第 4 期邱果等 : 抗 HCMVPp65 蛋白单克隆抗体的制备及性质研究 339 werescreenedandtheantibodytitersweredeterminedbyindirectelisa.andthenthemonoclonalantibodyspecificity forhcm

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潢溥孙
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1 第 23 卷第 4 期 2014 年 8 月激光生物学报 ACTA LASER BIOLOGY SINICA Vol.23No.4 Aug.2014 doi: /j.isn 抗 HCMVPp65 蛋白单克隆抗体的制备及性质研究邱果 ab, 许凤 a, 邱义兰 a, 廖晶 b, 李烨 a, 刘胜姿 b, 李桑 a b, 刘如石 ( 湖南师范大学 a. 生命科学学院 ;b. 医学院, 湖南长沙 ) 摘要 : 人类巨细胞病毒 (Humancytomegalovirus,HCMV) 是一种机会性感染疱疹病毒, 在人群中感染比较常见, 但在免疫缺陷个体与新生儿中可引起严重的疾病 HCMVPp65 是 HCMV 活动感染的主要标志, 也是临床检验检测 HCMV 感染的重要靶标为研发抗 HCMVPp65 蛋白单克隆抗体作为临床免疫检测 HCMV 感染的关键原料, 本研究采用重组表达的 HCMVPp65 蛋白免疫 BALB/c 小鼠, 将免疫小鼠淋巴结细胞与 sp2/0 细胞融合, 采用间接 ELISA 法筛选阳性克隆与效价测定, 再用 Westernbloting 进行抗体特异性鉴定, 最后用免疫捕获 PCR 和免疫荧光法评价其应用前景最终获得了 1 株能稳定分泌高效价的抗 HCMVPp65 单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 命名为 8D6 Westernbloting 及间接 ELISA 检测其效价分别达和 ; 细胞免疫荧光与免疫捕获 PCR 实验结果说明, 该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有良好的亲和力和特异性, 具有作为外周血细胞免疫荧光细胞化学和免疫捕获 PCR 检测 HCMV 临床感染的关键原料, 也可作为双抗体夹心法检测 HCMV 临床感染的关键原料, 为建立 HCMV 感染快速灵敏的临床诊断试剂打下了重要的基础关键词 : 人巨细胞病毒 ;Pp65 蛋白 ; 杂交瘤细胞 ; 单克隆抗体中图分类号 :R392 文献标识码 :A 文章编号 : (2014) PreparationandCharacterizationofMonoclonalAntibodies againsthcmv Pp65Protein QIUGuo ab,xufeng a,qiuyilan a,liaominjing b,liye a,liushengzi b,lisang a,liurushi b (HunanNormalUniversity a.colegeoflifescience;b.medicalcolege,changsha410013,hunan,china) Abstract:Humancytomegalovirus(HCMV)isakindofopportunisticinfectionofherpesvirus,andacommoninfec tionamongpeople,whichcancauseseverediseaseinimmunodeficiencyindividualsandneonates.pp65proteinisthe mainbiomarkerandimportanttargetforclinicaldetectionofactivehcmvinfection.todevelopthekeyrawmaterialfor immunologicaldetectionofhcmvinfection,therecombinantexpresionofhcmvpp65proteinwereusedtoimmunize BALB/cmice,andthelymphnodecelsofimmunizedmicewerefusedwithsp2/0cels.Firstofal,thepositiveclones 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (No ); 湖南省科技计划重点项目 (No.2011SK2014); 长沙市科技计划重点项目 (No.K ); 湖南省自然科学基金重点项目 (12J2013); 湖南省科技计划项目 (2013SK3129); 湖南省高等学校科学研究项目 (No.10B060) 作者简介 : 邱果 (1987- ), 男, 微生物学专业硕士研究生通讯作者 : 刘如石 (1971- ), 男, 博士, 教授, 硕士生导师, 主要从事抗体与基因工程药物研究 ( 电子信箱 )li urushi@hunnu.edu.cn;( 电话 )

