期 李 静等 马疱疹病毒 型 & 糖蛋白线性 细胞表位的预测与鉴定 马疱疹病毒 属于疱疹病毒科 疱疹病毒亚科 病毒具有 线性双链基因组 分别编码 感染可导致马的多种临床症状 如呼吸道疾 病 流产 新生胎儿死亡及神经系统疾病 自然感染的获得性免疫或疫苗接

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1 中国畜牧兽医! " 马疱疹病毒 型 糖蛋白线性 细胞表位的预测与鉴定 李 静 刘建华 付 强 宋焕堂 范 斌 胡 月 冉多良 新疆农业大学动物医学学院 乌鲁木齐 摘 要 试验旨在应用生物信息学技术综合分析马疱疹病毒 糖蛋白 预测 细胞表位 筛选出具有潜在诊断价值的线性 细胞表位 糖蛋白的基因序列输入 =+' 软件中的 '! 工作区中 经参数综合比较分析筛选潜在的 细胞表位 克隆 表达预测表位的基因片段 利用表达的融合蛋白作为抗原与马疱疹病毒阳性血清反应 经预测分析 & 糖蛋白的 细胞表位可能位于第 ) 和 位氨基酸区域 本试验成功构建并原核表达含 个潜在 细胞表位的融合蛋白 <!,'! -'& 试验结果显示 其中 个融合蛋白能被马疱疹病毒阳性血清识别 本试验利用生物信息学技术结合分子生物学技术成功筛选到 个潜在的 细胞表位 表位诊断 表位疫苗抗原的设计奠定了技术基础 关键词 细胞表位 抗原表位预测 原核表达 鉴定中图分类号 +A > 文献标识码 文章编号 (&&&4&--&! -&&&-&!!-& &4%4 /&+ '&4!=-&!"!()!( ")!%!,':,"!'!'!-!'!,&&-'!!!%!!,, "',,!-!'!'!,:%%%'!'-&,'-! %!=&"!',&&-'!:!!!'! '!=+',':!+!! &'!'-!-!'!,'!"!'!",'%!'&!'!-!'!,:!!,!-!'! -!!!,,!%!!!,,!,'!,,!!,'&! :!!,!'!' :'%!!%!!,,,'!,!" ',!!!''&!!'!,%!!,-',,%:!'%'&'!'!-,,'%!!,""'' '')'''"&%'!&&-'!!-!'!, +!!!'!,:!!,!,,--!''!!,,!'"! =,!!&'!!!,,'<!,'! -'& :,!"!'!'!' '%!'&!:%%-!!&!!!%!!,,,'!,!"','!% -& "-!- -&'!%!, :!!,!',!,,-,!!!'!'-!-!'!,:%%!'%!''%!&,,@!,&'%!!'!! &+!!-!'!'&!!'!!''!!,,!'' 收稿日期 ) 基金项目 国家科技支撑计划项目 = 作者简介 李 静 )) 女 新疆奇台人 硕士 研究方向 动物传染病诊断与防治 "-,%" 通信作者 冉多良 ) 男 新疆沙湾人 教授 博士生导师 研究方向 动物传染病诊断与防治 "--"

