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1 第 34 卷第 6 期西南大学学报 ( 自然科学版 ) 2012 年 6 月 Vol.34 No.6 JournalofSouthwestUniversity (NaturalScienceEdition) Jun 文章编号 : (2012) 乙型肝炎病毒外膜蛋白真核 1 表达质粒的构建和表达 王丹, 童师雯, 张红敏, 李宏, 胡鹏, 杨轶轩, 张大志, 胡怀东 重庆医科大学附属第二医院感染病科, 重庆 摘要 : 目的 : 构建乙型肝炎病毒 (HBV)S 基因 ( 包括 Pre-S1,Pre-S2 和 S) 的真核表达质粒. 方法 : 将 PCR 克隆获得的 Largesurface,Middlesurface 和 Smalsurface 基因片段通过 T-A 克隆插入真核表达载体 Pcmv-Tag2B, 构建重组质粒 Tag2B-LS,Tag2B-MS 和 Tag2B-SS, 经测序后转染 293FT 细胞, 收取蛋白并鉴定. 结果 : 分别双酶切构建的重组质粒, 获得相应大小的 DNA 片段, 且测序证实为有完整读码框的 S 基因, 重组质粒分别转染 293FT 细胞并表达, 经 WesternBlot 鉴定证实. 结论 : 成功构建真核表达质粒 Tag2B-LS,Tag2B-MS 和 Tag2B-SS, 并能正确表达, 为进一步研究乙型肝炎病毒外膜蛋白的功能打下基础. 关键词 : 外膜蛋白 ; 乙型肝炎病毒 ;Tag2B; 真核表达质粒中图分类号 :Q812 文献标志码 :A 乙型肝炎病毒 (hepatitisbvirus,hbv) 感染在世界范围内流行, 中国 HBV 携带者达 1.3 亿, 慢性乙 型肝炎患者高达 3000 万人, 其持续感染与多种肝脏疾病相关.HBV 外膜蛋白携带可与肝细胞膜结合的受 体, 使 HBV 病毒能附着和侵入肝细胞, 并能促使病毒的成熟和分泌, 但具体机制仍不清楚. 与此同时, 肝 细胞癌 (hepatocelularcarcinoma,hcc) 也与 HBV 病毒高度相关.HBV 外膜蛋白可通过作用于相关蛋白 而参与细胞生长和癌形成的多条信号通路, 从而对 HCC 的产生和发展产生影响. 所以, 寻找与 HBV 外膜 蛋白相互作用的蛋白, 对于研究 HBV 病毒感染细胞和与 HBV 相关的 HCC 都十分有必要. HBV 外膜蛋白包括大蛋白 (Largesurface,LS) 中蛋白 (Middlesurface, MS) 和主蛋白 (Smalsurface,SS). 用带有红细胞病毒 (cytomegalovirus,cmv) 启动子 SV40 启动子且带 FLAG 标签的 Tag-2B 载体构建真核表达质粒 Tag2B-LS,Tag2B-MS 和 Tag2B-SS, 通过脂质体转染法瞬时转染 293FT 细胞, 以期 3 个质粒在 293FT 细胞中能分别有效表达具有生物学 活性的蛋白, 为进一步研究 HBV 外膜蛋白及其相互作用蛋白在病毒侵入细胞及整个感染过程中的作 用提供条件. 1 材料和方法 1.1 主要试剂及抗体 peasy-t1simple 载体 PMD18-T-Simple 载体购于北京全式金 (TransGen) 公司 ; 限制性核酸内切 1 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( , , , ); 国家科技重大专项资助项目 (2008ZX ); 教育部长江学者和创新团队发展计划资助项目 (IRT0872). 作者简介 : 王丹 (1986 ), 女, 四川安岳人, 硕士研究生, 主要从事病毒性肝炎研究. 通信作者 : 胡怀东, 教授.

