20 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No XhoI 为美国 NEB 公司产品 ; 质粒抽提及 DNA 片段快速胶回收试剂盒为美国 Axygen 公司产品新生牛血清 (NCS) 胎牛血清 (FBS) 购自 Gibco 公司 HAT DMEM 培养基

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浸虔嵇
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2012,32(5):19 23 EpCAM 蛋白的表达纯化及其单克隆抗体的制备孔娟高慧萍张鹏伟石必枝蒋华严瑾李宗海 ( 上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因国家重点实验室上海 ) 摘要目的 : 原核表达 EpCAM 蛋白并制备抗 EpCAM 特异性单克隆抗体, 初步鉴定相应单克隆抗体的特性方法 :PCR 扩增 EpCAM 基因胞外区, 将目的基因亚克隆至载体 pet 28a(+), 转化至大肠埃希菌株 BL21,IPTG 诱导表达, 组氨酸亲和层析法纯化表达产物纯化蛋白免疫 BALB/c 小鼠, 将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤 SP2/0 细胞融合, 经 ELISA 筛选得到分泌特异性抗 EpCAM 的单克隆抗体的细胞株, 免疫 BALB/c 小鼠进一步制备相应的单克隆抗体, 并通过 Westernblot( 蛋白质印记 ) 和 FACS( 流式细胞分析 ) 鉴定单抗的特异性及生物学活性结果 : 成功构建重组表达载体 pet28a EpCAM 并在大肠杆菌中获得表达, 经 His tag 亲和层析法获得纯化的 EpCAM 重组蛋白 EpCAM 重组蛋白免疫的 BALB/c 小鼠的脾细胞与 SP2/0 细胞融合筛选, 获得两株稳定分泌 EpCAM 抗体的杂交瘤细胞株, 分别命名为 4B2 2F2 并免疫 BALB/c 小鼠获得相应的单克隆抗体 Westernblot 结果显示 4B2 腹水纯化所得单抗能够识别 FaDu 细胞系 ( 人咽鳞癌细胞 ) 中的 EpCAM 蛋白, 但 2F2 未能识别 FaDu 细胞中的变性的 EpCAM 蛋白 FACS 结果显示两者均能和 FaDu 细胞中天然的 EpCAM 蛋白结合讨论 : 成功制备了抗 EpCAM 的单克隆抗体, 并能够识别人咽鳞癌细胞系 FaDu 中表达的 EpCAM, 为进一步研究 EpCAM 抗体在肿瘤治疗中的作用提供基础关键词 EpCAM 杂交瘤单克隆抗体中图分类号 Q786 人上皮细胞粘附分子 (EpCAM;CD326) 为最早在结肠癌中发现的相对分子质量为的 I 型跨膜糖蛋白 [1] EpCAM 表达于人部分正常上皮细胞和和大多数恶性上皮细胞, 包括子宫颈肺乳腺前列腺肾细胞胃癌结直肠和皮肤鳞癌而在黑色素瘤神经鞘瘤淋巴瘤等无表达 [2 6] 从组织分类看 EpCAM 在多数上皮源性肿瘤中阳性 ; 而在间质肿瘤中缺乏或鲜有表达 EpCAM 所编码的糖蛋白除具有表皮细胞黏附分子功能外 [7], 还参与信号传导细胞增殖分化迁移, 组织再 [8 9] 生等多种生物学功能近年来, 随着免疫组化微芯片和基因工程等分子收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ) 上海市科委资助项目 ( ) 教育部 2009 年度新教师基金 ( ) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :zonghaili@gmail.com 生物技术的发展和完善,EpCAM 基因及其抗体在肿瘤研究及临床应用中的作用越来越受到重视本研究成功制备了两株抗 EpCAM 的单克隆抗体, 为进一步研究 EpCAM 抗体在肿瘤治疗中的作用提供了基础 1 材料与方法 1.1 材料菌株细胞及质粒原核表达质粒 PET 28a (+), 大肠杆菌 Top10 BL21(DE3) 为 Novagen 公司产品, 小鼠骨髓瘤细胞系 SP2/0 由本实验室保存培养人咽鳞癌 FaDu 细胞株购自 ATCC 实验动物 BALB/c 小鼠, 雌性,4~6 周龄, 体重 16~19g,SPF 环境饲养, 由上海市肿瘤研究所实验动物中心提供 [ 实验动物合格证号 :SCXK( 沪 ) ] 试剂 TaqDNA 聚合酶及限制性内切酶 NdeI,