2 期 李 静等 马疱疹病毒 型 & 糖蛋白线性 细胞表位的预测与鉴定 马疱疹病毒 属于疱疹病毒科 疱疹病毒亚科 病毒具有 线性双链基因组 分别编码 感染可导致马的多种临床症状 如呼吸道疾 病 流产 新生胎儿死亡及神经系统疾病 自然感染的获得性免疫或疫苗接种诱导的 获得性免疫通常是短暂的 马匹仍可重复感染 糖蛋白 &-'!& 是 编码的 型跨膜糖蛋白 是疱疹病毒家族中高度保守的 类融合蛋白 主要参与病毒感染过程中病毒侵入和细胞间传播 激活体液免疫产生病毒特异性抗体 还能激活 细胞免疫 具备作为亚单位疫苗的 潜力 研究报道称缺失 & 丧失对小鼠的致病力 但可诱发针对攻毒感染的保护力 & 糖蛋白不仅能在老鼠体内诱发细胞免疫和体液免疫 且可加速攻毒后病毒在肺脏的清除 并能降低马驹 的病毒血症 的诊断在马疱疹病毒防制中有重要的作用 的防制措施的实施 流行区的感染率明显下降 常规的免疫学检测方法多为检测阳性血清 成分复杂且成本较高 同时 由于 & 糖蛋白分子质量大 制备表达并保持该蛋白的天然构象 较困难 因此 可选择该蛋白表位作为研究对象 本研究利用生物信息学综合预测 细胞表位 将预测的表位合成 表达及纯化 阳性血清所识别 为进一步表位疫苗的设计和新型诊断试剂的研发奠定基础 材料与方法, 材料 主要试剂 = 连接酶 限制性内切酶 % 和 均购自宝生物工程 大连 有 限公司 广谱蛋白质! 购自康为世纪生物科技有限公司 预染蛋白质! 购自 公司 质粒抽提试剂盒和 = 凝胶回收试剂盒均购自 "!& 公司!-&!= -&, 购自碧云天生物技术 辣根过氧化物酶标记的兔抗马 & 购自北京博奥森生物技术有限公司 聚丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 膜 胰蛋白胨 酵母粉 琼脂糖等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司 质粒 菌株与血清 质粒 大肠杆菌 = 和,!' 感受态细胞 &= 阳性质粒均为新疆农业大学动医学院传染病实验室保存 马疱疹病毒阳性混合血清采自新疆伊犁地区 均经 + 准确检测 生物信息学分析软件 采用 =+' 软件中的 '! 进行序列分析, 方法 & 糖蛋白序列 中扩增所得 与! 比对 同源性为 表位预测筛选 根据 =+' 糖蛋白的扩增序列输入工作区 得出二级结构图 根据其亲水性 表面可及性 柔韧性 抗原性等参数从候选分子中选择综合抗原指数较强的表位 设计合成候选表位 根据预测分析得到的表位碱基序列设计互补的寡聚核苷酸正 反义链 分别在其上 下游引入限制性内切酶 % 和 的酶切位点 并在 % 后加 起始密码子 在正链 B 端 酶切位点前加 终止密码子 寡聚核苷酸序列见表 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成

3 中 国 畜 牧 兽 医 卷 表 根据预测的 细胞表位合成的寡聚核苷酸链 )&&&!%&!! %&-& &&--&! 名称 寡聚核苷酸序列 长度 "! -&-!'!,,!!!BB!&'% & & & & & & & ) & & & & & & & 基因表达载体的构建 寡聚核苷酸双链的形成 参照! -&!= -&, 说明书将寡聚核苷酸退火成双链 并使用灭菌的重蒸水稀释成 "- 取 -!,!!! 退火缓冲液 取互补的寡核苷酸链各 终体积 置于 仪中 ) D 孵育 " 后 每秒下降 D 降至 D 置于 ( D 保存 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳判断退火效果 重组质粒构建 使用 % 和 酶切原核表达载体 电泳并回收酶切后载体 取 退火后的寡核苷酸双链和 酶切的 载体 分别加入 连接缓冲液和 连接酶 置于 D 孵育过夜 取 连接产物转化 大肠杆菌 = 感受态细胞 D 过夜培养 挑取单克隆菌落接种于 " 液体培养基中 卡那霉素终浓度为 &" D 培养过夜 使用质粒抽提试剂盒提取质粒 = 同时将重组质粒送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序 融合蛋白的诱导表达 将重组质粒转化入大肠杆菌,!' 中 挑取单菌落接种于 " 液体培养基中 卡那霉素终浓度为 &" D 培养过夜 按照 C 转种 继续培养至 " 值为 加入终浓度为 ""- D 培养 % 离心收集细菌 取 " 菌液离心后加入 + 和 +=+ 上样缓冲液混匀 沸水孵育 " 取 蛋白液加样并使用 +=+ 检测融合蛋白的表达情况 表位重组融合蛋白的纯化 经 +=+ 电泳后 弃上层胶 用 "-?- 处理 " 目的蛋白显银白色 直接切下来 使用预冷的 + 清洗 次至完全脱色 置于液氮罐 " 用液氮碾碎胶块 加适量的无菌 + 完全溶解 ( D 保存 抗原性检测 取 纯化过的重组融合蛋白分别进行 +=+ 电泳 膜 使用脱脂乳在 D 条件下封闭过夜 然后加入脱脂乳 C 阳性血清 D 孵育 %+ 洗膜 次 加 C 稀释的兔抗马 & D 孵育 % 后洗膜 次 加入 = 显色液 " 使用蒸馏水终止反应 观察结果 结 果, 细胞表位预测结果 =+' 软件中的 '! 糖蛋白的亲水性 %-'-'?'!=-'-! 抗原性 '&!!"!,<- 内部柔性

