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镀燕
5 years ago
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1 pegfp-n/tnfr 载体的构建及鉴定叶顺传, 曾秋棠, 吴辉文, 吕云波华中科技大学同济医学院协和医院心研所, 湖北武汉 (430022) 摘要 : 目的 : 本研究旨在构建人肿瘤坏死因子受体 (TNFR ) 绿色荧光蛋白表达载体 pegfp-n/tnfr, 为研究 TNFR 细胞内转位奠定实验基础方法 : 培养 U937 细胞, 提取 RNA,RT-PCR 扩增出 TNFR cdna 基因片段, 将 TNFR 基因的 RT-PCR 纯化产物及质粒 pegfp-n DNA 经 Sac I 和 Kpn I 双酶切胶回收纯化酶切片段后, 体外连接酶切片段, 使其定向重组, 再将重组 DNA 转化 E. coli DH5α 感受态细胞, 经复苏后, 在含 Kan r 的 LB 固体培养基上筛选出阳性克隆结果 : 挑取的 LB 固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定, 证实均为阳性克隆, 即 TNFR 与 pegfp-n 体外重组成功结论 : 采用体外重组技术, 成功地将人 TNFR cdna 插入了荧光蛋白表达载体 pegfp-n 中关键词 :TNFR ; 真核表达载体 ; 质粒 pegfp-n; 克隆肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor,tnf) 是具有多功能的多肽, 在炎症反应中起重要作用在介导细胞损伤的过程中,TNF 主要结合并活化 TNF 受体 (TNF receptor,tnfr ), 然后 TNFR 激活下游信号通路, 这些通路在心肌细胞和血管内皮细胞凋亡起其调节作用 [], 但 TNFR 细胞内转位通路及调节因子尚不明确 [2] 绿色荧光蛋白 (Green fluorescence protein, GFP) 是 20 世纪 90 年代中期发展起来的一种全新的报告分子 GFP 分子质量小, 易与其他目的基因形成融合基因, 对细胞无毒副反应, 而且其化学性质稳定, 使用方便, 可以在活体细胞中定时观察, 所以连接有 GFP 的载体 pegfp-n 在分子生物学中被广泛应用本研究旨在构建以 GFP 为报告基因的重组表达质粒 pegfp-n/tnfr, 为下一步转染人脐静脉血管内皮细胞并观察其表达情况, 进一步研究 TNFR 细胞内转位通路及调节因子奠定基础. 材料与方法. 材料.. 主要试剂 : Trizol 试剂购自 Invitrogen 公司 RT-PCR 试剂盒购自大连宝生物 PCR 产物纯化试剂盒购自 Promega 公司质粒抽提试剂盒 DNA marker 购自北京天根生化 T4 DNA 连接酶限制性内切酶 Kpn I Sac I 购自 NEB 公司国产胎牛血清购自杭州四季青 RPMI 640 培养基为 Hyclone 公司产品引物的合成和序列测定由上海生工完成.2 细胞质粒与菌株 : U937 细胞质粒 pegfp-n 由华中科技大学同济医学院免疫学国家重点实验室惠赠, DH5α 感受态细胞购自天根生化科技 ( 北京 ).2 方法.2. U937 细胞培养本课题得到教育部博士点专项基金资助项目 ( ) 的资助 --

