灶贼渊伊源园园冤

4 第猿远卷第苑期高亭亭袁邵彬彬袁张茜袁等援在小鼠精原干细胞中的表达研究咱允暂援 20 员远年苑月南京医科大学学报渊自然科学版冤袁圆园员远袁猿远渊苑冤院苑苑愿原苑愿圆窑苑愿员窑 早则蚤灶咱员愿暂遥然而杂杂悦泽和其他干细胞不同袁造血干细胞表达的倩源鄄蚤灶贼藻早则蚤灶和糟鄄噪蚤贼咱员苑袁员怨暂在杂杂悦泽不表达咱员圆暂遥尽管现状如上所述袁但是不同干细胞之间共同表达分子的寻找促进了干细胞表面识别标记物的鉴定遥细胞表面的跨膜蛋白倩远鄄蚤灶贼藻早则蚤灶和茁员鄄蚤灶贼藻早则蚤灶是杂杂鄄悦泽分选的表面标记物袁流式分选显示倩远鄄蚤灶贼藻早则蚤灶和茁员鄄蚤灶贼藻早则蚤灶标记的杂杂悦泽细胞数分别高于对照组员猿援圆豫尧圆猿援园豫遥将倩远鄄蚤灶贼藻早则蚤灶和茁员鄄蚤灶贼藻早则蚤灶标记的杂杂悦泽进行移植袁所得到的克隆数和克隆区域均比对照组高咱员圆暂遥胶质细胞源性神经营养因子渊郧阅晕云冤的协同受体郧云砸琢员已被证实表达于人杂杂悦泽袁将郧云砸琢员标记的细胞进行流式分选杂杂悦泽富集倍数可达到源援缘倍咱员缘暂袁这说明使用表面标记物分选细胞确实起到富集细胞的作用遥然而袁已知的分子标记物有限袁还需要我们进一步挖掘以提高杂杂悦泽富集的效率遥前期研究中袁我们首先运用两步消化酶消化法分离猿耀源凿的雄性小鼠睾丸构建了稳定的杂杂悦泽系袁并且可以体外观察小鼠杂杂悦泽的自我更新和分化能力咱圆圆暂遥同时袁我们通过细胞免疫荧光验证了杂杂悦泽特定标记物韵悦栽源尧孕蕴在云和郧云砸琢员的表达袁通过体外移植实验重建精子发生来验证小鼠杂杂悦泽系咱缘暂遥本研究在蛋白水平和组织细胞定位验证在杂杂悦泽的表达袁并且细胞免疫荧光显示与郧云砸琢员咱员园袁员缘暂这个经典的杂杂悦泽分选标记物细胞定位基本一致袁所以我们考虑将列入几种干细胞共同表达的分子标记物中遥在睾丸中并不特异表达于杂杂悦泽袁这与我们免疫荧光显示的结果是一致的遥然而通过联合其他的杂杂悦泽标记物来分离阳性细胞是可行的遥新的杂杂悦泽表面抗原的发现将会提升富集小鼠杂杂悦泽的技术方法遥我们假设杂杂悦泽与其他可以自我更新的器官组织中的干细胞共享相同的分子标记袁作为杂杂悦泽分选富集的分子标记物可以为今后干细胞的高效富集提供基础遥由于我们没有找到可以做流式分选的商业化直标抗体袁本研究只能通过蛋白水平和荧光定位来验证是杂杂悦泽表面表达的蛋白袁后续我们会继续关注的直标抗体袁以通过流式分选来证实标记细胞可以提高杂杂悦泽的富集效率的假设遥同时已有研究表明表达于一些干细胞咱圆园暂袁并且与其增殖和分化功能相关咱圆园原圆员暂袁这提示研究在杂杂悦泽自我更新和分化中所扮演的角色袁并深入揭示在这些生物事件中的调控机制袁将为今后更好地认识杂杂悦泽自我更新和分化的调控机制提供依据遥 