4 ! 期 李! 静等马疱疹病毒 % 型 糖蛋白线性 细胞表位的预测与鉴定 结构 " \ F > -D!cM SD!C,7S Y'表 面 可 及 性" CS Z M, = M!L4 和 蛋 白 质 的 二 N= 级结构综合分析预测!结 果见 图 %& 由 图 % 可 知!从 %)H/ -' -(' / 糖 蛋 白 中 获 得 第 (-%&' AH' %%%-%&' %-%(( 和 %/-%H& 位 氨 基 酸 区 域 构成的 / 个 细胞表位!分别命名为 %/& 图!J_QR?) 糖蛋白 ) 细胞表位预测 <!@ +,+ -) + + -J_QR? + +,)?D!D!! 原核表达载体的构建 互补 的 单 链 寡 聚 核 苷 酸 经 退 火 后 合 成 双 链!用 双链成功合成&将退火的 / 对寡聚核苷酸双链分别 %? 非变性聚丙烯 酰 氨 凝 胶 电 泳 进 行 检 测!结 果 见 图 &由图 可知!单链明显快 于 退 火 形 成 的 双 链! 经测序分析!测 序 结 果 与 设 计 的 api 序 列 完 全 一 克隆至原核表达载 体 LW! &M 中!得 到 的 重 组 质 粒 致!表明表达载体构建成功& <! &api QM"" " an= SD( %!!! % 寡核苷酸正义链( % 寡核苷酸反义链( % 退火形成的双链 (! <!& api QM"" " an= SD(%!C-D S, " % I D D "%(!as -S,,7M -D Z%M Z M-- M - 图!! 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 <!!P : + -,+, R, :,?+ /? +7+?D

5 中 国 畜 牧 兽 医 卷,/ 融合蛋白的表达与纯化 个表位融合蛋白均能表达 融合蛋白存在于上 清和包涵体中 但大部分存在于包涵体 图 且切胶纯化后大小都在 左右 图 与预期一致 蛋白质分子质量标准 & 诱导表达后上清 & 诱导表达后沉淀 纯化后 & 包涵体 '!!+!''&'!'!''&'!' -,,&'!' 图 / 重组质粒融合蛋白的表达与纯化,/-&!-&)!-& 蛋白质分子质量标准 && '!!&'& 图 融合蛋白纯化分析,(!!!-&!, 融合蛋白的抗原性鉴定 经 <!,'! -'& 分析 重组融合蛋白 & & 中 &&&& 和 & 均能被马疱疹病 毒阳性血清特异性识别 而 && 目的蛋白与马疱疹病毒阳性血清均无反应 图 因此 & &&& 和 & 具有潜在的 细胞表位

