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1 第 卷第 期 年 月 "## $%# - 基础医学 含 '- 野生及突变结合位点的胰岛素受体 '6,78&' 区报告基因载体的构建和鉴定 王美晨 王 璇 蓝 茜 李 癑 刘 莉 伊 静 李 靖 宋刘梅 马莎蕊 宁启兰 李冬民 西安交通大学医学部 遗传学与分子生物学系 环境与疾病相关基因教育部重点实验室 级临床医学七年制 级临床医学五年制 陕西西安 ( 摘要 目的 利用 6< *%&$%', :%''"D$" 简称为 6< 报告基因载体 构建并鉴定含, 野生及突变结合位点的胰岛素受体,>:, 区报告基因载体 '>:, 及 %'>:, 方法 以大鼠肝脏 $* 为模板 ;+, 获取目的片段 即含, 野生及突变结合位点的胰岛素受体,>:, 区 用 ;% 双酶切 6< 报告基因载体和含, 野生及突变结合位点的胰岛素受体,>:, 区 用 :* 连接酶连接纯化后的酶切产物 连接产物转化 * 大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆 并通过 ;+, 双酶切 * 测序鉴定构建的重组质粒 结果 ;+, 和双酶切证实 '>:, 及 %'>:, 重组载体中均插入目的片段 * 测序结果进一步证实 '>:, 重组载体中成功插入了胰岛素受体,>:, 区 %'>:, 重组载体中成功插入了在, 结合位点含有 个突变碱基的胰岛素受体,>:, 片段 结论 成功构建了含, 野生及突变结合位点的胰岛素受体,>:, 报告基因载体 '>:, 及 %'>:, 关键词 胰岛素受体,>:, 区 6< 报告基因载体 目的片段 重组载体 中图分类号, 文献标志码 文章编号 ---- ##,"8&''6# 9#'-# 6 $ 6 % 1 1 <6 % 6.&% *" *%"6$'%# "&$&% "&" 5%"%""4"%#6',&%#*'%''"'"#$%" +&$%&%' "6%#%&$$+ %%""4' +&$%&#$4% "%"6%#%(+% $%&'&++($+*+'$$%+$.$$$+*+'$>6$.*"$ $%++(.+'$"+(+-.+$ %>6(%+(+>6.%("*$($ +(.$+$5%$$+ %$%+.$$$+ #'$ +(.$+*(.$+''$$+'$>6$.*(+"$$%+"."+(+ (*+,-.-++**111,+*+*,+**, 收稿日期 修回日期 基金项目 国家自然科学基金资助项目 "- 陕西省科技计划资助项目 "5 国家级大学生创新训练资助项目 " (- 西安交通大学本科生科研训练和实践创新基金资助项目 " 及 " 通信作者 李冬民 医学博士 副教授 研究方向 非酒精性脂肪性肝病等代谢综合征的发病机制 %&&#"%&#$ 作者简介 王美晨 女 汉族 临床医学七年制 主要研究方向 $", 与胰岛素抵抗 %&%%%&$" "#$%&'$%&#"%%&#$

2 第 卷 -.+$$$-+($-.(+"$(+$%"(+$#'$+(.$+*(.$+(%$%+.$$$+$$+-$( 7-($++$"$($(+'$+'$%*$$&$.$+$%+ $$".(+$+.$+'$+'( ".($#-$4$+" +'$".(+%+$$$++(* %$+$+$"(+'$%+$"$$$%$%*+'$(.($%"(+$+'(%"#(" +'$$- (+%"($$$+*$+'.'-"$$++$&$.$+*$(7-(($4$$# (-"$$++$&$.$+*$( 7-(*$+'(++'$$-(+$+* %>6(%+(+>6$*"$+$++'$+(.$+*(.$+$%$+$"#'$((" *$4$$*+'$*$+'(+%>6$*"$+$+'$>6$.*(+" $$%+(%+(+>6$*"$+$+'$6$.*(+"$$%+ +(.+'$$-($+(+-.