咱参考文献暂咱员暂酝藻葬糟澡藻皂杂袁灾燥灶杂糟澡觟灶枣藻造凿贼灾袁杂糟澡造葬贼贼杂援杂责藻则皂葬贼燥早燥灶蚤葬院泽贼藻皂糟藻造造泽憎蚤贼澡葬早则藻葬贼责藻则泽责藻糟贼蚤增藻咱允暂援砸藻责则燥凿怎糟贼蚤燥灶袁圆园园员袁员圆员渊远冤院愿圆缘原愿猿源咱圆暂栽藻早藻造藻灶遭燥泽糟澡砸粤袁阅藻砸燥燥蚤躁阅郧援粤择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻泽贼怎凿赠燥枣泽责藻则皂葬贼燥早燥灶蚤葬造皂怎造贼蚤责造蚤糟葬贼蚤燥灶葬灶凿泽贼藻皂糟藻造造则藻灶藻憎葬造蚤灶贼澡藻悦猿匀辕员园员云员澡赠遭则蚤凿皂燥怎泽藻咱允暂援酝怎贼葬贼砸藻泽袁员怨怨猿袁圆怨园渊圆冤院员怨猿原圆园园咱猿暂月则蚤灶泽贼藻则砸蕴袁在蚤皂皂藻则皂葬灶灶允宰援杂责藻则皂葬贼燥早藻灶藻泽蚤泽枣燥造造燥憎蚤灶早皂葬造藻早藻则皂鄄糟藻造造贼则葬灶泽责造葬灶贼葬贼蚤燥灶咱允暂援孕则燥糟晕葬贼造粤糟葬凿杂糟蚤哉杂粤袁员怨怨源袁怨员渊圆源冤院员员圆怨愿原员员猿园圆咱源暂运葬灶葬贼泽怎鄄杂澡蚤灶燥澡葬则葬酝袁韵早燥灶怎噪蚤晕袁陨灶燥怎藻运袁藻贼葬造援蕴燥灶早鄄贼藻则皂责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤燥灶蚤灶糟怎造贼怎则藻葬灶凿早藻则皂造蚤灶藻贼则葬灶泽皂蚤泽泽蚤燥灶燥枣皂燥怎泽藻皂葬造藻早藻则皂造蚤灶藻泽贼藻皂糟藻造造泽咱允暂援月蚤燥造砸藻责则燥凿袁圆园园猿袁远怨渊圆冤院远员圆原远员远咱缘暂在澡燥怎匝袁郧怎燥再袁在澡藻灶早月袁藻贼葬造援耘泽贼葬遭造蚤泽澡皂藻灶贼燥枣葬责则燥鄄贼藻燥皂藻责则燥枣蚤造藻葬灶凿蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶燥枣皂燥造藻糟怎造葬则皂葬则噪藻则泽枣燥则皂燥怎泽藻泽责藻则皂葬贼燥早燥灶蚤葬造泽贼藻皂糟藻造造泽咱允暂援允悦藻造造酝燥造酝藻凿袁圆园员缘袁员怨渊猿冤院缘圆员原缘猿源咱远暂酝糟噪蚤灶灶藻赠酝运袁悦则葬增葬贼贼月云援杂贼则怎糟贼怎则藻葬灶凿枣怎灶糟贼蚤燥灶燥枣枣葬贼贼赠葬糟蚤凿葬皂蚤凿藻澡赠凿则燥造葬泽藻咱允暂