张 伟 等 + 基于 0. 的神经胶质酸性蛋白质自身抗体的血清含量测定及其在脑胶质母细胞瘤诊断中的应用 ;!1 诊断技术因其高昂费用而无法得到广泛应用 因而发展基于临床血液样本且价格相对低廉的脑胶质瘤检测手段成为必须 早在 1" 年 % 就发现唾 4 液酸乳四糖神经酰胺可用于恶性脑胶质瘤的检测 随后

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1 ;!" 复旦学报 医学版!"# 基于.7 & 的神经胶质酸性蛋白自身抗体的血清含量测定及其在脑胶质母细胞瘤诊断中的应用 张 伟 危 平 施 前 复旦大学生物医学研究院蛋白组学与系统生物学研究院 上海! 摘要 目的 发展基于 0. 的血清神经胶质酸性蛋白 ((, (%) '%. 自身抗体含量测定方法 用于脑胶质瘤患者的诊断 方法 克隆 12%' 基因至 ' = #' 载体 使用大肠埃希菌中纯化得到的. 重组蛋白包被 1# 孔板 经封闭后依次孵育稀释的血清样本和偶联 5/ 的羊抗人二抗 最后加入 2 7 底物显色 硫酸终止显色反应 测定各孔吸光度 结果 ' = #' 12%' 质粒在大肠埃希菌 /& 菌株中表达产生了大量. 重组蛋白 所得蛋白经洗脱纯化后用作 0. 反应底物 0. 实验中 脑胶质瘤患者血清! 值明显高于正常人 差异有显著统计学意义 结论 使用. 作为抗原的 0. 实验可作为应用. 自身抗体进行脑胶质瘤患者血清诊断的一种候选方法 关键词 神经胶质酸性蛋白自身抗体 脑胶质瘤 0. 实验 中图分类号? "; 文献标志码. +!1#13+&&+# "4# + + #+ ;.7 &''!$" )# %, #!#% ##',, ##" '$"#'' ? )# " & &"# ## "! $ &' 01 *2 (' ),%& % ((, (%) '%. & 0.&,% ( &&+ '- ( 12%' ' = #' %'%, &% '%,% %&,% /&, $& % ''(,% & ' 0.+., % ( * ; 7.& () * ( & %& '( 5/ 3 & %) )2 7& & % *& &(6 0.% &( +2 (% '% &&*& % )5 4 &%, * (*& &% )& &' %' % %4; +-'! '. % '% *& :'% && &, ()' = #'. '(& %&,% /&, $& %'%, '% *& ( ( & & ', 0.+/ &( && * &%, ( (& ' & %*&&, () % (,% ( %( %'+(#!'#' 0.&&)&. % '% & ( ''( & ( '% & &+ % ' ((,,(%) '% ) ( 0.&&) 脑胶质瘤是一种起源于神经胶质细胞的肿瘤 也 是最常见的脑部肿瘤 星形细胞瘤是脑胶质瘤的两个主要类型之一 占脑胶质肿瘤的绝大部分 世界卫生组织依据病情严重程度将星形细胞瘤由轻到重分为 4 级 间变性星形细胞瘤 % 和多形胶母 细胞瘤 % 是最典型的高等级脑胶质瘤 患者! 的中位存活期分别只有! 年和 1 个月 为了让患者得到更好的治疗选择和预后手段 以间变性星形细胞瘤和多形胶母细胞瘤为代表的高等级脑胶质瘤急需在疾病发生早期得到诊断 现有的影像 $%% &' % (&,+ +