2 第 4 期邱果等 : 抗 HCMVPp65 蛋白单克隆抗体的制备及性质研究 339 werescreenedandtheantibodytitersweredeterminedbyindirectelisa.andthenthemonoclonalantibodyspecificity forhcmvwereidentifiedbywesternbloting.finaly,immunocapturepcrandimmunofluorescenceasayforhcmv detectionwereusedtoevaluateapplicationprospectofthepreparedmonoclonalantibody.onehybridomacellinewasa chieved,anditcanstablysecretemonoclonalantibodyagainsthcmvpp65withhightiters,named8d6.theantibody titersreachedto1 4000and whendetectedbywesternblotingandindirectedelisa,respectively.theresults ofimmunofluorescenceasayandimmunocapturepcrshowedthatthemonoclonalantibodysecretedby8d6hadexcel lentafinityandspecificity.alexperimentalresultsindicatethattheantibodycanbeusedasthekeyrawmaterialtoes tablishimmunofluorescencecytochemistryandimmunocapturepcrfordetectinghcmvinperipheralbloodcel,andal socanbeusedasthekeyrawmaterialofdoubleantibodysandwichmethodfordetectionofhcmvinclinicalinfection. whichlayanimportantbasisforthestudiesofthedevelopmentoftherapidandsensitiveclinicaldiagnosisreagentfor HCMVinfection. Keywords:HCMVPp65;hybridomacel;monoclonalantibody;immunoreactivity HCMV 是一种核酸大小约 235kb 的双链 DNA 病毒, 属疱疹病毒科 β 属 HCMV 感染极为普遍 [1], 多数感染者无临床症状, 但是母亲孕期感染可以导致胎儿感染, 通过血液可以进入各种靶器官, 导致多系统脏器损伤 ( 如肺炎少数为肝炎和脑炎 ), 存活者伴随着神经性耳聋智力低下及其它神经系统后遗症, 对 HCMV 感染早期进行诊断治疗显得尤为重要 HCMVPp65 蛋白是 HCMV 早期产生的一种结构蛋白, 在激活状态的 HCMV 感染时,Pp65 抗原于 6~ 24h 内表达于外周血淋巴细胞单核细胞多形核白细胞及血管内皮细胞中, 这表明 Pp65 蛋白 HCMV 活动性感染的一项早期指标因而,HCMVPp65 抗原对于 HCMV 的检测及治疗过程中的监测有着重要意义 [5] 目前 Pp65 抗原血症的检测是国际公认的标准检测方法 [2 3], 即免疫荧光或免疫酶化学染色检测法, 利用 HCMV 编码蛋白的特异性单克隆抗体直接检测外周血细胞中的 HCMVPp65 抗原 [4] 但是, 该方法目前尚缺乏统一质控标准, 并且在检测过程中易受主观因素的影响, 限制了其在临床上的应用另外目前 HCMV 诊断试剂盒质量参差不齐, 也给 HCMV 的预防和诊治造成严重障碍本研究旨在研发 HCMV 感染的快速低廉诊断试剂关键原料, 为 HCMV 诊断试剂的开发奠定可靠的基础我们选取全长 HCMV 被膜磷蛋白 (Pp65) 基因表达的重组 Pp65 蛋白为抗原, 通过杂交瘤技术制备了抗 Pp65 的单克隆抗体, 筛选到了一株分泌高亲和力和高特异性的抗 Pp65 单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 即 8D6 ELISA 和 Westernbloting 实验证明, 该抗体具有高效价和高特异性免疫荧光实验和病毒捕获实验进一步证明该单抗特异性好亲和力高这些实验均证明该单克隆抗体具有良好的应用前景, 为今后建立 HCMV 感染临床检测方法奠定了基础 1 材料与方法 1.1 材料动物和细胞株 SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞由厦门大学公共卫生学院夏宁邵教授惠赠, 人肺胚成纤维细胞 (HEL) 由本实验室保存,BALB/c 雌性小鼠购自中南大学湘雅医学院主要试剂 pto T7 标准抗 Pp65 单克隆抗体由湖南康润药业有限公司惠赠标准重组 Pp65 蛋白购自美国 ProSpec 公司,HRP 羊抗鼠由厦门大学公共卫生学院夏宁邵教授惠赠, 蛋白质相对分子质量标准购自 GeneStar 公司,HRP DAB 底物显色试剂盒购自 TianGen 公司,PEG1500 HT 和 HAT 培养基购自 Sigma 公司,1640 培养基购自 Gibco 公司 1.2 方法 Pp65 蛋白的大量制备及鉴定 Pp65 重组原核表达质粒转化大肠杆菌 BL21, 然后涂布到含有 Kan+ 的 LB 营养平板上,37 培养 12h 后, 从平板上挑取单菌落接种到 10mLLB(Kan + ) 培养基中培养 8h, 然后将 10mL 培养菌作为种子菌接种到 2L LB 培养基 (Kan + ) 中培养, 在菌液 OD 600 值达到 0.6 时加入 IPTG 至终浓度为 0.4mmol/L 进行诱导表达 4h 后,12000g 室温离心 8min 收集菌体, 加入 100 ml 细胞裂解液 (50mmol/LTris HCl,1mmol/LED TA,100mmol/LNaCl,pH8.0), 10mm 探头 200W 功率超声破碎细胞,12000g 室温离心 10min 收集包涵体沉淀包涵体用 50mLbuferI(20mmol/L