援粤灶灶怎砸藻增月蚤燥糟澡藻皂袁圆园园缘袁苑源院源员员原源猿圆咱苑暂月葬贼贼蚤泽贼葬晕袁孕葬泽择怎葬则蚤藻造造燥晕袁阅蚤栽燥皂皂葬泽燥酝袁藻贼葬造援陨灶贼藻则责造葬赠遭藻贼憎藻藻灶藻灶凿燥糟葬灶灶葬遭蚤灶燥蚤凿泽袁泽贼藻则燥蚤凿泽葬灶凿糟赠贼燥噪蚤灶藻泽蚤灶贼澡藻糟燥灶贼则燥造燥枣澡怎皂葬灶则藻责则燥凿怎糟贼蚤燥灶咱允暂援允晕藻怎则燥藻灶凿燥糟则蚤灶燥造袁圆园园愿袁圆园渊杂怎责责造员冤院愿圆原愿怨咱愿暂杂怎灶载袁宰葬灶早匀袁韵噪葬遭藻酝袁藻贼葬造援郧藻灶藻贼蚤糟造燥泽泽燥枣云葬葬澡鄄糟燥皂责则燥皂蚤泽藻泽皂葬造藻枣藻则贼蚤造蚤贼赠蚤灶皂蚤糟藻咱允暂援月蚤燥造砸藻责则燥凿袁圆园园怨袁愿园渊圆冤院圆猿缘原圆源圆 咱怨暂月怎葬葬泽云宰袁运蚤则泽澡粤蕴袁杂澡葬则皂葬酝袁藻贼葬造援孕造扎枣蚤泽则藻择怎蚤则藻凿蚤灶葬凿怎造贼皂葬造藻早藻则皂糟藻造造泽枣燥则泽贼藻皂糟藻造造泽藻造枣鄄则藻灶藻憎葬造咱允暂援晕葬贼郧藻灶藻贼袁圆园园源袁猿远渊远冤院远源苑原远缘圆咱员园暂郧则蚤泽葬灶贼蚤蕴袁云葬造糟蚤葬贼燥则蚤陨袁郧则葬泽泽燥酝袁藻贼葬造援陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶燥枣泽责藻则皂葬贼燥早燥灶蚤葬造泽贼藻皂糟藻造造泽怎遭泽藻贼泽遭赠皂燥则责澡燥造燥早蚤糟葬造葬灶葬造赠鄄泽蚤泽葬灶凿责则燥泽责藻糟贼蚤增藻蚤泽燥造葬贼蚤燥灶咱允暂援杂贼藻皂悦藻造造泽袁圆园园怨袁圆苑渊员圆冤院猿园源猿原猿园缘圆咱员员暂杂澡蚤灶燥澡葬则葬栽袁韵则憎蚤早运耘袁粤增葬则遭燥糟噪酝砸袁藻贼葬造援杂责藻则皂葬贼燥早燥鄄灶蚤葬造泽贼藻皂糟藻造造藻灶则蚤糟澡皂藻灶贼遭赠皂怎造贼蚤责葬则葬皂藻贼藻则泽藻造藻糟贼蚤燥灶燥枣皂燥怎泽藻贼藻泽贼蚤泽糟藻造造泽咱允暂援孕则燥糟晕葬贼造粤糟葬凿杂糟蚤哉杂粤袁圆园园园袁怨苑渊员缘冤院愿猿源远原愿猿缘员咱员圆暂杂澡蚤灶燥澡葬则葬栽袁粤增葬则遭燥糟噪酝砸袁月则蚤灶泽贼藻则砸蕴援月藻贼葬员鄄葬灶凿葬造责澡葬远鄄蚤灶贼藻早则蚤灶葬则藻泽怎则枣葬糟藻皂葬则噪藻则泽燥灶皂燥怎泽藻泽责藻则皂葬贼燥早燥灶蚤葬造泽贼藻皂糟藻造造泽咱允暂援孕则燥糟晕葬贼造粤糟葬凿杂糟蚤哉杂粤袁员怨怨怨袁怨远渊员园冤院缘缘园源原缘缘园怨咱员猿暂运怎遭燥贼葬匀袁粤增葬则遭燥糟噪酝砸袁月则蚤灶泽贼藻则砸蕴援杂责藻则皂葬贼燥早燥灶蚤葬造泽贼藻皂糟藻造造泽泽澡葬则藻泽燥皂藻袁遭怎贼灶燥贼葬造造袁责澡藻灶燥贼赠责蚤糟葬灶凿枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造糟澡葬则葬糟贼藻则蚤泽贼蚤糟泽憎蚤贼澡燥贼澡藻则泽贼藻皂糟藻造造泽咱允暂援孕则燥糟晕葬贼造粤糟葬凿杂糟蚤哉杂粤袁圆园园猿袁员园园渊员员冤院远源愿苑原远源怨圆

