中国生物工程杂志! 公司 2;3 和 $ 购自 ',5 公司 92$' 底物显色液购自天根公司 92 标记的二抗山羊抗鼠 3 购自中杉生物有限公司质粒抽提试剂盒纯化试剂盒购自 '3 公司引物合成和测序均在军事医学科学院生物工程研究所六室完成个 1 单抗均为本课题组自制 & 包被液 ",<6.

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绶范
5 years ago
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1 中国生物工程杂志! "# 幽门螺杆菌 1 串联融合表位的表面呈现表达封小燕王艳春李平超陶好霞王秡袁盛凌王令春王普刘纯杰浙江工业大学药学院杭州军事医学科学院生物工程研究所病原微生物与生物安全国家重点实验室北京 & 摘要目的应用表达载体. 表面呈现表达幽门螺杆菌 1 串联融合表位方法通过引入多克隆位点的方法改造表达呈现表达载体. 并用改造后的质粒表达幽门螺杆菌 1 串联融合表位用 $2'345 + 和全菌 6' 检测所得到的重组菌结果改造的质粒插入序列正确能够特异性呈现表达 1 串联融合表位表达产物的分子量约为 7 与预期大小一致全菌 6' 结果表明 1 串联融合表位表达于菌体表面结论. 载体能够表面展示呈现 1 串联融合表位构建的重组菌为幽门螺杆菌候选疫苗的研发奠定了基础关键词表面展示. 串联表位中图分类号 8!# 幽门螺杆菌是一种螺旋状具鞭毛微需氧的革兰氏阴性杆菌 #! 年首次由 9+ 4 和 :5 分离培养成功感染是慢性活动性胃炎胃溃疡十二指肠溃疡的主要病因的持续性感染还与胃腺癌 5 0, 和胃淋巴瘤 5,., 的发生密切相关被世界卫生组织列为类致癌因子 ;. 尿素酶是感染的一个重要因子是定居所必需的因素同时它又是毒力因子在致病机制中起着重要的作用尿素酶是疫苗研究中一种重要的蛋白质被视为最有前途的疫苗候选抗原在本实验室前期工作人员做了幽门螺杆菌尿素酶抗原表位的鉴定通过单克隆抗体筛选到个表位抗原为的诊断治疗和疫苗开发奠定了基础微生物细胞表面展示系统首先是由 3 在世纪! 年代中期开发的此后人们进行了大量研究细菌表面展示系统是微生物表面展示系统的一个重要分收稿日期 $ $ 修回日期 $%$& 十一五国家科技支撑计划项目!' 十一五国家艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治重大专项!% " 资助项目共同第一作者通讯作者电子信箱 () *+,** -. ) /(* 0* 支即外源肽或蛋白与细菌表面特定蛋白融合并呈现表达于其表面其表面展示载体呈多样性是近年来发展起来的一种新技术近年来其应用已扩展到重组菌疫苗多肽库筛选全细胞催化剂以及作为诊断的细胞固相试剂等多个领域 % 细菌表面呈现抗原在疫苗设计方面具有独特的优势在细菌表面展示的蛋白更易被免疫系统识别细菌的外膜蛋白脂多糖和分泌的毒素具有强免疫原性可以作为所呈现外源蛋白的免疫佐剂 " 根据文献报道大肠杆菌外膜蛋白 ' 能允许较大的外源基因片段插入并表达本实验以 ' 为呈现表达的锚定蛋白构建了. 表面展示载体使实验室前期工作获得的个幽门螺杆菌串联表位基因在质粒. 上进行表面呈现表达为相关串联表位疫苗的研究打下了基础材料与方法材料质粒和菌株大肠杆菌 "; 载体购自全式金公司质粒. 由 5/ 教授赠送表位基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成工具酶和试剂限制性内切酶 ;% ' 连接酶购自,5 公司 : 经科宏达生物技术有限公司. 酶 ; ' 聚合酶 0;2 及其它 29 相关试剂购自全式金公司氨苄青霉素卡那霉素购自 :7

