中国临床医学年月第卷第期 )8)$ 节功能的影响本课题组现有的蛋白激酶如酪蛋白激酶蛋白激酶等表达质粒都构建在与 / 相同的载体 ) 质粒上且携带相同的标签这为利用表达标签的优势研究蛋白激酶和 / 的相互作用带来了困难因此本研究将 / 构建到带标签的载

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顿么
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1 )*8)$ 中国临床医学年月第卷第期 2- 论著 -0. 融合蛋白对外显子 * 可变剪接的影响缪世琛屈舒婷陆颖唐啸任梁梁顾建兰南通大学医学院南通摘要目的构建带 * 标签的 / 及其截断体质粒探讨 */ 融合蛋白对外显子可变剪接的影响方法采用 /) 法扩增 / 基因及其各截断体将扩增产物和载体双酶切后回收连接载体和目的片段获得重组质粒在 + 细胞中转染 /* 及其截断体质粒 9 印迹法检测相关蛋白的表达 / 或 / 和迷你基因共转 /) 检测 / 对外显子可变剪接的影响结果成功构建了 /* 全长及各截断体质粒并在 + 细胞中检测到其蛋白表达 */ 融合蛋白可呈剂量依赖性促进的表达或结论 */ 融合蛋白可促进的表达携带 * 标签不影响 / 对外显子可变剪接的促进作用为后续研究奠定了基础关键词反式激活反应结合蛋白蛋白可变剪接阿尔茨海默病文献标志码 -0.* 2**@* * $0080)* $ /$ **0$ * */ *0 * / $ $* /)$$ $ 0*$$ +$* /$$ 9/ /$*0$*0$ $$/)/*$*$$ */$$ +*/ $$* */$* $ /0***$ * $$ / *0$0 $0$ )/0*$ 反式激活反应结合蛋白 $0 / 包含个氨基酸存在于各种神经退行性疾病中包括路易体病皮质基底节变性和阿尔茨海默病 *$ 等 / 含有个高度保守的识别基序 0 和个富含甘氨酸的尾巴其中的主要功能是介导 / 与双单链结合是 / 发挥可变剪接调节作用所必需的蛋白过度磷酸化是的致病机制之一为了探讨 / 对基因剪接以及表达的调节本课题组构建了 )/ 发现其在细胞中过表达后可促进的表达 / 是高度磷酸化的磷蛋白其功能受磷酸化调控本课题组后续须研究哪些蛋白激酶可以磷酸化 / 和可能的磷酸化位点及磷酸化后对 / 调收稿日期接受日期基金项目大学生创新创业计划国家级项目江苏省高校自然科学基金面上项目 8 南通市市级科技计划项目南通大学博士科研启动基金 $ /- $$ +*/0$ 8080 $*0/-$*$ 0 作者简介缪世琛南通大学医学院级临床医学专业本科生 +?? 通信作者 ) $0*+0-