3 340 激光生物学报第 23 卷 Tris HCl,5 mmol/l EDTA,100 mmol/l NaCl) 和 0.5%TritonX100 buferi 洗涤 2 次, 然后用 50mL buferi 配制的 2mol/L 4mol/L 尿素依次溶解包涵体取 4mol/L 溶解包涵体进行电泳后进一步进行电洗脱, 洗脱蛋白在 10 倍体积的 PBS 中每次透析 2h, 重复透析 3 次, 收集透析蛋白并用 SDS PAGE 鉴定蛋白纯度动物免疫与血清效价检测将纯化后的 Pp65 蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化, 采用足底板免疫方法, 以每只 100μg 的剂量免疫 3 只 6~8 周龄 BALB/c 雌性小鼠两周后将 Pp65 重组蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化, 采用同样的剂量和方法加强免疫 BALB/c 小鼠每次免疫前 1d 采集小鼠血清, 间接 ELISA 方法检测血清中抗体效价融合前 3d 用不加佐剂的 Pp65 重组蛋白免疫足底板, 每只剂量为 100μg 所采血液 1 5 稀释于生理盐水中, 然后将血悬液置于 37 2h, 再移至 4 过夜, 待血球凝集后 4000g 离心 10min, 吸取上清液即所得抗血清, 间接 ELISA 法检测血清效价, 选取血清效价大于的小鼠进行细胞融合试验细胞融合阳性杂交瘤细胞筛选与亚克隆选择生长状态良好的 SP2/0 骨髓瘤细胞与免疫小鼠淋巴结细胞分别用无血清培养基洗涤 3 次后, 以 1 5~1 10 混合,1500g 离心 5min, 弃上清轻摇离心管使细胞均匀分散后, 缓缓加入 1mL37 预热的 PEG1500 并轻轻混匀, 然后加入 20mL1640 培养基 800g 离心 5min 后弃上清, 加入 20% FBS HAT 1640 培养基悬浮细胞并混匀将混匀后的细胞均匀铺于 96 孔板中, 置于 37,5% CO 2 的培养箱中培养, 每天跟踪观察, 融合后 7~10d 用 10% FBS HT 1640 培养液换液, 待克隆长至孔底面积的 1/3~1/2 时用间接 ELISA 方法检测杂交瘤细胞上清液中抗体, 选择阳性值高且细胞集落数目少的孔, 通过有限稀释法进行克隆化经过 3 次克隆化后, 即获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株单克隆抗体的亚型鉴定将纯化的 Pp65 蛋白用 CB 缓冲液 (15mmol/LNa 2 CO 3,35mmol/L NaHCO 3 ) 稀释至浓度为 1mg/L, 包被 96 孔 ELISA 板,4 过夜洗板 1 次后, 加入杂交瘤细胞培养上清液,37 孵育 30min 后, 洗板 5 次, 加入 HRP 羊抗鼠二抗,37 孵育 30min, 洗板 5 次, 最后加入 TMB 底物显色剂,37 反应 10min, 加入终止液终止反应,450nm/630nm 双波长检测单克隆抗体产生与纯化采用小鼠体内诱生腹水方法生产单克隆抗体取 8~10 周 BALB/c 小鼠, 先腹腔注射无菌石蜡油, 每只 0.5mL 3d 后向腹腔内注入杂交瘤细胞, 调整细胞密度为 ~ /ml, 每只小鼠腹腔注射 0.5mL 细胞悬液接种细胞 7~12d 后即开始采集腹水将采集好的腹水先 1 1 加入饱和硫酸铵沉淀进行初步纯化, 4,12000g 离心 10min, 去掉上清, 沉淀用一定体积的 PBS 缓冲液 (20mmol/LNaCl,2.68mmol/L KCl,10mmol/LNa 2 HPO4,1.76mmol/LKH 2 PO4,pH 7.4) 溶解后, 放入 10 倍体积的 PBS 缓冲液透析 2 次, 每次 2h 4,8000g 离心 10min, 收集上清, 然后移至透析袋中透析平衡至 20 倍体积的 Binding bufer(proteina SefinoseKit 中提供 ), 透析抗体用 ProteinA 进行亲和层析纯化,SDS PAGE 鉴定纯化效果人巨细胞病毒分离培养用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液培养 HEL 细胞于 10mm 培养皿, 待细胞长至皿底表面积 40% ~50% 以后, 将临床分离的 HCMV 病毒株感染 HEL 细胞, 感染量为 1000 pfu/ 皿, 置于 5% CO 2,37 细胞培养箱中孵育 1h 后, 换用 2% 小牛血清的 DMEM 细胞培养液培养, 感染培养 5~7d 后, 待细胞基本上发生病变后, 收集含有 HCMV 的细胞上清液上清液 