2 中国生物工程杂志! 公司 2;3 和 $ 购自 ',5 公司 92$' 底物显色液购自天根公司 92 标记的二抗山羊抗鼠 3 购自中杉生物有限公司质粒抽提试剂盒纯化试剂盒购自 '3 公司引物合成和测序均在军事医学科学院生物工程研究所六室完成个 1 单抗均为本课题组自制 & 包被液 ",<6.# 的碳酸缓冲液洗涤液. &% 2$;-$ "= 封闭液 "= 的脱脂奶粉底物溶液 ;: 底物显色液天根公司终止液,<6 的 > % 方法质粒. 的构建以质粒. 为模板设计引物扩增其多克隆位点上下游两个片段同时分别引入一个酶切位点 29 片段分别经?0 及 0?!9 双酶切后纯化回收并与和!9 双酶切的载体进行连接后转化 " 得到的重组质粒经酶切和测序鉴定两个片段基因的引物如表表基因的引物!" 2, ;;;;;'';3333;;.9 ''3;; ""##$%$$%""##33';;3;''3';;3'3'3;3 0? ''3;; ""##"##%#""##3;3'';'3';;;3';; 0? 9 3'3;3'';;';;'3'''33!9 1 串联表位原核表达载体的构建所选个表位为实验前期工作鉴定得到分别位于尿素酶亚单位 1 上第 "! A&! A #" %# A 位氨基酸残基根据其相应的编码序列设计两个 7 将个表位串联起来再用一个 7 连接个表位串联成为双拷贝的编码片段并在两端各加入与载体相对应的的酶切位点进行基因序列全合成. 也由酶切切胶回收大片段与同样双酶切的融合表位片段基因连接后转化 " 构建重组菌通过 29 扩增酶切和测序鉴定重组菌的诱导和表达将鉴定正确的重组菌接种到 ", 含有 " <, 卡那霉素 6 培养基中于 & B" <, 振荡培养过夜以 = 的接种量转接到新鲜 ", 的含有 " <, 卡那霉素 6 培养基中 & B" <, 振荡培养加入终浓度为,,<62;3 诱导培养 % 同时以含有空载体的重组菌作为对照 %$2'3 及 45 + 分析取诱导后和未诱导的菌液各, 离心弃上清用 2 洗涤两次再用 2 重悬加入 C 上样缓冲液沸水煮 ", 离心取上清获得上样样品然后进行 = $2'3 蛋白凝胶电泳具体步骤参照分子克隆电泳后凝胶用考马斯亮蓝 9$" 染色, 脱色液脱色分析实验结果在 $2'3 分析的基础上进行免疫印迹分析并用湿电转移法将凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维素膜上转印好的硝酸纤维素膜用 "= 的脱脂奶粉封闭然后用单克隆抗体作为一抗 D 稀释室温孵育用洗涤液洗次每次 ", 辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠 3 为二抗 D" 稀释室温孵育用洗涤液洗次每次 ", 用 92$' 底物显色液显色 " 全菌 6' 检测取空载体菌诱导的重组菌未诱导的重组菌将 &' 值调整至用 2 洗涤两次用 ",<6. # 的碳酸缓冲液 &B 包被 "= 的脱脂奶粉 &B 封闭用洗涤液洗次每次 ", 用 1 单克隆抗体作为一抗 D 稀释 & B 孵育用洗涤液洗次每次 ", 辣根过氧化物酶标的山羊抗鼠 3 为二抗 D" 稀释室温孵育再次用洗涤液洗次每次 ", 沥干后加入 ;: 显色底物溶液 < 孔置 &B 显色 " A, 用,<6 > % < 孔终止反应在酶标仪上测定 %", 处各反应孔的 &' 值记录结果结果与分析 #$%&' 的构建. 构建的大致过程如图所示将 29 扩增得到和的片段连 ; 载体经过 29 鉴定酶切鉴定测序结果与预期大小一致切胶回收片段用于载体改造. 质粒双酶切去除基因后的片段与和连接后转化 " 得到目标载体. 双酶切鉴定质粒. 的上游片段约 +. 图及下游片段约 #"+. 图 + 测序鉴定也表明目标片段序列完全正确

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的相对分子量基本一致同样 45 + 分析也表明图 " 重组蛋白能够分别与表位的个单克隆抗体 ' 图重组菌表达产物

3 ! 封小燕等幽门螺杆菌 1 串联融合表位的表面呈现表达 & 图 #$%&' 构建的示意图 () )(#" *( 图 ' 重组质粒酶切与 + 扩增鉴定. 串联表位基因电泳图 '+(," +)( # : ',7. $ # ' 发生作用这就充分表明利用质粒. 作为载体成功地表达了 1 蛋白图 #$%&' 的双酶切鉴定电泳图 +(,") #$%&'( # :', ! 串联融合表位原核表达载体的构建设计合成的表位基因为!#+. 经测序鉴定合成结果正确片段连接到. 得到表达质粒. $.. 重组菌用 29 鉴定扩出了约 %+. 目的条带酶切也能产生大约 %+. 目的片段图测序结果与预期大小一致 '/0/1& 及分析重组菌蛋白诱导后表达情况 $2'3 结果表明经过诱导产生的重组菌蛋白在 7 处有一条明显的条带图 % 所示蛋白大小为 " 7 目的蛋白约为 & 7 与预测的 7 的相对分子量基本一致同样 45 + 分析也表明图 " 重组蛋白能够分别与表位的个单克隆抗体 ' 图重组菌表达产物 /0/1& 分析 /0/1&")!# #( )( 9, ;3 9,+5%.5, ;3 图重组菌表达产物鉴定 ")( 9,+5 5E %9, ;3:'+ ' ,+0 :'+ # ,+0%:'+ ' ,+0

