生物技术通报 材料 方法

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1 生物技术通报 高曰文 朱耀明 王艳林 朱晨宇 秦烨 胡汉卿 韩钰 旨在探讨盐酸普鲁卡因 对人结肠癌 细胞 基因甲基化及表达的影响 应用巢式双重 甲基化特异性聚合酶链反应 检测盐酸普鲁卡因处理前后 细胞中 基因启动子的甲基 化水平 逆转录 聚合酶链反应 和蛋白印迹技术观察 细胞内 基因表达情况 检测发现人结肠癌 细胞中 基因存在甲基化 经盐酸普鲁卡因处理能够使 基因甲基化水平下降 和蛋白印迹分析结果显 示 人结肠癌 细胞经盐酸普鲁卡因处理后 基因表达上调 人结肠癌 细胞中 基因启动子甲基化导致基因 表达沉默 盐酸普鲁卡因能逆转 基因启动子区域 岛甲基化 使 基因活化并表达上调 提示盐酸普鲁卡因具有治疗 结肠癌的潜在应用价值 盐酸普鲁卡因 基因 甲基化

2 生物技术通报 材料 方法

3 2010年第 12期 高曰文等: 盐酸普鲁卡因对人结肠癌 HT 29细胞 Syk基因甲基化及表达的影响 录为 cdna 第一链 再以 cdna 第一链为模板, 特 异性 PCR 扩增 Syk 基 因 PCR 反 应总 体 积为 强 ( 图 2) L 反应程序: 94 预变性 5 m in, 94 变性 45 s, 61 退火 60 s, 72 延伸 45 s, 30个循环, 72 延伸 7 m in 扩增 Syk 基因的上 游引物 为 5 CATGTCAAG GATAAGAACATCATAGA 3; 下游引物为 5 AGTTCAC M. 甲基化; U. 未甲基化; IV D. 甲基化对照组; CACGTCATAGTAGTAATT 3, 扩增片段为 514 bp 扩 图 1 采用 M SP技术测定结肠癌 H T 29细胞中 增内对照 actin基因的上游引物 5 TGGCACCCAG CACAATGAA 3; 下游引物 5 CTAAGTCATAGTCCGC NL. 未甲基化对照组; H 2 O. 空白 Syk基因启动子的甲基化状态 CTAGAAGCA 3, 扩增 片段为 86 bp 取 PCR 产物 12 L进行 1 5% 琼脂糖凝胶电泳, 于紫外分析仪下 分析电泳结果 蛋白印迹 (W estern blo tting) M. 甲基化; U. 未甲基化 收集培养细胞, PBS洗 1次, 加入细胞裂解液 ( 10mmol/L HEPES ph mmo l/l D甘露醇 70 mm ol/l 蔗糖 5 mmo l/l 琥珀 酸钠 0 2 mmol /L EGTA 100 g /ml 毛地黄皂苷和 1% Cockta ils P IS), 室温裂解细胞 5m in 后, r /m in 离 心 10 m in 去 除细胞核 取胞浆 蛋白经 SDS PAGE 图 2 盐酸普鲁卡因对 Syk基因启动子的去甲基化作用 2. 3 逆转录 - 聚合酶链反应 ( RT PCR )检测 Syk基 因在 HT 29细胞中的表达 采用 RT PCR技术检测了盐酸普鲁卡因处理前 后, HT 29细胞中 Syk基因在转录水平上的表达改 变 结果发现, 药物处理前 Syk 基因在 HT 29细胞 分离 (每孔上样 10 g), 电转至 PVDF 膜 用含 5% 脱脂奶粉的封闭液封闭 PVDF膜, 室温下孵育 1 5 h 低表达, 经 1 0 mm o l/l 和 2 5 mm o l/l 盐酸普鲁卡 后, 在 室 温 下 分 别 与 含 兔 抗 人 Syk 多 克 隆 抗 体 显著性升高, 提示盐酸普鲁卡因可使 Syk基因重新 活化并表达上调 (图 3) ( 1 500稀释 ) 及 actin 抗体 ( 稀释 )的封闭 因处理 48 h后, Syk基因在 HT 29细胞中表达水平 液孵育 1 h, 使其与靶蛋白结合 TBST 液洗涤 4次, 每次 5 m in, 然后将膜转移到含二抗的 TBST 液中孵 育 1 h 膜用 TBST 液洗涤 4次, 每次 5 m in 化学 发光显色, X光片曝光并记录结果 2 结果 2. 1 结肠癌 HT 29 细胞 Syk基因启动子的甲基化 状态 采用 MSP 技术分析了结肠癌 HT 29细胞中 Syk 基因启动子的甲基化状态, 结果证实, 在引物覆盖的区域 中, HT 29细胞 Syk基因启动子为部分甲基化 (图 1) 2. 2 盐酸普鲁卡因处理对 H T 29细胞 Syk 基因启 动子甲基化水平的影响 图 3 HT 29细胞经盐酸普鲁卡因处理 48 h后 Syk基因的 mrna上调转录水平 2. 4 蛋白印迹法 (W estern b lo tting )检测 Syk蛋白在 HT 29细胞中的表达 蛋白印迹分析结果显示, Syk蛋 白在 HT 29 细 胞中低表达, 盐酸普鲁卡因处理可以上调 HT 29细 胞 Syk的表达水平, 随着盐酸普鲁卡因浓度的升高, Syk的表达水平也逐步增强 为分析 盐 酸 普 鲁 卡 因 对 Syk 基 因 启 动 子 是 否有去 甲 基化 作 用, 试 验 中 采 用 1 0 mm o l/l 和 2 5 mm o l/l 的盐酸普鲁卡因处理 HT 29细胞 72 h, 然后测定 Syk 基因启动子的甲 基化状态 结果发 现, 盐酸普鲁卡因处理能有效降低 Syk 基因启动子 的甲基化, 其去甲基化的能力随药物浓度增加而增 图 4 HT 29细胞经盐酸普鲁卡因处理 48 h后 Syk基因的蛋白表达水平上调

4 生物技术通报

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