2 2 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 34 卷 酶 三磷酸腺苷核糖核苷 (dntp) Taq 酶购于大连宝生物 (TaKaRa) 公司 ; 质粒抽提试剂盒 DNA 胶回收 试剂盒购于北京天根生化科技有限公司 (TIANGEN); 脂质体 Lipoectamine2000 购于美国 Invitrogen 公 司 ; 胎牛血清购于美国 Gibco 公司, 非必需氨基酸 胰酶 双抗购于美国 Hyclone 公司, 一抗 (anti-flag) 购于美国 sigma 公司. 1.2 引物设计及内切酶 ( 表 1) 表 1 大 中 小表面抗原引物 PCR 产物长度和酶切位点 上游引物下游引物 PCR 产物长度酶切位点 Large surface 5 -CTGCAGGGGCAGAATCTTTC- CACCA-3 5 -AAGCTTTTAAATGTAT- ACCCAAAGACA A bp PstⅠ:CTGCAG HandⅢ:AAGCTT Middle surface 5 -CTGCAGCAGTGGAATTCCA- CAACCT-3 5 -AAGCTTTTAAATGTAT- ACCCAAAGACA A-3 843bp PstⅠ:CTGCAG HandⅢ:AAGCTT Smal surface 5 -GAATTCGAGAACATCGCAT- CAGGA-3 5 -CTCGAGTTA AATGTAT- ACCCAAAGACA-3 679bp EcoRⅠ:GAATTC XhoⅠ:CTCGAG 1.3 质粒构建及鉴定 PCR 扩增 HBV 外膜蛋白基因片段 HBV 基因组模板 pcdna3.1-hbv 质粒由本实验室 ( 重庆医科大学肝炎研究所 ) 保存, 分别设计三者引 物 ( 表 1).PCR 技术扩增 HBV 基因组 Smalsurfaceantigen 基因片段, 在 50μL 体系中加入 0.5μL 模板, 上游和下游引物各 1μL, 加入 4μL,2.5mM 的 dntp Mixture,5μL10 TaqBufer,0.5μLTaq 酶. 反 应条件为 :94 预变性 3min;94 40s,55 40s,72 1min,29 个循环 ;72 终延伸 5min. LAPCR 技术扩增 HBV 基因组 Largesurfaceantigen 和 Middlesurfaceantigen 基因片段. 在反应体 系中加入 1μL 模板,5μL10 LA PCR BuferⅡ,8μLdNTP Mixture, 上游和下游引物各加 1μL, 0.5μLLATaq 酶, 补水至 50μL. 反应条件为 :94 预变性 3min;94 40s,56 40s,72 90s,29 个循环 ;72 终延伸 5min. 分别将三者 PCR 产物用 1% 琼脂凝胶电泳分离, 切胶回收 T-A 克隆构建重组质粒 Tag2B-LS,Tag2B-MS 和 Tag2B-SS 将载体 PMD18-T-Simple 用内切酶 PstⅠ 和 HandⅢ 双酶切, 载体 peasy-t1simple 和 Tag2B 分别用 PstⅠ 和 HandⅢ,EcoRⅠ 和 XhoⅠ 双酶切, 琼脂凝胶电泳后分别回收载体片段. 将胶回收得到的 Largesurfaceantigen 基因片段与 PMD18-T-Simple 载体连接,Middlesurfaceantigen 和 Smalsurfaceantigen 基因片段分别与 peasy-t1simple 载体连接, 再将三者连接产物分别转化入 大肠杆菌 DH5a, 用氨苄青霉素筛选培养, 挑取阳性克隆扩增后提取质粒进行双酶切 ( 酶切位点见表 1), 并 用 1% 琼脂凝胶电泳分离鉴定. 将三者与 T 载体连接后双酶切所得目的片段分别与 Tag2B 载体连接, 再各 自转化入大肠杆菌 DH5a, 用卡那霉素筛选培养, 挑取阳性克隆扩增后提取质粒进行双酶切, 并送上海生 物工程有限公司测序, 鉴定正确 FT 细胞株的转染 293FT 细胞获赠于南开大学医学院. 转染前将上述 3 种质粒分别中量提取, 双酶切鉴定, 以备转染. 293FT 细胞培养于含 10% 胎牛血清的 DMEM, 于转染前一天转至六孔板培养, 体积单位为 个 /ml. 按照 Lipofectin2000(Invitrogen) 说明书将目的质粒 Tag2B-LS,Tag2B-MS 和 Tag2B-SS 分 别转染 293FT 细胞, 并设置相应空白对照. 转染后 48h 裂解细胞, 收取蛋白, 分别用 Westernblot 检 测 3 个目的质粒的表达. 1.5 Westernblot 检测 细胞转染后 48h 用煮沸的 1 SDSloadingbufer 裂解细胞, 每孔 80μL, 收取裂解后细胞于 98 煮 8 min,12000r/min 离心 3 min, 取上清液 20μL, 用 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 印迹转染醋酸纤维素 膜. 用 5% 脱脂牛奶室温封闭 1h 后, 加入 Anti-FLAG 抗体于 4 孵育 16h. 加入那根过氧化物酶标记