4 ! 中国生物工程杂志! &2%/ 分析全菌 6' 的实验结果如图可以看出分别以个单抗 ' ' 和 # 作为一抗对得到的重组菌株进行检测时重组菌与空载体及未诱导的重组菌 2< 比值都是大于说明重组菌能表达产生特异性抗原也就表明 1 串联表位融合蛋白能表达到菌体表面一抗图 3 全菌 &2%/ 分析 3&2%/")!##( ( ' 讨论表面呈现是近年来发展起来的一种新技术将外源肽或蛋白与细菌表面特定蛋白融合并呈现表达于其表面表面呈现技术在外源肽库筛选和重组疫苗菌研究中具有独特的优点及潜力! 表面展示中最普遍常用的载体蛋白是外膜蛋白 >:25 6, >,.' 和 ' #$ % 类外膜蛋白可以和外源基因组文库的随机片段相配合而不影响它的结构及生物学功能适用于基因文库的筛选在这 % 个外膜蛋白中 ' 外膜蛋白比其它个蛋白有很大的优势它能接受大到 %# 氨基酸表面展示能力很稳定表达的外膜蛋白也不易降解能很好地将外膜蛋白展示在表面 ' 外膜蛋白是以桶结构横跨外膜桶结构由反向平行的折叠片所构成并通过周质间隙中的短环和细胞外部的长环相连接外部的环状结构保守性较差能够容忍一定程度的改造如取代插入及剔除等这些外部的长环结构可用于外源蛋白的展示外膜蛋白 ' 长环结构环 % 环 " 空间构象能最大地伸展在外质空间中能较好地将外源蛋白充分展示出来尿素酶是幽门螺杆菌一个重要的致病因子所以寻找鉴定其有效的抗原表位对于的诊断治疗和疫苗开发具有重要的意义本实验将已鉴定得到的个表位进行串联表位表达利用这个外膜蛋白表面展示的平台在! 中能表达 1 串联表位通过 6' 检测 $2'3 及 45 + 分析该实验中的 1 串联表位得到了特异性表达表达产物的分子量约为 7 与预期大小一致证明了串联有个表位均得到了表达幽门螺杆菌 1 串联融合表位的表面呈现表达呈现于细菌表面后使其有利于免疫后机体的抗原提呈细胞对抗原的识别和加工提呈幽门螺杆菌 1 串联融合的个表位能加大其免疫保护的范围增强通用性恰当的抗原表位既可激发保护性免疫应答又可以避免潜在的副反应本研究的工作为后续的疫苗研究提供了很好的基础参考文献 '9473. E 9575,5*(0 *6 40 >/ ' 95 ##%$&"* 8 4 *; *0 $ /+05*! "$"&* * * '0E#$ * %, ' *5..5 +* ##$"%* " 刘向昕展德文 * 细菌表面展示技术的应用研究进展 * 微生物免疫学进展 " &$&%* 6 4*25 :+0,, " &$&%* / : 7 *..5$ E *! #%$# "* & 陶好霞刘向昕张兆山等 * 幽门螺杆菌尿素酶单克隆抗体的制备与鉴定 * 生物技术通迅 &!%$%!* ; 6 *65 &!%$%!*! 90 :/:*05..5+,$ E+5.5*:+ " $"* # 069,54*6,5,.5 3$+00,5. '5! *:3 3## #$!&$#* 09*5..05$5$.50 5! >,.'. 05-.

5 ! 封小燕等幽门螺杆菌 1 串联融合表位的表面呈现表达 # 0,,+5,+*3#!#!#$ * 6. ;4 ;3 ' *5! ,,+* ##"&&!$!#* 6 :+$505.*;05 %"$"* 5 ; 3+ ' *0 ',$E;5 0 E., +5'525* 3030* 3,52,50 5* 5 0*0 4?5%* $% * /)(0#" &#)-.&## 3$ 4'3$ 62$ ;'>$ 4'32 1'$ 4'36$ 4'32 61$( 2,(1E5;/ ( (& ( >+(E ;E505.) 5..+E. * :05: )5...*;,+5-5,0 +$2' '*95; ,0-5*;, E0 +$2' ' *5 ; !" E*;55-+E5 4" )5..

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