10000g 离心 20min 去细胞碎片, 用 50% 饱和硫酸铵沉淀 1 次, 经 20mmol/LPBS 透析后获得具有感染性的病毒单克隆抗体的特异性效价鉴定将巨细胞病毒裂解总蛋白进行 10% 的 SDS PAGE, 电转移到 PVDF 膜上 (200mA,1h), 用脱脂奶 TN 缓冲液 (5% 脱脂奶,50mmol/LTris HCl,150mmol/LNaCl,pH 7.5) 封闭 2h,TNT 缓冲液 (50mmol/LTris HCl, 150mmol/LNaCl,0.05% Tween 20,pH7.5) 洗膜 3 次, 每次 10min, 然后加入单克隆抗体 ( 脱脂奶稀释 ), 室温反应 2h, 洗膜 3 次, 每次 10min, 加入 HRP 酶标羊抗鼠二抗 ( 脱脂奶稀释 ), 室温反应 2h 后,TNT 洗膜 3 次, 每次 10min, 最后用 HRP DAB 底物显色试剂盒进行显色将纯化后的 Pp65 蛋白用 CB 液 (15mmol/LNa 2 CO 3,35mmol/L NaHCO 3 ) 稀释至浓度为 1mg/L, 包被 ELISA96 孔板,4 过夜, 洗板 1 次后, 加入梯度稀释的单克隆抗

第 4 期邱果等 : 抗 HCMVPp65 蛋白单克隆抗体的制备及性质研究 341 体 (1 10 2,1 10 3,1 10 4,1 10 5,1 10 6 ),37 孵育 30min 后, 洗板 5 次, 加入 HRP 羊抗鼠二抗,37 孵育 30min, 洗板 5 次, 最后加入 TMB 底物显色剂, 37 反应 10min, 加入终止液终止反应,450nm/ 630nm 双波长检测

4 第 4 期邱果等 : 抗 HCMVPp65 蛋白单克隆抗体的制备及性质研究 341 体 (1 10 2,1 10 3,1 10 4,1 10 5, ),37 孵育 30min 后, 洗板 5 次, 加入 HRP 羊抗鼠二抗,37 孵育 30min, 洗板 5 次, 最后加入 TMB 底物显色剂, 37 反应 10min, 加入终止液终止反应,450nm/ 630nm 双波长检测将大肠杆菌重组菌株表达总蛋白进行 10% SDS PAGE, 电转移到 PVDF 膜上 (200mA,1h), 用脱脂奶 TN 缓冲液 (5% 脱脂奶,50mmol/LTris HCl, 150mmol/LNaCl,pH 7.5) 封闭 2h,TNT 缓冲液 (50mmol/LTris HCl,150 mmol/l NaCl,0.05% Tween 20,pH7.5) 洗膜 3 次, 每次 10min, 然后分别加入单克隆抗体 ( 按梯度稀释 ), 室温反应 2h, 洗膜 3 次, 每次 10min, 加入 HRP 酶标羊抗鼠二抗 ( 用脱脂奶稀释 ), 室温反应 2h 后,TNT 洗膜 3 次, 每次 10min, 最后用 HRP DAB 底物显色试剂盒显色 D6 免疫荧光检测病毒感染细胞与免疫捕获 PCR 将 HEL 细胞用 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液培养至已放置细胞爬片的 24 孔培养板中, 待细胞长至皿底表面积 40% ~50% 以后, 将临床分离的 HCMV 病毒株感染 HEL 细胞 ( 即将保存的病毒液滴加至生长了 HEL 的培养皿中 ), 感染量为 500pfu/ 孔, 置于 5% CO 2 细胞培养箱中 37 孵育 1h, 换用 2% 小牛血清的 DMEM 细胞培养液培养, 感染培养 5 ~7d 后, 待细胞基本上发生病变后, 用镊子小心夹出爬片,PBS 洗涤爬片 3 次, 每次 5min, 然后加入 4% 多聚甲醛固定 10min, 接着用 PBS 洗涤爬片 3 次, 每次 5min, 接着加入透化液 (2% TritonX 100 PBS) 作用 5min,PBS 洗涤后加入抗 Pp65 单克隆抗体 ( 稀释 ),25 孵育 30min,PBS 洗涤后加入 FITC 羊抗鼠二抗,25 孵育 30min,PBS 洗涤 3 次, 加入抗猝灭剂后置于荧光显微镜下镜检纯化单克隆抗体用碳酸盐缓冲液 (ph9.6) 稀释至 4μg/mL,37 过夜包被到 0.5mL 小离心管中, PBS 洗涤 3 次后, 以 1.5mL 含 2% 牛血清白蛋白的 PBS 缓冲液 37 封闭 2h,PBS 洗涤 3 次将 HCMV 稀释到 1000pfu/mL, 取 200μL 加入抗体包被管中, 37 孵育 2h, 洗涤 5 次再加入 50μL 蛋白酶 K SDS 溶液 (0.6mg/mL 蛋白酶 K 3% SDS 溶于 PBS 中 ),37 孵育 1h, 苯酚氯仿抽提 2 次后, 加入 0.1 体积 3mol/L 醋酸钠 0.6 体积的异丙醇, 离心后获得 HCMV DNA 沉淀用 50μL 灭菌蒸馏水溶解 DNA 以提取病毒 DNA 为模板, 用 UL83 特异性引物 (HCMVFP:5 ATGGATATCGAC TTGCTGCTGCA 3, HCMVRP: 5 TCAATTCTGACCCTGAACCGTA GCCACC 3 ) 进行扩增, 扩展后的目的片段理论长度为 516bp, 设立严格的阳性和阴性对照 2 结果与分析 2.1 Pp65 蛋白的制备及免疫反应性鉴定大量表达的 HCMVPp65 包涵体经过电洗脱纯化后进行 SDS PAGE 与 Westernbloting 实验, 结果发现, 