3 第 6 期王丹, 等 : 乙型肝炎病毒外膜蛋白真核表达质粒的构建和表达 3 的二抗 ( 羊抗鼠 ) 室温孵育 1h 后, 用化学发光法检测目的质粒的表达. 2 结果 2.1 目的基因真核表达质粒的构建分别用内切酶 PstⅠ 和 HandⅢ 酶切重组质粒 Tag2B-LS 和 Tag2B-MS, 内切酶 EcoRⅠ 和 XhoⅠ 酶切 Tag2B-SS. 各切出 2 个片段, 大片段大小约 4500bp, 与 Tag2B 空质粒大小一致 ; 小片段大小分别约为 1200bp,800bp 和 700bp, 与目的基因大小一致 ( 图 1). 三者测序结果表明, 重组质粒分别含有相应的完整目的基因片段. 图 1 Tag2b-LS,Tag2b-MS 和 Tag2b-SS 双酶切 2.2 Westernblot 检测目的基因在 293FT 细胞中的表达 Westernblot 检测结果表明, 转染了重组质粒 Tag2B-LS,Tag2B-MS 和 Tag2B-SS 的 293FT 细胞分别在 , 和 处各出现了强反应条带. 空白对照均未见相应条带出现 ( 图 2). 3 讨论 外膜蛋白由 HBV 病毒的开放阅读框 S 图 2 WesternBlot 检测 Tag2B-LS,Tag2B-MS 和 Tag2B-SS 表达 基因 (S-ORF, 核苷酸 ) 编码合成, 包括 3 种外膜成分 : 大蛋白 (PreS1-,PreS2- 和 HBsAg), 中蛋 白 (PreS2-,HBsAg) 和主蛋白 (HBsAg). 三者具有的共同编码部分 HBsAg 是 HBV 的主要表位, 为宿主提 供保护性免疫的免疫原, 引起感染宿主免疫应答. 有研究表明 HBs 与 HBx 共同参与增强 Raf1 启动子活性 以使其表达增加的过程 [1], 从而对细胞的生长和癌的形成产生影响. 运用 RNAi 技术沉默 HBs 基因后, 多 种与细胞分化和癌症形成相关的基因如 ACP2,BHLHB2,CLK3,CTSC,FOS,NR1D1,PIM1 和 SEPT6 的 [2] 表达都下调, 从而抑制 HCC 的生长. 近年来, 针对 Pre-S 蛋白的研究增多, 发现其能作用于多种信号通 路中的蛋白, 如活化在肿瘤细胞生长和增值过程中起重要作用的 mtor [3]. 大蛋白可调节 HBcAg 核移, [4-5] [6] 抑制小球形颗粒分泌, 并与 DNA 氧化损害和肝细胞癌的发生相关.Hildt 等的研究表明, 大蛋白能 转式激活多种启动子, 如 AP-1 和 NF-kappaB. 中蛋白可通过 pre-s2 蛋白与单体人血清蛋白连接, 从而逃 避病毒免疫应答, 与病毒血症的持续相关, 且与大蛋白一样具有转式激活作用. 因此, 寻找与外膜蛋白相 互作用的蛋白, 对于研究 HBV 感染细胞和与 HBV 相关的 HCC 的发生和发展机制具有重要意义. Pcmv-Tag2B 是具有 SV40 启动子 CMV 启动子 Kanamycin 抗性且带 FLAG 标签的真核表达载体, [7] 能在哺乳类细胞内高水平表达融合蛋白.FLAG 标签特异性高, 且大小仅 , 不影响融合蛋白的表

4 4 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 34 卷 达. 因此, 构建表达 HBV 外膜蛋白和 FLAG 标签融合蛋白的质粒, 为进一步运用亲和层析技术 质谱技 术和生物信息学方法筛选与乙肝外膜蛋白相互作用的细胞蛋白提供了条件, 进而为研究乙型肝炎病毒附着 和侵入细胞对 HCC 的发生和发展机制打下了基础. 