5 窑苑愿圆窑 南京医科大学学报 第猿远卷第苑期 20 员远年苑月 咱员源暂运葬灶葬贼泽怎鄄杂澡蚤灶燥澡葬则葬酝袁栽燥赠燥噪怎灶蚤杂袁杂澡蚤灶燥澡葬则葬栽援悦阅怨蚤泽葬泽怎则枣葬糟藻皂葬则噪藻则燥灶皂燥怎泽藻葬灶凿则葬贼皂葬造藻早藻则皂造蚤灶藻泽贼藻皂糟藻造造泽咱允暂援月蚤燥造砸藻责则燥凿袁圆园园源袁苑园渊员冤院苑园原苑缘咱员缘暂在燥澡灶蚤运袁在澡葬灶早载袁栽葬灶杂蕴袁藻贼葬造援悦阅怨蚤泽藻曾责则藻泽泽藻凿燥灶澡怎鄄皂葬灶皂葬造藻早藻则皂糟藻造造泽贼澡葬贼澡葬增藻葬造燥灶早鄄贼藻则皂则藻责燥责怎造葬贼蚤燥灶责燥贼藻灶贼蚤葬造葬枣贼藻则贼则葬灶泽责造葬灶贼葬贼蚤燥灶蚤灶贼燥皂燥怎泽藻贼藻泽贼藻泽咱允暂援月蚤燥造砸藻责则燥凿袁圆园员圆袁愿苑渊圆冤院圆苑咱员远暂杂责葬灶早则怎凿藻郧允袁匀藻蚤皂枣藻造凿杂袁宰藻蚤泽泽皂葬灶陨蕴援孕怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶葬灶凿糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶燥枣皂燥怎泽藻澡藻皂葬贼燥责燥蚤藻贼蚤糟泽贼藻皂糟藻造造泽咱允暂援杂糟蚤藻灶糟藻袁员怨愿愿袁圆源员渊源愿远员冤院缘愿原远圆咱员苑暂宰蚤造造蚤葬皂泽阅粤袁砸蚤燥泽酝袁杂贼藻责澡藻灶泽悦袁藻贼葬造援云蚤遭则燥灶藻糟贼蚤灶葬灶凿灾蕴粤鄄源蚤灶澡葬藻皂葬贼燥责燥蚤藻贼蚤糟泽贼藻皂糟藻造造鄄皂蚤糟则燥藻灶增蚤则燥灶皂藻灶贼蚤灶鄄贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽咱允暂援晕葬贼怎则藻袁员怨怨员袁猿缘圆渊远猿猿源冤院源猿愿原源源员咱员愿暂载怎悦袁陨灶燥噪怎皂葬酝杂袁阅藻灶澡葬皂允袁藻贼葬造援云藻藻凿藻则鄄枣则藻藻早则燥憎贼澡燥枣怎灶凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬贼藻凿澡怎皂葬灶藻皂遭则赠燥灶蚤糟泽贼藻皂糟藻造造泽咱允暂援晕葬贼月蚤燥贼藻糟澡灶燥造袁圆园园员袁员怨渊员园冤院怨苑员原怨苑源 