纯化后蛋白纯度达到了制备对抗的要求 ( 图 1A), 免疫印迹结果证明, 大肠杆菌表达的 Pp65 重组蛋白可与进口抗 Pp65 单克隆抗体发生强的免疫反应 A:SDS-PAGE 鉴定纯化 Pp65 蛋白纯度 ;B:West ernblot 鉴定纯化蛋白免疫反应性 (M: 蛋白质相对分子质量标准 ;1: 阴性对照 ;2: 纯化前的重组蛋白 ;3: 电洗脱纯化后的重组蛋白 ;4: 透析后的重组蛋白 ) A:Identification ofpp65 protein purity by SDS PAGE;B:Detectionofimmunereactivityofpurified Pp65protein(M:ProteinMarker;1:Negativecontrol; 2:Pp65proteinbeforepurified;3:Pp65proteinafter electroelution;4:pp65proteinafterdialysis) 图 1 重组 Pp65 蛋白纯化及其鉴定 Fig.1 Purificationandidentificationofrecombinant Pp65protein 2.2 动物免疫杂交瘤筛选与克隆化小鼠免疫后分别收集的血清按 1 10,1 10 2, ,1 10 4,1 10 5, 进行梯度稀释, 然后进行间接 ELISA 测定, 小鼠在初次免疫后, 经百万倍稀释后体内抗体水平很低 ( 以阴性值的 2.0 倍设为 Cut Of 值 ) 但是在第 1 次加强免疫后血清抗体效价明

5 342 激光生物学报第 23 卷显提高, 血清抗体在稀释百万倍后, 其吸光值高达 0.88 以上, 说明了 Pp65 重组蛋白具有良好的免疫原性, 能在小鼠体内引起较强的免疫反应在第 3 次免疫之后, 百万倍稀释后血清中抗体效价已高达 1.0 以上 ( 表 1), 此时免疫后的小鼠可用于后续试验 SP2/0 细胞与免疫小鼠淋巴细胞融合, 经 HAT 选择培养后,3~5d 时即有小克隆出现, 第 10d 时, 克隆已长至孔底面积的约 1/3, 每孔含 1 个或数个细胞克隆, 通过观察计数及间接 ELISA, 得出杂交瘤细胞的融合率和分泌抗体的阳性率分别为 92.5% 和 81.9% 经过 3 次亚克隆后, 从 60 多个阳性克隆中筛选到 1 株能稳定分泌抗 HCMVPp65 单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 命名为 8D6 经间接 ELISA 鉴定, 制备的单克隆抗体中均为 IgG2b 亚型表 1 间接 ELISA 检测小鼠血清中抗体效价 Tab.1 DetectionofantibodytitersofimmunizedmicebyindirectELISA OD 值 /ODvalue 小鼠编号 Numbersofmice 免疫前 Before 第 1 次免疫后 Afterthefirst 第 2 免疫后 Afterthesecond 第 3 免疫后 Afterthethird immunization immunization immunization immunization 单克隆抗体纯化将 8D6 杂交瘤细胞株腹腔注射 BALB/c 小鼠,7 ~10d 后可明显看到小鼠腹部膨大, 收集腹水后首先用 50% 饱和硫酸铵沉淀, 沉淀抗体在 PBS 中透析后, 利用蛋白 A 亲和层析进一步纯化透析后的抗体上样于结合缓冲液平衡的 ProteinA 亲和层析柱, 先用 3 倍柱床体积的结合缓冲液洗涤非特异性结合蛋白, 大约 1min 出现穿透峰, 再用洗脱缓冲液洗脱单克隆抗体, 在 11min 左右 8D6 被洗脱下来 ( 图 2A), 收集洗脱抗体, 进行 SDS PAGE 鉴定抗体纯度 ( 图 2Blane3), 经 ProteinA 亲和纯化后, 生物信息学分析抗体纯度达到 97% 以上, 在 SDS PAGE 胶上几乎看不到其他杂蛋白 2.4 单克隆抗体免疫反应性特异性与效价测定用免疫印迹法检验纯化单克隆抗体 8D6 的免疫反应性和特异性将本实验表达的重组 Pp65 蛋白细胞培养临床分离 HCMV 1 型人疱疹病毒等分别制备蛋白样, 先进行 10% SDS PAGE 电泳, 然后转膜进行 Westernbloting 分析, 结果显示, 在电泳转膜进行免疫印迹反应后, 重组 Pp65 蛋白细胞培养临床分离 HCMV 等在膜上均有特异性条带出现 ( 图 3Alane 1,2,4,5), 与阳性对照组中条带位置一致 ( 图 3A lane6) 说明抗体不但与重组 Pp65 抗原发生了特异性, 而且 HCMVPp65 蛋白也有强的特异性免疫反 2A: 抗体亲和层析图 ;2B: 纯化抗体 SDS PAGE 鉴定 (lanem: 蛋白质相对分子质量标准 ;lane1: 纯化前小鼠腹水 ;lane2: 硫酸铵分级沉淀抗体,lane3:proteinA 亲和纯化抗体 ) 2A:Monoclonalantibody8D6purifiedbyafinitychroma tography;2b:identificationofmonoclonalantibody8d6 afterpurifiedbysds PAGE.(laneM:ProteinMarker; lane1:mouseascitesbeforepurified;lane2:antibody obtainedbythesaltfractionationwithammonium sul phate; lane 3: Antibody purified by protein A afinitychromotography 图 2 抗体的亲和层析纯化与 SDS PAGE 鉴定 Fig.2 Purificationandidentificationofmonoclonalanti body8d6 应, 与 1 型人疱疹病毒以及大肠杆菌等非特异性蛋白没有任何交叉反应, 阴性对照组也没有出现免疫反应 ( 图 3AlaneCK,lane3) 8D6 经过梯度稀释后, 进行间接 ELISA 检测, 结果显示抗体与重组 Pp65 蛋