2 张 伟 等 + 基于 0. 的神经胶质酸性蛋白质自身抗体的血清含量测定及其在脑胶质母细胞瘤诊断中的应用 ;!1 诊断技术因其高昂费用而无法得到广泛应用 因而发展基于临床血液样本且价格相对低廉的脑胶质瘤检测手段成为必须 早在 1" 年 % 就发现唾 4 液酸乳四糖神经酰胺可用于恶性脑胶质瘤的检测 随后以 $ '&8..5 &2 /& 0 7 $. 为代表的许多脑胶质瘤标志物陆续被发 ; 1 现 近期发现 0! 受体 5 34 和 '31 可作为潜在的高等级脑胶质瘤的血清标志物 自身抗体是一类由免疫系统产生的针对集体自身蛋白 细胞 组织或是器官的抗体 与自身免疫疾病密切相关 例如类风湿关节炎和系统性红斑狼疮 在许多不同类型的癌症患者中也鉴定出肿瘤相关自身 抗原导致的抗体产生 肿瘤自身抗体由肿瘤细胞自身抗原的非正常表达引发 可能直接影响肿瘤生长 也可能通过激活免疫活性细胞诱导可溶性介导因! 子释放来促进炎症反应 肿瘤在可检出之前可能就已诱发自身抗体反应 自身抗体可作为肿瘤检测的 4 早期标志物 已有多种肿瘤自身抗原相关的自身抗体被发现 包括在多种肿瘤中广泛存在的. 依赖性蛋白酶. 和 &;! ; # 乳腺癌中的. := /.$ 和 / 2 " 前列腺癌中的 50 1 肺癌中的. :0 4!! 2 8. / $. 和 74 ; 以及结肠癌中的 /# $ 1"11; $#%, 和. 7 ;! 虽然 &;! 自身抗体在多种癌症中被检出 &;! 突变也在脑 4 胶质瘤的发生中起着重要作用 / 等的研究却表明脑胶质瘤患者血清中不存在 &;! 自身抗体 脑胶质瘤患者血清里被鉴定出存在. 5! 和 ; % 自身抗体 但尚未证实其是否适用于临床检测 如 0. 我们致力于研究存在于脑胶质瘤患者血清中的全新自身抗体 发展基于这些自身抗体的 0. 实验技术 用于脑胶质瘤的分级和诊断 材料和方法 材料和试剂 大肠埃希菌 /& 菌株 脑胶质瘤细胞系 ; 8. 及原核表达质粒 ' = #' 均由本实验室保存 共 4 例脑胶质瘤患者及健康人 对照 血清样本均收集自复旦大学附属华山医院 此项研究已获华山医院及生物医学研究院伦理委员会认可 样本临床资料统计信息见表 其他材料包括 8. 聚合酶 8. 连接酶和各种限制性内切酶 日本 2 / 公司 质粒抽提试剂盒 美国.:) 公司 偶联 5/ 的羊抗人二抗 0 2 美国 $%6 公司 谷胱甘肽琼脂糖珠子 还原性谷胱甘肽 美国 公司 12%' 抗体 英国. 8 % 公司 1# 孔板 德国 % % 公司 2 7 底物试剂盒 美国 % 公司 表 脑胶质瘤患者及健康人的临床资料 ( # #) $#)" '$,#' # # $ %(D. % )!9; &D ) 414"+A"+"1 ;; +"A;+; ( 1 (!!" 的克隆与验证 以脑胶质瘤细胞系 ; 8. 为模板 克隆两端分别带有 0 5 和 / 酶切位点的 12%' 基因 8. 序列 所用引物序列如下 % %@0 5 12%' ; $..22$.2....$ $.2$.$$! % %9 / 12%' /; 22$2$. $$2 $$2$.$.2$.$.2$$22! $/ 反应条件为 1" B 预变性 1" B & # B & B +;! 个循环后 再经 B 反应结束后回收 $/ 产物 经过限制性内切酶 0 5 和 / 双酶切 与同样经 0 5 和 / 双酶切的 ' = #' 载体在 # B 过夜连接 连接体系为 12%' $/ 产物 ' = #' 载体 连接酶 C 连接缓冲液 去离子水 ; 将连接产物加入感受态大肠埃希菌 热激后涂板 次日挑取单克隆进行双酶切验证 并经测序证实 ' = #' 12%' 克隆构建成功. 重组蛋白的表达与验证将构建成功的 ' = #' 12%' 质粒加入感受态大肠埃希菌 4 B 热激后加入 7 培养基 于! B 摇床内孵育 待细菌增殖至菌液! # 为 +; +" 时加入异丙基 8 硫代半乳糖苷 &'%')( 8 ( & 0 2 诱导 并转移至 # B 低温摇床生长过夜 所得菌液离心 4 后 将菌体沉淀用裂解液重悬 ( 2%& 5$('5"+ 含 ; ( $( 和 + 2% = 经超声破裂后离心 ;! 取上清加入谷胱甘肽琼脂糖珠子 4 B 孵育 裂解液洗涤! 遍 随后加入洗脱液 ; ( 2%& 5$('5"+ 含 ; ( $( 和 ( 还原性谷胱甘肽 孵育 ; 所得洗脱产物经 - & % ( 验证及蛋白浓度测定后在后续 0. 实验中用作抗原使用 0. 试验及数据分析在 1# 孔板中每孔加入. 重组蛋白 + 溶于 '51+# 的碳酸盐缓冲液 进行过夜包被 洗涤后加入 ; 7.4 B 封闭 # 随后加入 E 稀释的血清样品于室温孵育