参考文献 : [1] TIAN Yuaṉyuan,HU Yuan,WANGZeng-chan,etal.HepatitisB VirusRegulatesRaf1Expressionin HepG CelsbyEnhancingItsPromoterActivity[J].ArchVirol,2011,156(5): [2] XIANGJL,FENGX,QINGBC,etal.KnockdownofHBVSurfaceAntigenGeneExpressionbyaLentiviralMicroR- NA-BasedSystemInhibitsHBV ReplicationandHCCGrowth [J].JViralHepat,2011,18(9): [3] TENGChiao-fang,WU Haṉchieh,TSAIHung-wen,etal.NovelFeedbackInhibitionofSurfaceAntigenSynthesisby mtorsignalanditsimplicationfor HepatitisB VirusTumorigenesisand Therapy [J].Hepatology,2011,54(4): [4] BRUSSV,GERHARDTE,VIELUFK,etal.FunctionsoftheLargeHepatitisBVirusSurfaceProteininViralParticleMorphogenesis[J].Intervirology,1996,39(1-2): [5] BRUSSV,VIELUFK.FunctionsoftheInternalPre-SDomainoftheLargeSurfaceProteininHepatitisBVirusParticleMorphogenesis[J].JVirol,1995,69(11): [6] HILDTE,SAHERG,BRUSSV,etal.TheHepatitisBVirusLargeSurfaceProtein(LHBs)isaTranscriptionalActivator[J].Virology,1996,225(1): [7] TERPEK.OverviewofTagProteinFusions:from MolecularandBiochemicalFundamentalstoCommercialSystems [J].ApplMicrobiolBiotechnol,2003,60(5): ConstructionofthePlasmidsExpressing Pcmv-Tag2B-HBsGeneandTheirExpression WANG Dan, TONGShi-wen, ZHANG Hong-min, LI Hong, HU Peng, YANG Yi-xuan, ZHANG Daẕhi, HU Huaiḏong DepartmentofInfectiousDiseases,theSecondAfiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China Abstract:ToconstructtheeukaryoticexpressionplasmidsoftheSgeneofHBVvirus,weclonedthegene fragmentslargesurface(ls),middlesurface(ms)andsmalsurfaceantigenof HBV(SS)through PCR.Theeukaryoticexpressionplasmidsnamed Tag2B-LS,Tag2B-MSand Tag2B-SSwereconstructedwiththerespectivegenefragmentsandPcmv-Tag2Bvectors.DNAsequencing identifiedtherecombinantplasmidsconstructedincludingthecompletereadingframeofthesgene.then theplasmidsweretransfectedinto293ftcelsusinglipofecting2000.westernblotconfirmedthatthe genefragmentswereexpressedefectively.altheresultsshowedthattheeukaryoticexpressionplasmids ofthesgeneofhbvviruswereconstructedandexpressedsuccessfulyandthiscouldlayafoundationfor thefurtherresearchonthefunctionofthehbv-surfaceproteins. Keywords:surfaceprotein;hepatitisBvirus;Tag2B;eukaryoticexpressionplasmid 责任编辑夏娟

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