第 4 期邱果等 : 抗 HCMVPp65 蛋白单克隆抗体的制备及性质研究 343 白以及商品化 Pp65 蛋白免疫反应具有教高的灵敏度, 其效价可高达 1 100000( 图 3B) 说明了该株抗体具有良好的免疫反应性和特异性抗, 具有作为免疫诊断关键原料开发的潜力出现了明显的黄绿色阳性信号, 而在未感染的细胞对照中, 则没有阳性荧光细胞出现 ( 图 4B1) 但是 8D6

进一步说明本研究制备的抗 HCMVPp65 单克隆抗体具有良好的免疫反应性和高的亲和力, 具有作为诊断 HC MV 感染的关键原料的潜力 3A: 免疫印迹检测抗体特异性 (Ck: 阴性对照, 转化空载体的大肠杆菌 BL21 诱导后总蛋白 ;lane1: 重组 Pp65BL21 菌株诱导后总蛋白 ;lane2: 重组纯化 Pp65 蛋白 ;lane3:1 型人疱疹病毒裂解液 ;lane4:hcmv

6 第 4 期邱果等 : 抗 HCMVPp65 蛋白单克隆抗体的制备及性质研究 343 白以及商品化 Pp65 蛋白免疫反应具有教高的灵敏度, 其效价可高达 ( 图 3B) 说明了该株抗体具有良好的免疫反应性和特异性抗, 具有作为免疫诊断关键原料开发的潜力出现了明显的黄绿色阳性信号, 而在未感染的细胞对照中, 则没有阳性荧光细胞出现 ( 图 4B1) 但是 8D6 单抗作为一抗时,8D6 对应的细胞所发出的荧光最亮, 图像最清晰且持续的时间长 ( 图 4B2), 说明 8D6 比国产抗 HCMVPp65 单抗 ( 图 4B3) 有更好的亲和力和免疫反应性当单抗 8D6 和进口单抗作为一抗时, 检测感染病毒细胞的荧光反应, 结果发现, 8D6 单抗作为一抗时, 检测 HCMV 感染细胞的荧光强度和持续时间都优于进口一抗 ( 图 4B4), 进一步说明本研究制备的抗 HCMVPp65 单克隆抗体具有良好的免疫反应性和高的亲和力, 具有作为诊断 HC MV 感染的关键原料的潜力 3A: 免疫印迹检测抗体特异性 (Ck: 阴性对照, 转化空载体的大肠杆菌 BL21 诱导后总蛋白 ;lane1: 重组 Pp65BL21 菌株诱导后总蛋白 ;lane2: 重组纯化 Pp65 蛋白 ;lane3:1 型人疱疹病毒裂解液 ;lane4:hcmv 病毒裂解液总蛋白 ;lane5:hcmv 病毒裂解后纯化 Pp65 蛋白 ;lane6: 标准品 Pp65 蛋白 );3B: 进口抗体与 8D6 在浓度相同情况下检测其效价 3A:DetectionofSpecificimmunereactionofpurified8D6 bybandwesternbloting(laneck:negativecontrol, lane1:totalproteinofrecombinante.coliafterinduced, lane2:purifiedrecombinantpp65protein,lane3:lysate proteinofhumanherpesvirus1,lane4:lysatetotalprotein ofhcmv,lane5:purifiedpp65proteinfrom lysateof HCMV,lane6:StandardPp65 图 3 条带 Westernbloting 检测 8D6 免疫反应特异性与间接 ELISA 检测其效价 Fig.3 DetectionofSpecificimmunereactionandantibod ytitersofpurified8d6bybandwesternblotingandindi rectelisa,respectivelyprotein),3b:antibodytitersde tectionofpurified8d6byindirectelisa 2.5 免疫荧光实验检测单克隆抗体的特异性和免疫反应性在 24 孔细胞培养板中放置细胞爬片, 培养 HEL 细胞, 当细胞长至皿底表面积 40%~50% 后, 将临床分离的 HCMV 病毒株感染 HEL 细胞, 待细胞病变后, 取出细胞爬片, 分别取感染病毒的细胞和对照细胞固定在盖玻片上, 再用筛选到的 8D6 单克隆抗体购买的国产与进口标准抗 HCMVPp65 单克隆抗体进行免疫荧光染色检测, 比较抗体的特异性与亲和力结果发现, 将 8D6 与国产抗 HCMVPp65 单克隆抗体进行免疫荧光试验 ( 图 4B2,B3), 两种抗体均 A1~A4: 细胞感染病毒后可见光下观察的细胞 ;B1 ~B4: 细胞感染病毒后激发荧光后观察到的结果, A1 和 B1 阴性对照 ( 不加一抗 ), 其中 A2 和 B2 免疫反应的一抗为 8D6,A3 和 B3 免疫反应一抗为本研究制备的其他抗 HCMVpp65 单抗,A4 和 B4 