6 期 李 静等 马疱疹病毒 型 & 糖蛋白线性 细胞表位的预测与鉴定 ) 蛋白质分子质量标准 阳性对照 &= 阳性质粒 && '!!,'!'--,"&=&'& 图 纯化的表位融合蛋白的 &!&) 分析,&!&)!!%&-&!-&&--& / 讨 论目前 免疫诊断试剂盒 关键问题在于制备并保持蛋白的天然构象较难 且较难获得纯度高且免疫反应性强的检测抗原 同时随着疫苗的出现 感染区阳性率由 降至 降低了疾病的感染率 随着科学的进步和发展 传统的疫苗已不能满足现在的需要 制备新型且有效的疫苗是亟待解决的问题 在免疫应答中 表位是指抗原分子中能被抗体或受体识别的特定氨基酸区域 以前多称为抗原决定簇 是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基 团 根据受体细胞的不同可分为 细胞表位和 细胞表位 细胞表位通常由 个氨基酸组成 细胞表位预测研究主要还是以线性 细胞表 位预测为主 的致病机理尚不完全清楚 研究发现 & 能黏附宿主细胞并诱导病毒进入细胞 该 蛋白在病毒侵袭细胞黏附的过程中有重要作用 本研究中 利用 =+' 软件对 & 糖蛋白的亲水性 抗原性 内部柔性结构 表面可及性和蛋白质的 ) 二级结构综合分析预测 并从中筛选获得了 个具有潜在 细胞表位的片段 合成相应的寡核苷酸链 克隆至表达载体 通过诱导表达及纯化获得 个分子质量大小约 的表位融合蛋白 进行抗原性的鉴定 结果显示其中 个目的蛋白可被抗马疱疹病毒阳性血清识别 的诊断和新型表位疫苗的研制奠定了基础 近些年来 在 细胞表位的预测方面主要还是 以软件为主 软件算法和程序只是基于氨基酸残基结构的连续性 因而 运用软件预测所得到的表位还需经过分子生物学进一步筛选并得到具有特异性表位的片段 本研究采用生物信息学综合预测技术和分子生物学技术及免疫学技术相结合的办法筛选线性 细胞表位减少了一定的盲目性 并提高了准确性 相比较传统的 + 方法的建立和检测节省了 时间并降低了经济成本 结 论本试验通过生物信息学和分子生物学相结合 成功筛选到 个具有潜在 细胞表位的基因片段 分别为 &&&& 和 & 为后续新型表位疫苗的设计和诊断方法的建立奠定了基础 参考文献 杨夷平 刘建华 冉多良 等 马疱疹病毒 型 检测方法的建立 中国畜牧兽医 ) %" %?'+!'-% '!'&-'!,!!%!!,,!" -!! +!'--!- %'!'-!%!!,,'!,',,!!'%&!' "!, % " +<!! =!%!'-%!!,,'!''!,-'!-!',&+! '+-,<-!'-"'!-

7 ) 中 国 畜 牧 兽 医 卷,,&-'! &!!%!!,,'! '',",,) ',=<%'!,!'-" -!-"-!"!''!!-,'%'&-'!,& && %!!,,"-!,'!', :'%!%'%!&!-,&! ( '! <-!!@!'-!' ''%!!!-!,!&-'!,!! %!!,,'!) -+,!'+!'-,&,''!',''-!:'%! %!!,,!' "%!" )) )!!! "!'-! %!!,,"'',!&-'!!'%&!"! '!'!'&,' %-!&!!'))) 李 娜 马疱疹病毒 型 % 双基因原核表达蛋白免疫效果研究以及新疆部分地区马鼻肺炎血清流行病学调查 = 乌鲁木齐 新疆农业大学 时成龙 侯玉杰 相文华 等 马鼻肺炎病毒主要糖蛋白及其功能 动物医学展 ) )) +%7!'-!'' -!!-!'!,:'%'%-"'% "',&! )) 萨姆布鲁克 拉塞尔 = < 黄培堂译 分子克隆实验指南 第 版 北京 科学技术出版社 李 娜 孙建华 石 明 等 新疆部分地区马鼻肺炎的血清学调查 动物医学进展 ) 沙 燕 孙建华 杜润慈 等 新疆伊犁地区部分马病血清学调查 畜牧与兽医 )) 马凡舒 张 蕾 王 洋 等 细胞抗原表位预测方法的研究进展 中国畜牧兽医 宋 帅 李春玲 贾爱卿 等 抗原表位研究方法进展 动物医学进展 ) 董娇娇 刘子钰 刘春宇 等 线性 细胞表位预测应用研究 计算机光盘软件与应用 ) 文雪霞 陈化兰 熊永忠 等 抗原表位鉴定方法的研究进展 中国畜牧兽医 ) 宋焕堂 孙建华 杜润慈 等 马疱疹病毒抗体间接 + 检测方法的建立 畜牧与兽医 责任编辑 董晓云

材料 方法

材料 方法 生物技术通报 张发洲 杨慧兰 为了构建单纯疱疹病毒 型 感染细胞多肽 真核表达质粒 应用 技术从 株 的基因组中扩增 基因 并连接至真核表达载体 对阳性克隆进行菌落 酶切和测序鉴定后 成功构建了重 组质粒 用 转染试剂盒将重组质粒 转染至 细胞中 并用 及 检测其表达情况 结果显示 基因在 细胞中得到正确表达 真核表达质粒 的构建成功 为进 一步研究 对宿主细胞的影响奠定了基础 单纯疱疹病毒 型 感染细胞多肽

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