2 20 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No XhoI 为美国 NEB 公司产品 ; 质粒抽提及 DNA 片段快速胶回收试剂盒为美国 Axygen 公司产品新生牛血清 (NCS) 胎牛血清 (FBS) 购自 Gibco 公司 HAT DMEM 培养基 PEG4000,( 不 ) 完全弗氏佐剂及 HRP 羊抗鼠 IgG 购自 Sigma 公司 Western 化学发光底物为 Thermo 公司产品,HiTrapTM protein G HP 预装柱为 GE healthcare 公司产品抗 His Tag 抗体,FITC 羊抗鼠 IgG 购自康成生物科技有限公司,HRP EpCAM 兔多抗购自 Abcam 公司,EpCAM 真核蛋白为北京义翘神州公司产品 1.2 方法 EpCAM 表达载体的构建根据 GenBank EpCAM 序列设计胞外区引物 PF:5 cgccatatgcaggaagaa tgtgt 3,PR:5 cgcctcgagta tagaccctgcatg 3, 划线部分分别为限制性内切酶 NdeI,XhoI 酶切位点将肺癌病人组织于撵钵中碾碎, 每 100mg 组织悬液加 1ml Ttizol, 抽提总 RNA, 以总 RNA 为模板, 寡聚脱氧胸腺嘧啶 [Oligo(dT20)] 为引物, 按照 RT PCR 试剂盒合成 cdna 第一链, 反应总体积为 20μl 以 cdna 为模板扩增 EpCAM 基因, 反应条件为 :94,4min,94,50s, 58,50s,72,1min,72,10min, 扩增 30 个循环, 琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物, 纯化后与质粒 PET 28a (+) 分别用 NdeI,XhoI 双酶切,T4DNA 连接酶连接, 构建表达重组质粒 EpCAM/PET 28a(+), 转化大肠杆菌 Top10 抽提重组质粒, 经 PCR 及双酶切初步鉴定并进行测序验证 EpCAM 蛋白的表达纯化及 Westernbloting 鉴定将测序正确的表达重组质粒 EpCAM/PET 28a (+) 转化感受态细菌 E.coliBL21(DE3), 涂于卡那抗性 LB 固体平皿, 挑取单一菌落, 将鉴定正确的菌落接种于含 100μg/ml 卡那霉素液体 LB 培养基中扩大培养, 当吸光度 (A600 值 ) 为 0.6~0.8 时, 加入异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG, 终浓度为 0.5mmol/L) 继续震荡培养 4h 后, 制备样品通过 SDS PAGE 进行分析鉴定经鉴定重组蛋白为包涵体, 大量诱导重组菌经离心去除上清沉淀用蛋白抽提试剂裂解,16000 g 离心 15min 弃上清, 所得沉淀按照多聚组氨酸标签融合蛋白纯化操作手册 (Qiagen 公司 ) 进行亲和纯化, 纯化的表达产物 EpCAM 蛋白经 SDS PAGE 分析纯化结果, 并以 HRP EpCAM 兔多抗为检测抗体对纯化后的重组蛋白进行 Westernbloting 鉴定动物免疫取适量抗原与完全弗氏佐剂按质量比 1 1 混合乳化, 腹部皮下多点免疫 5 只 BALB/c 小鼠, 初次免疫抗原蛋白量 100μg/ 只 / 次, 初次免疫后 3 周, 采用抗原减半与不完全弗氏佐剂混合乳化, 每次免疫间隔 2 周, 同法加强免疫 2~3 次尾静脉取血进行间接 ELISA 试验检测小鼠血清效价, 融合前 3 天进行脾内加强免疫 1 次细胞融合小鼠摘眼球放血处死, 取脾细胞 ( ~ ) 与 SP2/0 细胞 ( 脾细胞 SP2/0 为 5 1) 在 PEG4000 作用下进行融合融合细胞稀释于 200ml 含 1 HAT,15% FBS,100U/ml 青霉素和链霉素的 DMEM 培养液中, 以 200μl/ 孔接种至 10 块 96 孔细胞培养板中, 于 37,5%CO 2 细胞培养箱中培养阳性杂交瘤细胞株的获得采用真核 EpCAM 蛋白包被 ELISA 板,100ng/ 孔,4 包被过夜, 采用 PBST ( 含 0.5%Tween20 的 PBS) 洗涤 3 次, 每次孵育 3min 5%PBS 脱脂奶粉 37 封闭 2h, 同上洗涤对培养 7d 的融合细胞上清进行间接 ELISA 检测一抗 : 细胞培养上清 50μl/ 孔,37 孵育 1h; 二抗 : 羊抗鼠 IgG HRP(1mg/ml),5% PBS 脱脂奶粉稀释,50μl/ 孔, 37 孵育 1h; 显色液 :ABTS[2,2 连氮基双 (3 乙基苯并二氢噻唑啉 6 磺酸 ) 二铵盐 ],37 避光反应 15min 405nm 下检测每孔吸光度 A 值, 大于阴性对照 3 倍的吸光度值为阳性并对阳性克隆细胞通过有限稀释法进行亚克隆建立稳定的单克隆阳性细胞株单克隆抗体的制备每只 BALB/c 小鼠腹腔注射石蜡 500μl,4d 后腹腔接种杂交瘤细胞 / 只, 制备腹水 3~5ml/ 只,3000g 离心 10min, 弃沉淀, 上清采用 HiTrapTM proteinghp 预装柱纯化, 纯化抗体经 SDS PAGE 鉴定抗体纯度单克隆抗体的特性分析 Westernbloting 检测 : 用 12% SDS PAGE 电泳分离 EpCAM 阳性的人咽鳞癌细胞株 FaDu 细胞总蛋白 ; 以制备的抗 EpCAM 单克隆抗体 4B2 2F2 为一抗 (1μg/ml), 以 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 为二抗, 化学发光底物显色, 进行 Western bloting 检测, 检测抗 EpCAM 单克隆抗体与 FaDu 细胞中 EpCAM 发生免疫反应的特异性 FACS 检测 : 采用 FaDu 细胞系进行 FACS 分析单克隆抗体的结合活性,FaDu 细胞经 10mmol/LEDTA 消化后 1500g 离心 5min, 个细胞每管, 重悬于 PBS( 含 10ml/L 小牛血清 ) 中洗涤 2 次, 以 4B2 2F2 单克隆抗体为一抗 (100μl 20μg/ml, 用含 10ml/L 胎牛血清的 PBS 稀释 ), 阴性对照管加入 100μl 抗体稀释