免疫反应的一抗为进口抗 HCMVPp65 单抗 A1~A4:Celsobservedundervisiblelightafterthe HELcelsinfectedwithHCMV;B1~B4:Celsob servedunderlaserinducedfluorescenceafterthehel celsinfectedwithhcmv,a1andb1:negative(no firstantibodyadded),a2andb2:thefirstantibodyof immunereactionwas8d6,a3andb3:thefirstanti bodyofimmunereactionwastheotherantibodypre paredinthisstudy,a4andb4:thefirstantibodyof immune reaction was imported anti Pp65 monoclonalantibody 图 4 免疫荧光检测 8D6 与 HCMV 病毒感染细胞的免疫反应性与特异性 (100 ) Fig.4 Specificityandimmunereactivitydetectionof 8D6withHELcelsinfectedwithHCMV(100 ) 2.6 8D6 单抗免疫捕获 PCR 将纯化 8D6 单克隆抗体用碳酸盐缓冲液包被到 0.5mL 小离心管, 洗涤后以含牛血清白蛋白的 PBS 缓冲液封闭, 再经 PBS 洗涤, 然后将 200μL 稀释到 1000pfu/mLHCMV 加入抗体包被管中,37 孵育

344 激光生物学报第 23 卷 2h, 洗涤后按照常规方法提取病毒 DNA 以该 DNA 为模板, 用 UL83 特异性引物进行扩增, 以提取稀释的 HCMVDNA 为阳性对照 ( 图 5), 结果发现, 阴性对照没有扩增条带出现 ( 图 5lane1), 阳性对照有明显的扩增条带 ( 图 5lane8), 包被 8D6 的 6 个离心管捕获试验后, 以提取 DNA 作为模板,6

7 344 激光生物学报第 23 卷 2h, 洗涤后按照常规方法提取病毒 DNA 以该 DNA 为模板, 用 UL83 特异性引物进行扩增, 以提取稀释的 HCMVDNA 为阳性对照 ( 图 5), 结果发现, 阴性对照没有扩增条带出现 ( 图 5lane1), 阳性对照有明显的扩增条带 ( 图 5lane8), 包被 8D6 的 6 个离心管捕获试验后, 以提取 DNA 作为模板,6 个重复均能扩增出特异条带 ( 图 5lane2~7), 大小与扩增片段理论长度为 516bp 一致, 也与阳性对照扩增大小一致, 说明包被的 8D6 单抗与 HCMV 具有较强的亲和力, 具有捕获病毒的能力, 该结果进一步说明本研究制备的 8D6 单抗具有作为免疫诊断试剂开发的前景 lanem:dna 分子量标准,lane1: 阴性对照 ( 离心管不包被 8D6 单抗 ),lane2~7: 离心管包被 8D6 单抗,lane8:HCMV 病毒 DNA lanem:dnastandardmolecularmarker,lane1:nega tivecontrol(no8b6 wascoated in microcentrifuge tubes),lane2~7:8b6wascoatedinmicrocentrifuge tubes, lane8:purified HCMV genome DNA used astemplate 图 5 8D6 单克隆抗体免疫捕获 PCR Fig.5 ImmunecapturePCRofmonoclonalantibody 8D6 3 讨论 HCMV 是全世界最常见的一种能够引发先天性感染的病毒, 在我国成年人感染高达 60% ~100%, 即使在发达国家, 人群感染率也高达 40% ~60% 其感染可使免疫功能不成熟或缺陷的病人发生严重疾病, 如 HIV 病人感染会加速其免疫系统功能性损害从而导致病人死亡 ;HCMV 感染也是导致器官移植患者出现感染并发症, 导致器官移植的失败 ;HC MV 也是引起先天性及围生期感染的主要病原体, 可以造成流产早产胎儿宫内发育迟缓新生儿头小畸形肝脾肿大等多器官不可逆损害因此,HCMV 引发了严重的公共卫生问题, 在目前尚没有有效的 HCMV 疫苗上市时, 预防成为防止 HCMV 传播的主要手段目前的研究表明,HCMVPp65 是被膜蛋白中最主要的一种, 是一种低基质的磷酸化蛋白 [6], 属于即刻早期蛋白, 通常在病毒感染细胞 3~4h 即开始合成, 并于 6~24h 内在外周血多形核白细胞中大量表达 [7 8], 同时 HCMVPp65 具有高度保守性, 与其他的孢疹病毒无同源性, 广泛表达于感染性和非感染性的病毒颗粒中, 而且 HCMV 感染病人血清中几乎均能够检出, 因而,HCMVPp65 蛋白成为 HCMV 感染诊断的重要标志物早期检测到活动性 HCMV 感染是治疗的先决条件, 目前 HCMV 抗原血症的检测是快速诊断 HCMV 感染的重要方法国内对 HCMV 感染的诊断主要采用以全病毒为抗原的间接 ELISA 法 [9], 可由于 HCMV 分子量大, 结构复杂, 且与其他疱疹病毒有交叉反应, 因此以完整病毒作为抗原的特异性差而 HCMVPp65 抗原是病毒复制过程中出现的早期蛋白, 因此, 通过检测 Pp65 来判定病毒感染是临床上发现病毒血症的主要方法 [10] 而目前我国诊断 