+$# 8$$*"++$%>6 (%+(+>6+'$$%+$.$$$+*+'$>6$.*"$$%++(. "+(+-.+$# '% "$$%+>6$. %$%+.$$($ %%$*(.$+ $.( &(+*+'$($ 胰岛素抵抗 '& ''%$ 是指正常数量的胰岛素不足以产生对脂肪细胞 肌肉细胞和肝细胞的正常的胰岛素响应的状况 是严重危害人来健康的 代谢综合征的共同病理基础 尽管目前多数学者认为引起胰岛素抵抗的主要原因是超重和运动不 足 但其确切发病机制尚未完全阐明, 是一个约 的非编码, 与其靶基因,> :, 区结合位点完全或部分互补配对结合 通过, 降解或压抑翻译过程而抑制靶基因的表 ( - 达 在细胞增殖与分化 细胞凋亡与死亡 发 ( 育 代谢 免疫反应 肿瘤发生等生物过程中担任了非常重要的作用 近几年越来越多的证据表明 $",, 与胰岛素抵抗的发 生密切相关 如 & (,(,, - 通过抑制胰岛素信号转导通路上的关键信号分子包括胰岛素受体 ', 和胰岛素因子受体 69, ( 胰岛素受体底物, 和胰岛素受体底物, 磷脂酰肌醇 激酶 ;5 - 参与了胰岛素抵抗的发生发展 作为胰岛素信号途径的开关分子? 胰岛素受体是否受, 调节尚没有文献报道 生物信息学预测显示大鼠 ', 可能是, 的靶基因 为了阐明此机制 我们构建并鉴定了含, 野生及突变结合位点的胰岛素受体,>:, 区的报告基因载体 材料与方法 实验动物 主要试剂及仪器 本实验选用 周龄近交系雄性 大鼠 只 来自西安交通大学医学部遗传学与分子生物学系的 ;9 级实验动物室 主要试剂有 6<*%&$%',:% ''" D$" 简记为 6< 载体 ;" %:,8"& 试剂及 "%$% 4" 反转录试剂盒,4%#: 9'%# $* '' 及 ; 和 % 限制性酶切酶 9%': * 连接酶 :%5%,%A 9%'& #";&%'# 5< 6* 琼脂糖凝胶纯化试剂盒 博大泰克 其余试剂均按照分子克隆实验指南 第三版 的实验方 法配制 主要仪器有水平电泳槽 低温水浴槽 凝胶成像系统 16 及恒温培养箱 引物的设计 在 6% 里查找,%'" 4$''& $", 序列号 利用 ; ; 软件设计胰岛素受体,>:, 区全长的报告基因载体引物 上游引物带有限制性内切酶 ; 酶切位点 序列为 >666::: :6+:+6> 下游引物带有限制性内切酶 % 酶切位点 序列为 >:+ +:+:666+66::+:6+6:6+>;+, 扩增产物长 仍利用上述软件设计含, 突变结合位点的胰岛素受体,>:, 区报告基因载体的引物 上游引物带有限制性内切酶 ; 的酶切位点 序列为 >666::: :6+:+6> 下游引物带限制性内切酶 % 酶切位点 并在与, 种子序列结合的位点引入 个突变碱基 ++ 故下游引物序列为 >++:+:6::666:+66+:::6 6:+> 带下划线的碱基为引入的突变碱基 利用基因克隆技术分别构建含, 野生结合位点的胰岛素受体,>:, 区报告基因载体 简记为 '>:, 以及含, 突变结合位点的胰岛素受体,>:, 区报告基因载体 简记为 %'>:, "#$%&'$%&#"%%&#$

3 第 卷 王美晨 等 含, 野生及突变结合位点的胰岛素受体,>:, 区报告基因载体的构建和鉴定 +,(,78&' 及 (,78&' 报告基因载体的构建 首先取 大鼠肝组织 (,8"& 试剂说明书提取肝总, 并定量,:;+, 获取含, 野生及突变结合位点的胰岛素受体,>:, 的目的片段 复苏并扩增 6< 载体菌种 提取质粒并定量 用限制性内切酶 ; 和 % 对目的片段 ;+, 产物和 6< 载体进行双酶切 酶切产物经 B 琼脂糖凝胶电泳后 在紫外透射下切下目的条带和 6< 载体 用 * 琼脂糖凝胶纯化试剂盒分别回收并定量 用 :* 连接酶连接双酶切纯化后的 6< 载体和目的片段 载体 * 目的片段 * 摩尔数之比为 E 选用 连接体系 = 连接过夜 