2 人类白血病细胞 U937 细胞株接种于含有 0% 胎牛血清青霉素 00 U/ml 及链霉素 00 U/ml 的 RPMI 640 培养液中, 于 37 5% CO2 饱和湿度下培养, 每 2 天换液次, 视生长情况进行适当传代.2.2 细胞总 RNA 的提取培养的 U937 细胞,000rpm, 离心 6min, 收集细胞以 Trizol 试剂抽提细胞总 RNA, 紫外分光光度法测定 A260/A280, 使用的标本符合 A260/A280.8~ 人 TNFR 基因扩增片段的引物设计及合成参照 TNFR cdna 的基因序列 (GeneBank No. M58286) 设计引物 T T2 扩增全长 TNFR 前向引物 T 在 ATG 前加入 kozak 序列以提高转录起始的效率, 并在 5 端引入 Sac I 酶切位点前向引物 T 为 :5 - AGT AGA GCT CGC CAC CAT GGG CCT CTC CAC CGT GCC TGA C - 3 ( 斜体部分为 kozak 序列, 下划线部分为 Sac I 识别序列 ) 逆向引物 T2 将 TNFR 的终止密码删除并使其阅读框与下游的 EGFP 基因一致, 并在 5 端引入 Kpn I 酶切位点 T2 为 :5 - ATC AGG TAC CTC TCT GAG AAG ACT GGG CGC GGG CGG GA - 3 ( 下划线序列为 Kpn I 识别序列 ) 产物长度 365 bp, 加引物为 393 bp.2.4 RT-PCR 体外扩增目的基因片段以 0.5µg DNA 进行逆转录反应合成第一链 cdna, 按试剂盒建议的方法进行合成的 cdna 即可用于 PCR 扩增或存 -20 备用 RNA 的完整性以.0% 琼脂糖凝胶电泳及扩增管家基因 8ssRNA 进行验证 PCR 反应体系 :5 µl cdna 0.625U Takara Ex Taq 5 pmol/l 上下游引物 5X PCR Buffer, 加入去离子水至总体积 25µl 采用以下反应条件进行扩增: 8ssRNA 的 PCR 条件 :94 5min, 首次循环 94 30s, s,72 2min, 共 30 个循环, 最后 72 0 min,4 5 min 2 TNFR T T2 引物的 PCR 条件 :94 5min, 首次循环 94 30s, s,72 2min, 共 30 个循环, 最后 72 0 min,4 5 min 同时设立用超纯水代替模板 DNA 的阴性对照.2.5 目的基因片段 PCR 产物的纯化 PCR 产物经.0% 琼脂糖凝胶电泳进行鉴定, 采用试剂盒纯化, 按说明书操作.2.6 重组载体 pegfp-n/tnfr 的构建 Sac I 和 Kpn I 对 PCR 产物和 pegfp-n 进行双酶切, 琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的基因与质粒 DNA 按 3:( 摩尔比 ) 的比例混合进行连接反应, 加 T4 DNA 连接酶 5µl, 总反应体积 20µl 6 连接过夜.2.7 重组载体 pegfp-n/tnfr 的筛选与鉴定连接产物转化宿主菌 E. coli DH5α, 铺含有 Kanamycin 的 LB 琼脂平板 37 培养过夜, 挑取阳性克隆接种于含有 30µg/ml Kanamycin 的 LB 培养液中, 振荡培养过夜菌液离心集菌弃上清液用小量质粒抽提试剂盒提取重组质粒 DNA,Sac I 和 Kpn I 双酶切,.0% 琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒 PCR 扩增的方法对重组子进行复筛和鉴定扩增阳性重组质粒, -2-

3 采用 Sanger 双脱氧链终止法, 测定目的基因的 DNA 序列 2. 结果 2. 提取 RNA 的鉴定所得 RNA 在 260nm 和 280nm 的吸光度值之比为.8~2.0, 显示其纯度符合 RT-PCR 聚合酶链要求 2.2 RT-PCR 扩增产物分子量的鉴定 U937 细胞总 RNA 经 RT-PCR 扩增后, 经.0% 琼脂糖凝胶电泳检测, 在.4kb 条带处出现略大于.4kb 的特异性扩增条带 ( 图 ) 图人 TNFR 全长 cdna 电泳图 Fig. Human TNFR full-length cdna map 2.3 质粒 pegfp-n 的鉴定提取的 pegfp-n 质粒 DNA 经.0% 琼脂糖凝胶电泳检测, 未见任何降解及蛋白质 RNA 污染 2.4 重组质粒 pegfp-n/tnfr 的酶切鉴定重组质粒 pegfp-n/tnfr 经 Sac I( 或 Kpn I) 单酶切为 6.kb 的单一片段, 比空质粒 pegfp-n 分子量大 ; 经 Sac I 和 Kpn I 双酶切, 得到 4.7kb 和.4kb 的 2 个片段 ( 见图 2) 由于质粒 pegfp-n 本身大小为 4.7kb,TNFR 基因约为.4kb, 酶切结果基本说明 TNFR 基因与 pegfp-n 正确重组图 2 Sac I/Kpn I 双酶切测序 Fig 2. Sac I/Kpn I digested pegfp-n/tnfr vector Lane, Marker; Lane 2,3,4 Sac I/Kpn I digested pegfp-n/tnfr vector -3-