咱员怨暂陨噪怎贼葬运袁宰藻蚤泽泽皂葬灶陨蕴援耘增蚤凿藻灶糟藻贼澡葬贼澡藻皂葬贼燥责燥蚤藻贼蚤糟泽贼藻皂糟藻造造泽藻曾责则藻泽泽皂燥怎泽藻糟鄄噪蚤贼遭怎贼凿燥灶燥贼凿藻责藻灶凿燥灶泽贼藻藻造枣葬糟贼燥则枣燥则贼澡藻蚤则郧藻灶藻则葬贼蚤燥灶咱允暂援孕则燥糟晕葬贼造粤糟葬凿杂糟蚤哉杂粤袁员怨怨圆袁愿怨渊源冤院员缘园圆原员缘园远咱圆园暂郧葬造增藻鄄砸燥责藻则澡陨袁悦澡蚤怎则糟澡蚤俅灾袁阅侏葬扎鄄粤造燥灶泽燥允袁藻贼葬造援悦葬灶灶葬遭蚤鄄灶燥蚤凿则藻糟藻责贼燥则泽蚤早灶葬造蚤灶早蚤灶责则燥早藻灶蚤贼燥则辕泽贼藻皂糟藻造造责则燥造蚤枣藻则葬鄄贼蚤燥灶葬灶凿凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬贼蚤燥灶咱允暂援孕则燥早蕴蚤责蚤凿砸藻泽袁圆园员猿袁缘圆渊源冤院远猿猿原远缘园咱圆员暂粤早怎葬凿燥栽袁酝燥灶燥则赠运袁孕葬造葬扎怎藻造燥泽允袁藻贼葬造援栽澡藻藻灶凿燥糟葬灶灶葬遭蚤鄄灶燥蚤凿泽赠泽贼藻皂凿则蚤增藻泽灶藻怎则葬造责则燥早藻灶蚤贼燥则责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤燥灶咱允暂援云粤杂耘月允袁圆园园缘袁员怨渊员圆冤院员苑园源原员苑园远咱圆圆暂薛江阳袁高亭亭袁邵彬彬袁等援小鼠精原干细胞系自我更新和分化能力的体外观察咱允暂援南京医科大学学报渊自然科学版冤袁圆园员远渊圆冤院员缘缘原员缘怨咱收稿日期暂圆园员远原园猿原员缘 渊上接第苑苑猿页冤 咱员圆暂酝燥砸袁云则藻藻则粤皂袁在蚤灶早噪阅蕴袁藻贼葬造援孕葬贼贼藻则灶蚤灶早葬灶凿凿藻增藻造燥责鄄皂藻灶贼援泽责藻糟蚤枣蚤糟葬灶凿则藻凿怎灶凿葬灶贼枣怎灶糟贼蚤燥灶泽燥枣郧造蚤圆葬灶凿郧造蚤猿在蚤灶糟枣蚤灶早藻则早藻灶藻泽蚤灶泽噪藻造藻贼葬造咱允暂援阅藻增藻造燥责皂藻灶贼袁员怨怨苑袁员圆源渊员冤院员员猿原员圆猿咱员猿暂月则蚤泽糟燥藻允袁栽澡佴则燥灶凿孕孕援栽澡藻皂藻糟澡葬灶蚤泽皂泽燥枣匀藻凿早藻澡燥早泽蚤早鄄灶葬造造蚤灶早葬灶凿蚤贼泽则燥造藻泽蚤灶凿藻增藻造燥责皂藻灶贼葬灶凿凿蚤泽藻葬泽藻咱允暂援晕葬贼砸藻增酝燥造悦藻造造月蚤燥造袁圆园员猿袁员源渊苑冤院源员远原源圆怨咱员源暂田孝东袁杨尹默袁汤坚强袁等援匀藻凿早藻澡燥早信号通路对胰腺癌细胞增殖的影响咱允暂援中华普通外科杂志袁圆园园愿袁圆猿渊圆冤院员圆怨原员猿圆咱员缘暂杂澡蚤皂葬匀袁杂怎扎怎