2 中国临床医学年月第卷第期 )*8)$ 节功能的影响本课题组现有的蛋白激酶如酪蛋白激酶蛋白激酶等表达质粒都构建在与 / 相同的载体 ) 质粒上且携带相同的标签这为利用表达标签的优势研究蛋白激酶和 / 的相互作用带来了困难因此本研究将 / 构建到带 * 标签的载体上将 / * 和迷你基因共转染探讨 * 标签肽对 / 蛋白在外显子可变剪接中的作用 * 材料与方法主要材料及试剂细菌细胞和质粒大肠杆菌购自天根生化科技北京有限公司 ) / 质粒购自 20 公司 + 细胞人胚肾细胞和细胞小鼠神经瘤母细胞购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所抗体和其他试剂抗体 + 购自公司抗体购自 0 公司辣根过氧化物酶 / 标记的羊抗鼠羊抗兔 0 抗体购自 8 *. 公司抗 / 抗体购自 ) 公司购自 + 公司连接酶购自 /0 公司 / 聚合酶购自公司质粒小量抽提试剂盒凝胶回收试剂盒购自天根生化科技北京有限公司预染蛋白购自 $ 公司试剂盒 + 培养基胎牛血清购自 0 公司蛋白定量试剂盒和 +). 化学发光试剂盒购自 / 公司 0 购自 * 公司引物由英潍捷基上海贸易有限公司合成培养板及相关细胞实验耗材购自 )0 公司真核表达质粒 / * 的构建根据报道的 / 编码序列 $0? 设计并合成了相应的上下游引物以 )/ 为模板扩增目的基因反应总体系. 含 F 反应缓冲液. 模板 )/ 共 0 上下游引物各../ 聚合酶..$/.. 扩增条件为预变性重复个循环总延伸为琼脂糖凝胶电泳鉴定并用回收试剂盒回收 /) 产物纯化的 /) 产物和的空载质粒分别用限制性核酸内切酶和进行双酶切过夜酶切后电泳鉴定并用凝胶回收试剂盒回收酶切产物将酶切回收后的空载和 / 目的片段按的比例用连接酶. 体系连接过夜全部连接产物转化到感受态细胞涂布于含 0. 的氨苄青霉素的琼脂糖平板上孵箱内倒置培养过夜挑取个单菌落接种于含的.. 液体培养基中培养过夜离心后回收菌体用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒质粒用和双酶切 * 后电泳选取在处有目的条带的克隆进行测序鉴定将经 /$ 比对正确的质粒用于后续实验细胞培养和转染 + 细胞用含 7 胎牛血清的 $$0$+ 培养基细胞用含 7 血清的 + 培养基于 7 )2 培养箱中培养倒置相差显微镜下观察细胞转染前 $ 细胞用 7 的胰蛋白酶消化用不含抗生素的 + 培养基终止反应细胞以 7 的融合度接种于孔细胞培养板中每组个复孔第天细胞覆盖达 7 左右按照 0 操作说明进行转染 * 后处理细胞 9 印迹法测定蛋白表达细胞转染 * 后每孔细胞用.F.$0 于沸水中裂解提取的蛋白用 / 2 蛋白定量试剂盒测定浓度后调整蛋白浓度一致 7 或 7/+ 电泳分离后电转至 / 膜上 7 脱脂牛奶封闭 * 单克隆抗体或 / 抗体孵育过夜用含 7 的洗涤后与辣根过氧化物酶 *$*$/ 标记的二抗室温孵育 * 洗涤次后显影反转录聚合酶链式反应 */) 迷你基因和不同量的 / 或 / 转染至 + 细胞 * 后用抽提试剂盒 2+ 提取总取总 0 加入.$/..20 $. 补适量 +/) 水至总体积. 加入 F 反转录.0)

$AB V 2 0 =2 @A = =I $`2 =. 92. 中国临床医学$年$月第卷第期 /0 / o L $o L 加入 F 8 F \ )ol 以O9R 为模 C结果板用 G L/NR+NI J/ O9R G2 = 8L NS+进行 GA+ 反应检测 0 外显子的可 O9R.. $L8 $B 全长质粒的构建结果图显示$电泳图.$ / L8 / B 质粒构建成功 YRN YNN YAA NRR NYR Y 下游鼠 YRGOJ 引物序列$ NYA NYR YNR NYN AYN RYN YYY RYN NYA YYRYNA NR 上游扩增条件为 NYNNYRRYNAY 下游 $o 预变性L 总延伸 $o $o 共个循环为含 $o L GA+ 产物经. U的琼脂糖凝胶溴化乙锭电泳后分析条带.

/ L8 / B 质粒构建成功 YRN YNN YAA NRR NYR Y 下游鼠 YRGOJ 引物序列$ NYA NYR YNR NYN AYN RYN YYY RYN NYA YYRYNA NR 上游扩增条件为 NYNNYRRYNAY 下游 $o 预变性L 总延伸 $o $o 共个循环为含 $o L GA+ 产物经. U的琼脂糖凝胶溴化乙锭电泳后分析条带.

3 AB V 2 0 = =I $`2 =. 92. 中国临床医学$年$月第卷第期 /0 / o L $o L 加入 F 8 F \ )ol 以O9R 为模 C结果板用 G L/NR+NI J/ O9R G2 = 8L NS+进行 GA+ 反应检测 0 外显子的可 O9R.. $L8 $B 全长质粒的构建结果图显示$电泳图. T7 处有目的片变剪接引物序列为$ YYNYNAARANAAARY NNARR 上游 AAANYY NNN RNY RNY 段测序结果也显示 O9R. / L8 / B 质粒构建成功 YRN YNN YAA NRR NYR Y 下游鼠 YRGOJ 引物序列$ NYA NYR YNR NYN AYN RYN YYY RYN NYA YYRYNA NR 上游扩增条件为 NYNNYRRYNAY 下游 $o 预变性L 总延伸 $o $o 共个循环为含 $o L GA+ 产物经. U的琼脂糖凝胶溴化乙锭电泳后分析条带. H LF 图B )HLFU BEH IF0 ) 全长质粒的酶切鉴定 $ O9R. $$. 各截断体的构建根据蛋白的结构设计并合成各截断体的引物以构建成功的. 过表达或下调对 0 迷你基因可变剪接的影响为验证 O9R. 对 0外 O9R. /L8 为模板扩增目的基因纯化的 GA+ 产物和 O9R. 空载体分别用 80J和 9 )双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定后回显子可变剪接的影响在 JCS?N 细胞中过表达不同量的 O9R. /L8 同时收酶切产物将酶切后的 O9R. 和各 / 共转 0迷你基因 / $B后 +N GA+ 检测 0外显子的可变剪接产物W 印迹法检测后挑斑摇菌提取质粒酶切鉴定后测序 L8 的表达结果显示$ 促进 0外显子的编码促进作用呈剂量依赖性图. )统计学处理采用 /NRNR. 软件对样本数据进行单因素方差分析数据以b表示检验进一步的验证实验结果显示$ R 促进 0 外显子的表达下调表达后则水准为. 作用相反图*. 或. 截断体的片段在o连接转化通过 RL选择培养图C过表达或下调 EH IF对 + -迷你基因 N VN BO可变剪接的影响 O9R. /L8 和 / )/ 共转染至 JCS $)?N 细胞B后 +N GA+W 印迹结果及定量分析 *$ R$不同剂量或转染至 9$细胞B后 +N GA+ 结果及定量分析... $+-