2012,32(5) 孔娟等 :EpCAM 蛋白的表达纯化及其单克隆抗体的制备 21 液,4 孵育 1h 后同上洗涤 2 次, 以 FITC 标记羊抗鼠多抗为二抗 (100μl 20μg/ml, 用含 10ml/L 胎牛血清的 PBS 稀释 ),4 孵育 1h 后同上洗涤 2 次, 加入 200μl PBS 重悬后进行流式细胞仪检测 2 结果 2.

2 SDS PAGEandWesternblotinganalysis ofepcam expresedine.

(b)westernblotinganalysisofthepurifiedepcam;m: Proteinmarker;1:ThepurifiedEpCAM protein 图 1 PCR 产物及重组质粒的酶切鉴定 Fig.

3 2012,32(5) 孔娟等 :EpCAM 蛋白的表达纯化及其单克隆抗体的制备 21 液,4 孵育 1h 后同上洗涤 2 次, 以 FITC 标记羊抗鼠多抗为二抗 (100μl 20μg/ml, 用含 10ml/L 胎牛血清的 PBS 稀释 ),4 孵育 1h 后同上洗涤 2 次, 加入 200μl PBS 重悬后进行流式细胞仪检测 2 结果 2.1 EpCAM 基因的扩增与重组表达载体的鉴定重组质粒 pet28a EpCAM 经 NdeI 和 XhoI 双酶切后出现目的条带 729bp( 图 1), 符合预期大小, 测序正确, 成功构建获得重组表达载体图 2 EpCAM 蛋白表达纯化与 Westernbloting 鉴定 Fig.2 SDS PAGEandWesternblotinganalysis ofepcam expresedine.colibl21 (a)sds-pageanalysisofepcam expresionandpurification; M:Proteinmarker;1:EpCAM /pet28awithoutiptginduction; 2:EpCAM /pet28awithiptginduction;3:thepurifiedepcam protein (b)westernblotinganalysisofthepurifiedepcam;m: Proteinmarker;1:ThepurifiedEpCAM protein 图 1 PCR 产物及重组质粒的酶切鉴定 Fig.1 PCRproductandidentification oftherecombinantplasmid 1:λ/HindⅢDNAmarker;2:PCRproduct;3:pET28a EpCAM; 4:pET28a EpCAM digestedbyenzymendeiandxhoi;5:ds 2000DNAmarker 2.2 EpCAM 蛋白的表达纯化与 Westernbloting 鉴定将诱导表达产物进行 SDS PAGE 分析 ( 图 2a), 结果显示在诱导 4h 后有一明显条带, 该条带大小与组氨酸融合目的蛋白大小相近 ( 相对分子量 Mr29000), 经 Westernbloting 试验验证此条带确为目的片段所表达的重组蛋白 ( 图 2b), 纯化后蛋白经图像软件分析其纯度可达 95%, 其纯度可以满足动物免疫试验需要 2.3 抗体的纯化及纯度和分子量检测取对数生长期 4B2 2F2 杂交瘤细胞制备小鼠腹水, 采用 proteing 亲和纯化法纯化抗体,PBS 调整抗体浓度为 1mg/mlSDS PAGE 对纯化的抗体蛋白进行纯度和分子量分析, 电泳结果显示抗体蛋白经还原电泳呈现清晰的两条带 ( 图 3), 重链约 50kDa, 轻链约 26kDa, 经图像软件分析其纯度可达 95%, 其纯度可以满足 Westernblot 及 FACS 实验需要 2.4 抗 EpCAM 蛋白单抗的生物学特性分析采用上述免疫融合和筛选方法, 共获得了 2 株抗 EpCAM 的细胞株, 分别命名为 4B2 2F2, 经间接 ELISA 法测定,2 株单抗的杂交瘤细胞培养上清 ELISA 效价分图 3 4B2 与 2F2 纯化抗体的 SDS PAGE 分析 Fig.3 SDS PAGEanalysisof purified4b2and2f2antibody 1:4B2;2:2F2 别为 ,1 8000, 腹水效价为 , ,Westernblot 结果显示 4B2 腹水纯化所得单抗能够识别 FaDu 细胞中的 EpCAM 蛋白, 但 2F2 未能识别 FaDu 细胞中的变性的 EpCAM 蛋白 ( 图 4a) FACS 结果显示两者均能和 FaDu 细胞中天然的 EpCAM 蛋白结合, 且 2F2 的结合活性高于 4B2( 图 4b) 3 讨论实验通过从肺癌患者组织中获得 EpCAMRNA, 从而获得 EpCAM 胞外段基因, 由大肠杆菌原核表达获得的 EpCAM 重组蛋白, 将纯化蛋白免疫 BALB /c 小鼠, 采用 B 淋巴细胞杂交瘤技术, 经多次细胞融合反复筛选和克隆化培养, 成功地获得 2 株可稳定持续分泌特异性抗 EpCAM 的杂交瘤细胞株, 命名为 4B2 2F2, 纯