3 ;4 复旦学报 医学版 年 月!"# 血清孵育 洗涤! 次 加入 E; 稀释的偶联 5/ 的羊抗人二抗 在室温下孵育! 次洗涤后 加入 2 7 底物反应 ; 显色 随后加入 ( 5 4 终止反应 在 4; 波长下检测各孔吸光度! 采用双侧 2 分布检测 * ( #&" & 分析脑胶质瘤患者和健康人的 12%' 自身抗体水平相对差异 ' + ; 为差异有统计学意义 ' + 为差异有显著统计学意义 结 果!" 基因克隆 使用脑胶质瘤细胞系 ; 8. 为模板 克隆两端分别带有 0 5 和 / 酶切位点的 12%' 基因 8. 序列 得到! ' 的目的片段 而使用乳腺癌细胞系 2 8. 为模板在相同条件下无法得到. 产物 图 /& 菌株 0 2 诱导过夜后离心 得到菌体沉淀 经裂解液重悬后超声破碎 离心所得上清中加入谷胱甘肽琼脂糖珠子 4 B 孵育 后洗脱 于上述纯化过程中各步骤留取 样品 加入等体积 C 上样缓冲液 上样进行 8. 所得结果用考马斯亮蓝染色 图! 结果显示. 重组蛋白于大肠埃希菌中充分表达并大量存在于上清中 经谷胱甘肽琼脂糖珠子纯化并洗脱后可得到浓度纯度均较高的. 重组蛋白 洗脱液取样进行 - & % ( 加入. 抗体孵育后在相对分子质量 处产生单一条带 图 47 表明. 重组蛋白于洗脱液中富集 且无明显降解现象 经比较 转染有外源性 12%' 的 ; 细胞全裂解液与人细胞中表达的内源及外源性蛋白有着一致的抗原性 可应用于后续 0. 检测 图 4. 图!" 基因的 (- 结果 " (- '! )!" ##" ; % %! 2 8.+,9. +;,++!" 重组子的酶切鉴定 12%' $/ 产物及 ' = #' 载体经 0 5 和 / 双酶切后 所得酶切产物经跑胶纯化后连接并转化涂板 挑取阳性克隆进行 0 5 和 / 双酶切验证 产生条带的大小符合预期 表明重组质粒构建正确 图 图 9 & 重组蛋白的表达与纯化结果 "./, '##,! ) #)!" $##, # % % % - ( (()& &!, % %, 4 ' %, % %, ;7 &,% ( # ( & 7 &, % ( + 图 53' #6 检测 9 & 重组蛋白的表达及抗原性 "5./, '###"# %)!" $##, #%3' #6.. % '% :'% && &, () + ( 图,9. +;,++!" 重组子的酶切鉴定结果 "! "'# '! ),9. +;,++!", '$ 8. % % 8 & ' = #' 12%''(& + 9 & 重组蛋白的表达 纯化与鉴定 将 ' = #' 12%' 质粒转化导入感受态大肠埃希菌 % &' %, % ( * &7$ '% * ;(&+ ( & - ( (()& &!- ( (()&, ;(& 4 ( &, + ( ;- ( (()&, + (+ 患者血清中 9 & 自身抗体的相对含量 收集 例胶质母细胞瘤患者及 例年龄 性别相匹配的