4 2.5 重组质粒 pegfp-n/tnfr 插入 TNFR 基因的核苷酸序列测定 : 测序结果显示重组质粒 pegfp-n/tnfr 中插入基因长 393bp, 为一开放阅读框架, 与 Genbank 中公布的人 TNFR mrna 基因序列完全相符, 且方向正确 3. 讨论近年来的基础医学和临床实验表明,TNF 在心血管疾病抗肿瘤和自身免疫病等的病理生理过程中起着重要的介质作用 [3] TNFα 主要由激活的巨噬细胞中性粒细胞内皮细胞及 B 淋巴细胞分泌, 是具有多功能的多肽, 在炎症反应中起重要作用在介导细胞损伤的过程中,TNFα 结合并活化肿瘤坏死因子受体 TNFR, 然后激活下游信号通路, 这些通路在内皮细胞等凋亡中起调节作用 [] TNF 的生物学功能是通过细胞表面相应的受体 TNFR TNFR 2 来实现的 TNFR 引起的作用非常广泛, 它包括杀细胞活性抗病毒活性促进成纤维细胞增殖以及细胞程序化死亡激活 NF-κB 等多种生物活性物质的信号传递 TNFR 2 主要传递胸腺细胞和 N K 等淋巴细胞的增殖信号, 通过促进 TNFα 结合 TNFR 而增加 TNFR 诱导的作用 TNFR 下游信号通路明确 TNFα 结合到 TNFR 受体引起受体三聚体化, 从而起始细胞凋亡信号, 但 TNFR 细胞内转位通路及调节因子尚不明确 [2] 在未受刺激的细胞,TNFR 主要定位于反式高尔基体,TNFR 是否从高尔基体分泌, 分泌颗粒如何转位到细胞膜, 以及哪些因子参与调节这一过程目前尚不明确来源于水母的绿色荧光蛋白 ( GFP) 是一种天然荧光蛋白, 基因编码区序列长为 74bp, 编码 238 个氨基酸的多肽, 可在 450~490 nm 的蓝光激发下发出绿光以往常用的报告基因如 LacZ,CAT,luc 等编码的都是酶蛋白, 检测需要底物或辅助因子的参与, 并对细胞具有一定的损伤 [4] 而 GFP 作为一种基因表达的标记物优于这些传统的报告基因, 其优点在于 : ()GFP 不干扰细胞的生长和功能携带 GFP 的融合蛋白既具有 GFP 的绿色荧光, 又保持靶蛋白的生理功能, 而且对细胞无毒性作用, 因而能在活细胞状态下检测基因表达 (2) 观察更为方便将 GFP 融合基因转染至真核细胞中表达后, 可以方便地通过观察活细胞中 GFP 融合蛋白的绿色荧光布局, 分析未知基因表达蛋白在细胞中的分布和定位 (3) GFP 标记方法比免疫组织化学及传统的标记方法具有更高的灵敏度和分辨率 [5] 因此 GFP 成为生化及分子生物学领域应用广泛的选择标记 EGFP 是 GFP 的突变体, 荧光强度更强, 表达效率更高, 更适合作为报告基因用于研究基因表达与调控细胞分化及蛋白质的胞内定位及功能转换研究 TN FR 是揭示 TN F 作用机理的重要途径, 本实验构建了绿色荧光蛋白融合 TNFR 基因的表达载体, 可对 TNFR 的亚细胞定位进行分析, 并有可能长期跟踪 TNFR 的表达情况因此, 重组载体 pegfp-n/tnfr 可用于 TNFR 细胞内转位过程的研究同时, 重组载体 pegfp-n/tnfr 可转染细胞, 研究哪些因素参与 TNFR 的转位过程, 为进一步阐明 TNF 引起的细胞损伤机制提供实验基础, 并最终为临床干预 TNF 诱导细胞损伤提供新的思路 -4-

5 参考文献. Valen G. Cellular signaling mechanisms in adaptation to ischemia-induced myocardial damage [J]. Ann Med 2003; 35: Chen G,Goeddel DV. TNF-R Signaling: A Beautiful Pathway [J]. Science May 3; 296(5573): Maiai SR. Infliximab treatment of rheumatoid arthritis [J ]. Rheum Dis Clin North Am,2004,30 (2) : Gerdes HH,Kaether C. Green fluorescent protein : applications in cell biology [J ]. FEBS Lett,996, 389 : Kain SR,Adams M,Kondepudi A,et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization [J ]. Biotechniques,995,9 : Construction and Identification of mammalian cell expression vector for pegfp-n and TNFR fusion protein Ye Shunchuan, Zeng Qiutang, Wu Huiwen, Lv Yunbo Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology, Institute of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, People s Republic of China (430022) Abstract AIM: The purpose of this study was to construct a eukaryotic fluorescent expression vector carrying human TNFR gene. METHODS: TNFR gene was cloned by RT-PCR. Both TNFR gene and plasmid pegfp-n DNA were digested with Sac I and Kpn I. After purification,the two fragments obtained were ligated by T4 DNA Ligase. This recombinant DNA was then transformed into E. coli Competent Cells DH5α and positive clones were selected on the LB agarose plate containing kanamycin (30µg/ml). RESULT: Single clones were identified by double digestion with Sac I and Kpn I,and two fragments with the size of 4.7 kb and.4 kb were produced as expected. Sequence analysis showed that expression vector PEGFP-N/TNFR had been constructed successfully. CONCLUSIONS: The TNFR gene was successfully inserted into the eukaryote expression vector plasmid pegfp-n by the recombination technique in vitro. Keywords: TNFR ; eukaryote expression vector; plasmid pegfp-n; Clone -5-

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