HCMV 感染的关键原料主要依赖进口, 造成诊断试剂价格高昂, 给病人造成了沉重的负担为了研发具有自主知识产权的 HC MV 关键诊断原料, 我们在克隆了 HCMV 病毒株 Pp65 全长基因并在大肠杆菌表达该蛋白的基础上, 进一步将重组蛋白免疫动物, 从 60 个阳性克隆中筛选到了一株高特异性和高亲和力的抗 Pp65 单克隆抗体, 该抗体的免疫反应性和特异性优于国内和进口的单抗, 而且该单克隆抗体具有捕获病毒的能力实验证据表明, 该抗体具有作为血液白细胞免疫荧光细胞化学诊断免疫荧光定量 PCR 检测 HCMV 感染的关键原料, 也可作为双抗体夹心法检测 HCMV 的关键原料, 因而具有重要的应用前景致谢 : 此文部分工作由湖南省基础医学重点学科和生物发育工程及新产品研发湖南省协同创新中心资助参考文献 [1] SIMONAM,ROSARIAS,STEFANIAM,etal.Comparisonof real timepcrandpp65antigenasaysformonitoringthedevel opmentofcytomegalovirusdiseaseinrecipientsofsolidorgan andbonemarow transplants[j].new Microbiol,2011,34 (2): [2] MOSESS,MALATHIJ,etal.Determinationofhumancytomeg aloviruspp65antigenemiaamongrenaltransplantpatients[j]. IndianJNephrol,2012,22(5):

8 第 4 期邱果等 : 抗 HCMVPp65 蛋白单克隆抗体的制备及性质研究 345 [3] EMERSONC,JACYRP,ANAP,etal.Comparisonofarapid cytomegaloviruspp65antigenemiaasayrevealedbyimmunofluo rescencetoanin houseasayrevealedbyimmunoperoxidasefor diagnosisinsolidorgantransplantrecipientpatients[j].brazj InfectDis2010,14(3): [4] SARACINO A,COLUCCIR,LATORRACA A,etal.The efectsofpreemptivetherapyusingaverylowthresholdofpp65 antigenemiatopreventcytomegalovirusdiseaseinkidneytrans plantrecipients:asingle centerexperience[j].transplantproc, 2013,45(1): [5] GIMENOC,SOLANOC,LATORREJC,etal.Quantification ofdnainplasmabyanautomatedreal timepcrasay(cyto megaloviruspcrkit)forsurveilanceofactivecytomegalovirus infectionandguidanceofpreemptivetherapyforalogeneichema topoieticstem celtransplantrecipients[j].jclinmicrobiol, 2008,46(10): [6] CHEVILLOTTEM,LANDWEHR S,LINTA L,etal.Major tegumentproteinpp65ofhumancytomegalovirusisrequiredfor theincorporationofpul69andpul97intothevirusparticleand forviralgrowthinmacrophages[j].jvirol,2009,83(6): [7] JOHNPT.Humancytomegalovirustegumentproteins(Pp65, pp71,pp150,pp28)[j].virolj,2012,9: [8] 高荣保, 王明丽, 陈敬贤. 人巨细胞病毒潜伏感染的研究进展 [J]. 国外医学 : 病毒学分册,2005,12(3): [9] KONDOK,KANESHIMAH,MOCARSKIES.Humancyto megaloviruslatentinfectionofgranulocyte macrophayeprogeni tors[j]. Proc NatlAcad SciUSA, 1994,91(25): [10] 李长贵, 王剑锋, 英志芳, 等. 以重组人巨细胞病毒 Pp65 制备的多克隆抗体建立检测感染性病毒颗粒方法 [J]. 中国生物工程杂志,2005,25(10): LIChanggui,WANGJianfeng,YINGZhifang,etal.Estabish mentofmethodtodetectactivehcmvinfectionpartidesusing antibodiesagainstrecombinanthcmvpp65protein[j].china Biotechnology,2005,25(10)47 49.

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