中国临床医学年月第卷第期 )*8)$ / 及其各截断体质粒的构建和表达 /* 全长质粒为模板 /) 扩增获取目的片段双酶切图鉴定及公司测序鉴定结果显示 / 系列截断体构建成功将 /* 及各截断体质粒转染至 + 细胞 * 后 9 印迹结果图显示除缺失核定位信号的个质粒 / 外其余质粒均在相应的相对分子质量附近有蛋白表达图.0-0.

4 中国临床医学年月第卷第期 )*8)$ / 及其各截断体质粒的构建和表达 /* 全长质粒为模板 /) 扩增获取目的片段双酶切图鉴定及公司测序鉴定结果显示 / 系列截断体构建成功将 /* 及各截断体质粒转染至 + 细胞 * 后 9 印迹结果图显示除缺失核定位信号的个质粒 / 外其余质粒均在相应的相对分子质量附近有蛋白表达图.0-0. 各截断体的酶切鉴定和表达 / 各截断体用和于酶切 * 后电泳结果 + 细胞中转染 / 及各截断体质粒 * 后 9 印迹结果 /// //// /// //. 讨论是老年人常见的神经变性疾病的病因及发病机制尚未明确特征性病理改变为淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和异常过度磷酸化的蛋白聚集形成的神经细胞内神经元纤维缠结 8* 等研究发现 7 患者的神经元内含有 / 提出 / 可能是与发病相关的第种蛋白质 / 是一种和结合蛋白参与的稳定转录剪接加工的生物合成细胞凋亡细胞分裂神经元完整性和可塑性等的调节 / 异常聚集与肌肉萎缩性侧索硬化症渐冻症有关并在的进展中扮演着重要角色 / 在病理进程中的作用机制目前尚不清楚高度保守的核蛋白家族参与体外前体剪接位点的选择其中 ) 等参与外显子可变剪接的调节本课题组最近研究结果发现 )/ 可以促进的表达本研究成功构建了 /* 质粒与迷你基因共转后发现 / 呈剂量依赖性地促进的表达下调 / 则抑制的表达该结果证明携带不同的标签肽不影响 / 对外显子可变剪接的促进作用 / 蛋白全长分子中含有多个丝氨酸苏氨酸和酪氨酸位点其中有多个潜在的磷酸化位点 /* 软件分析结果文献报道酪蛋白激酶可磷酸化 / 促进 / 在细胞内的聚集为进一步研究蛋白激酶对 / 的磷酸化及磷酸化对 / 功能的影响后续实验将把构建在载体上带 * 标签的 / 全长或各截断体质粒和构建在 ) 载体上带标签的酪蛋白激酶蛋白激酶等蛋白激酶质粒共转入细胞表达观察哪些蛋白激酶可以磷酸化 / 及各结构域在等神经退行性病变中作用的分子机制以期为神经退行性疾病的防治提供分子生物学依据参考文献 ++22) / $ * *0 *$$$ *.$8 2 )$0*0 *$$$0 **88* / 000$*$8 $0 /0 0 **0 *88)* )+)82.0 $ *0 *$8 889)/$$ 0$$ *$$ *$* 8

5 )*8)$ 中国临床医学年月第卷第期 82+/ /*$* *$8* 8 2 )$$0 0 0$ * 0 )$8 $ 8 8 **0$ $ 0* $ 88)* + 2 $ ** /8**) 2 /** $0 / $ $ 00 $ /88)* 本文编辑姬静芳

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