4 22 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No 图 4 EpCAM 单克隆抗体结合特异性的分析 Fig.4 Bindingspecificityofthepurifiedmonoclonalantibody (a)westernblotanalysisofthepurifiedmonoclonalantibody (b)facsanalysiswiththemonoclonalantibodyonepcam positivecelline (FaDu),BrokenlinesarenegativecontrolswiththesecondaryantibodyGoatantiMouse FITCalone 化腹水的间接 ELISA 结果显示其均与真核表达 EpCAM 蛋白结合,FACS 结果显示 4B2 2F2 均与 FaDu 细胞中的天然 EpCAME 蛋白结合, 且 2F2 与 FaDu 细胞的亲和力高于 4B2,Westernblot 的结果显示,4B2 与 FaDu 细胞中 EpCAM 蛋白特异性的结合, 在 43kDa 处出现两条特异性条带的可能原因是细胞中的 EpCAM 蛋白存在不同程度糖基化结构 [10] 2F2 不能结合, 可能是由于 Westernblot 检测的为蛋白质的一级结构, 而 2F2 仅识别具有空间结构抗原表位, 在样品加热变性过程中, 其识别的位点被破坏, 故不能特异性的识别 EpCAM 作为一种重要的细胞表面抗原, 其与肿瘤的发生发展转移密切相关, 近年来其在肿瘤免疫治疗中的作用备受关注, 研究通过免疫筛选成功制备了两株能稳定分泌抗 EpCAM 单抗的杂交瘤细胞株, 并制备了小鼠腹水单克隆抗体,FACS 结果显示其和 EpCAM 阳性细胞株 FaDu 细胞均有良好的结合活性, 为进一步开发适用于临床治疗的抗体药物奠定了基础参考文献 [1]HerlynM,SteplewskiZ,HerlynD,etal.Colorectalcarcinoma specificantigen:detectionbymeansofmonoclonalantibodies. ProcNatlAcadSciUSA,1979,76(3): [2] WentP,LugliA,MeierS,etal.FrequentEpCAM protein expresioninhumancarcinomas.hum Pathol,2004,35(1), [3]WentP,DirnhoferS,SalvisbergT,etal.Expresionofepithelial celadhesionmolecule(epcam)inrenalepithelialtumors.amj SurgPathol,2005,29(1): [4] WentP,VaseiM,BubendorfL,etal.Frequenthigh level expresionoftheimmunotherapeutictargetep CAM incolon, stomach,prostateandlungcancers.brjcancer,2006,94(1): [5] SpizoG, WentP, DirnhoferS, etal. Overexpresion of epithelialceladhesionmolecule(ep CAM)isanindependent prognosticmarkerforreducedsurvivalofpatientswithepithelial ovariancancer.gynecoloncol,2006,103(2): [6]SpizoG,WentP,DirnhoferS,etal.HighEp CAM expresion isasociatedwithpoorprognosisinnode positivebreastcancer. BreastCancerResTreat,2004,86(3): [7]LitvinovSV,BakkerHA,GourevitchMM,etal.Evidencefora roleoftheepithelialglycoprotein40(ep CAM)inepithelialcel celadhesion.celadhescommun,1994,2(5): [8] Osta W A, Chen Y, Mikhitarian K, etal. EpCAM is overexpresedinbreastcancerandisapotentialtargetforbreast cancergenetherapy.cancerres,2004,64(16): [9] MelchersL J, RuitersM H,McLaughlin P M. EpCAM in carcinogenesis:thegood,thebadortheugly.carcinogenesis, 2010,31(11): [10]KazemierH G,ArendzenAJ,TerpstraP,etal.Transcription factors and molecular epigenetic marks underlying EpCAM