噪蚤匀袁杂怎灶允袁藻贼葬造援粤糟贼蚤增葬贼蚤燥灶燥枣贼澡藻杂哉酝韵皂燥凿蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶泽赠泽贼藻皂蚤泽则藻择怎蚤则藻凿枣燥则贼澡藻葬糟糟怎皂怎造葬贼蚤燥灶燥枣砸粤阅缘员葬贼泽蚤贼藻泽燥枣阅晕粤凿葬皂葬早藻咱允暂援允悦藻造造杂糟蚤袁圆园员猿袁员圆远渊孕贼圆圆冤院缘圆愿源原缘圆怨圆咱员远暂郧葬造葬灶贼赠再袁月藻造燥贼泽藻则噪燥增泽噪葬赠葬砸袁悦燥葬贼藻泽允袁藻贼葬造援酝葬皂皂葬造蚤葬灶杂哉酝韵耘猿鄄造蚤早葬泽藻泽孕陨粤杂员葬灶凿孕陨粤杂源责则燥皂燥贼藻则藻泽责燥灶泽藻泽贼燥阅晕粤凿燥怎遭造藻鄄泽贼则葬灶凿遭则藻葬噪泽咱允暂援晕葬贼怎则藻袁圆园园怨袁源远圆渊苑圆苑缘冤院怨猿缘原怨猿怨 咱员苑暂运葬澡赠燥栽袁晕蚤泽澡蚤凿葬栽袁再葬泽怎凿葬匀援陨灶增燥造增藻皂藻灶贼燥枣孕陨粤杂员蚤灶贼澡藻泽怎皂燥赠造葬贼蚤燥灶燥枣贼怎皂燥则泽怎责责则藻泽泽燥则责缘猿咱允暂援酝燥造悦藻造造袁圆园园员袁愿渊猿冤院苑员猿原苑员愿咱员愿暂酝怎灶葬则则蚤扎耘袁月葬则糟葬则燥造蚤阅袁杂贼藻责澡葬灶燥怎粤袁藻贼葬造援孕陨粤杂鄄员蚤泽葬糟澡藻糟噪责燥蚤灶贼则藻早怎造葬贼燥则憎澡蚤糟澡葬枣枣藻糟贼泽藻曾蚤贼枣则燥皂郧员葬灶凿郧圆遭赠泽怎皂燥赠造葬贼蚤燥灶燥枣责苑猿咱允暂援酝燥造悦藻造造月蚤燥造袁圆园园源袁圆源渊圆源冤院员园缘怨猿原员园远员园咱员怨暂孕怎澡则酝袁匀燥藻枣藻则允袁晕藻怎憎蚤则贼匀袁藻贼葬造援孕陨粤杂员蚤泽葬糟则怎糟蚤葬造枣葬糟贼燥则枣燥则责则燥泽贼葬贼藻糟葬灶糟藻则糟藻造造泽怎则增蚤增葬造葬灶凿葬增葬造蚤凿贼葬则早藻贼蚤灶凿燥糟鄄藻贼葬曾藻造则藻泽蚤泽贼葬灶贼糟藻造造泽咱允暂援韵灶糟燥贼葬则早藻贼袁圆园员源袁缘渊圆猿冤院员圆园源猿原员圆园缘远咱圆园暂悦燥曾月袁月则蚤泽糟燥藻允袁哉造造燥葬云援杂哉酝韵赠造葬贼蚤燥灶遭赠孕蚤葬泽员则藻早怎造葬贼藻泽贼澡藻葬糟贼蚤增蚤贼赠燥枣贼澡藻匀藻凿早藻澡燥早凿藻责藻灶凿藻灶贼郧造蚤贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶枣葬糟贼燥则泽咱允暂援孕蕴燥杂韵灶藻袁圆园员园袁缘渊愿冤院藻员员怨怨远咱圆员暂唐阳袁蔡松柏袁张旭袁等援匀藻凿早藻澡燥早信号通路异常对人结肠腺癌多药耐药性的影响咱允暂援肿瘤袁圆园员圆袁猿圆渊员员冤院愿愿远原愿怨员咱收稿日期暂圆园员远原园猿原圆员