4 张 伟 等 + 基于 0. 的神经胶质酸性蛋白质自身抗体的血清含量测定及其在脑胶质母细胞瘤诊断中的应用 ;4 健康人的血清 以 E 稀释后用于上述 0. 实验 所得结果用 软件处理分析 图 ; 在 0. 实验中 对照组的! 值范围是 +!;1 +11 而患者组的! 值范围为 + 1+!4; 高等级脑胶质瘤患者血清组! 值明显高于正常人对照组 差异有显著统计学意义 ' + 以对照组 ; 的上限值 + # 为阈值计算可得 0. 血清检测方法的检出率为 ; 灵敏度为 1; 图 血清中 9 & 自身抗体的.7 & 检测结果分析 " &# %'').7 & '! ') 9 &!#% &D (,$ %(D ' + + 讨 论 脑胶质瘤作为最常见的脑部致死性疾病 在普通体检中难以发现 发现时病情往往已至晚期 严重影响患者的治疗和预后 现行的检测手段多为影像学诊断 如核磁共振 价格昂贵 因此 开发针对脑胶质瘤的简便血清诊断方法十分必要 可为患者提供更多的治疗选择 亦可简化医师的诊断过程 在血清中筛选适合的自身抗体可能满足这一要求 肿瘤自身抗体在多种癌症中都有发现 如肺癌 乳腺癌 前列腺癌 结肠癌等 但在脑胶质瘤中并不多见 可能由于血脑屏障阻止了免疫细胞浸润进入脑部接触胶质瘤细胞. 是成熟星形细胞中主要的中间纤维蛋 " 白 且仅于胶质星形细胞和神经干细胞中表达 作为细胞骨架成份蛋白 12%' 在星形细胞延伸过程中稳定细胞结构 并调节星形细胞的运动性和形 1 状 许多种类的脑胶质瘤都表达. 如血管中心性胶质瘤 % 0 松果体乳头状瘤 % 及小细胞胶质母细胞瘤 %! 作为脑部最为丰富的结构蛋白. 可能在脑胶质瘤细胞凋亡或坏死过程中与浸润的免疫细胞发生免疫反应 从而产生. 自身抗体 在大肠埃希菌中表达纯化人源重组蛋白的技术已非常成熟 产生的重组蛋白可用于多种免疫学检测 我们在大肠埃希菌 /& 菌株中表达纯化的. 重组蛋白纯度高 经 - & % ( 验证与人源性. 抗原性一致 可用于 0. 实验作为抗原底物使用 这种基于 0. 的血清测定方法耗时短 全过程不到两天 需要的血清用量很少 每个样本只需要 + 血清 结果可用分光光度计测定并量化 因而适合应用于脑胶质瘤患者的临床检测 本实验表明这种用于血清检测的 0. 方法对于区分高等级脑胶质瘤患者和健康人的效果较明显 我们正在进行更大样本的检验 以期将来能在临床上用于脑胶质瘤患者的血清学诊断与分型 # 等报道. 可用于脑胶质母细胞瘤的血清检测 有文献表明. 水平与肿瘤大小在! 高等级脑胶质瘤中存在正相关 新近研究表明!. 可作为脑外伤的特异性标志物 这些研究都支持了我们的假设 因脑胶质瘤细胞凋亡或坏死过程中释放的. 与浸润的免疫细胞发生免疫反应而产生. 自身抗体 然而 本文的样本量偏小 对于不同等级脑胶质瘤的的特异性未作深究 且对照种类设置单一 文中所述的 0. 检测血清中. 自身抗体水平的方法是否可以应用于低等级脑胶质瘤的诊断 如间变性星形细胞瘤 % 星形细胞瘤 % 其对于脑胶质瘤的特异性如何 是否能够区分脑胶质瘤与其他脑部肿瘤 如垂体瘤 转移瘤 以及. 自身抗体是否会在脑部以外的其他部位肿瘤中表达 这些问题需要收集大量样本后在进一步的实验中加以阐明 参 考 文 献 &% 3 7 % 8 + % '% &, ( &''( & + & " (!$ 1 1#1;9 + %& / %8.8 &3%&. "+ ( (%() % %'),% ( ( +!9 4+! $7 % $% &/ "+<( '% ' * %,/ 2 %') ( ) %'/2 % %& '% ()&& (&& &,% ( ( ' &% '% & /2 1 # +" #$" 0$' 11"4 ;9;;+ 4% 5(& 5$ (& < " + ()( %&)( % (& % %,% ( ( & +) 1"";! ; 0* 2 "+$ '&8 & ' (& % % %,% ' % '% && ( ' & + ;#; ;1 9;14+

5 ;4 复旦学报 医学版 年 月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收稿日期 9!91 编辑 段佳 % & ( & & % )

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