5 2012,32(5) 孔娟等 :EpCAM 蛋白的表达纯化及其单克隆抗体的制备 23 overexpresioninovariancancer.brjcancer,2011,105(2): ExpresionandPurificationofEpCAM ProteinandPreparation ofthemonoclonalantibodies KONGJuan GAOHui ping ZHANGPeng wei SHIBi zhi JIANGHua YANJin LIZong hai (StateKeyLaboratoryofOncogenesandRelatedGenes,RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine, ShanghaiCancerInstitute,Shanghai ,China) Abstract Objective: Prokaryotic expresion,purification ofthe EpCAM protein,preparation and characterizationofthemonoclonalantibodiesagainsttheprotein.methods:thegenewasclonedintopet 28a (+)plasmid.therecombinantplasmidepcam/pet28awastransformedintoe.colibl21andinducedwith IPTG.TherecombinantproteinwaspurifiedwithNi NTAresin.Themonoclonalantibodieswerepreparedby fusionofthepurifiedepcam proteinimmunizedbalb/cmouse sspleencelswithsp2/0myelomacels, positivecelswerescreenedwithindirectelisa andthepositivecelswereusedtoimmunebalb/cmiceto obtainthemonoclonalantibodiesagainstepcam protein.thebindingspecificityofthepurifiedmonoclonal antibodieswereanalysisedbywesternblotandfacs.results:therecombinantplasmidepcam/pet28aand purifiedproteinwereobtained,twohybridomacellinessecretinganti EpCAM IgGMcAbswereestablishedand namedas4b2,2f2.facsanalysisshowedthatthetwomcabsshowedhighspecificitytofaducelline,while Westernblotinganalysisshowedthatonly4B2canrecognizethedenaturedEpCAM proteininfaducelline. Conclusions:Theanti EpCAM IgGMcAbswerepreparedwhichhadhighspecificitytoFaDucelline,andit couldbeusedtodeveloptheanti EpCAM antibodyincancertherapy. Keywords EpCAM Hybridomacellines Monoclonalantibody(McAb) 致谢近期为本刊审稿的专家 ( 按姓氏笔划排列 ): 丁久元于益芝马小军尹大川毛建平王友信王玉建王景林王瑞刚王静云邓宁卢文玉史兆兴田生和刘建国刘晓兰向华江宁许文涛邢建民何光源吴洁吴家和吴楠张兆山张春义张博润张毅李宽钰杜卫华杨春英杨革杨培龙杨献光汪东风沈亚领邱德有陈洪章陈靠山周志华庞庆丰林秀坤郑小林勇强姜道宏赵世光赵肃清赵春江钞亚鹏钱世钧顾军高明曹泽虹梁前进黄秉仁董关木熊明勇裴雪涛裴雁曦潘杰鞠建松

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

20 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No XhoI 为美国 NEB 公司产品 ; 质粒抽提及 DNA 片段快速胶回收试剂盒为美国 Axygen 公司产品 新生牛血清 (NCS) 胎牛血清 (FBS) 购自 Gibco 公司 HAT DMEM 培养基

20 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No XhoI 为美国 NEB 公司产品 ; 质粒抽提及 DNA 片段快速胶回收试剂盒为美国 Axygen 公司产品新生牛血清 (NCS) 胎牛血清 (FBS) 购自 Gibco 公司 HAT DMEM 培养基