取连接产物 加入 * 感受态细胞 分别设置加 ; 的阴性对照和加 6< 载体阳性对照 具体操作遵照分子克隆指南 + 用 4'4( 和 :( 双酶切以及 6 测序鉴定重组载体 (,78&' 及 (,7 8&' 从 '>:, 及 %'> :, 平板上随机挑取 个阳性克隆 加入 含有 氨苄青霉素的 液体培养基中 在恒温振荡器 = 剧烈震荡培养 ( 在超净工作台内 取 菌液 = 保存 用于测序 剩余菌液 按照质粒小提试剂盒提取重组质粒 ' >:, 及 %'>:, 以提取的 6< 质粒和重组质粒 '>:, 及 %'>:, 为模版 ;+, 扩增含, 野生及突变结合位点的胰岛素受体, >:, 的目的片段 按照 双酶切体系 用限制性内切酶 ; 和 % 双酶切鉴定重组质粒 '>:, 及 %'>:, 后 B 琼脂糖凝胶电泳检测 ;+, 及双酶切产物 并照像 并将重组质粒 '>:, 及 %' >:, 菌液送公司测序 结 果 +(,78&' 重组载体的鉴定 在含氨苄青霉素的 平板上挑选重组质粒的阳性克隆 液体 培养基扩增后提取质粒并定量 以提取的 '>:, 重组质粒分别为模板 用构建 ' >:, 载体所用引物分别进行 ;+, 扩增 B 琼脂糖凝胶电泳检测 ;+, 产物 结果显示在 和 之间 图 % 有一条明显的条带 它们与目的片段大小一致 说明 '>:, 重组质粒中均包含有目的片段 用限制性内切酶 ; 和 % 双酶切 '>:, 重组质粒 B 琼脂糖凝胶电泳图上可见 条清晰条带 其中 个位于 * % 所示的 - 之间 另一个位于 之间 这分别与 6< 质粒 及目的片段 的大小相一致 图 % 然而 6< 质粒用限制性内切酶 ; 和 % 双酶切后 在 B 琼脂糖凝胶电泳图上只有 个条带位于 *% 所示的 - 之间 这只与 6< 质粒 大小相一致 图 % 这些说明 '>:, 重组质粒经 ; 和 % 双酶切后可以释放出目的片段 % 分别为 和 的 * % % 为 '>:, 重组载体 ;+, 产物 % 分别为 6< 空载体及 '> :, 重组载体 ; 和 % 双酶切产物 图 (,78&' 重组载体的鉴定 对构建的 '>:, 重组质粒进行测序 并用 *''' 软件将测序结果与从 6% 中拷贝的胰岛素受体,>:, 序列进行比对 '>:, 重组质粒中的插入片段与 6 % 中胰岛素受体, >:, 区序列完全相同 +(,78&' 重组载体的鉴定 在含氨苄青霉素的 平板上挑选重组质粒的阳性克隆 液体 培养基扩增后提取质粒并定量 以提取的 %'>:, 重组质粒分别为模板 用构建 %'>:, 载体所用引物分别进行 ;+, 扩增 B 琼脂糖凝胶电泳检测 ;+, 产物 结果显示在 和 之间 图 % 有一条明显的条带 与 ( 目的片段的大小相一致 说明 %'>:, 重组质粒中包含有目的片段 用限制性内切酶 ; 和 % 双酶切 %'>:, 重组质粒 B 琼脂糖凝胶电泳图上可见 条清晰条带 其中 个位于 * % "#$%&'$%&#"%%&#$

4 + %'# + 所示的?$$$L*'E$$$L* 之间%另一个位于?"$L* 第 " 卷 变位点( T_` 质 粒 $?"$ '%$$$L* 之 间%这 分 别 与 L*&的 大 小 相 一 致 $图 % L*&及 目 的 片 段 $ T_` 质 粒 用 限 制 性 内 切 酶 Y<1 _1 &#然而 *< 和 NL7 双 酶切 后% 在 琼脂糖凝 胶电 泳图 上 只 有 %f % 个条带位于 BA <7 Z1 所示 的?$$$L*'E$$$ T_` 质粒$?"$L*&的 大 小 相 L* 之间%这只与 *< 一致 $图 % _1 #&( 这 些 说 明 *< b <> QXD 重组质粒 经 过 Y<1 和 NL7 双 酶 切 后 可 以 释 放出目的片段( 对构建的 *< bqxd 重 组质粒 进 <> 行测 序%并 用 BA9 9 9 # #软件将测序结果与从 T1:[Z 中拷 贝 的 胰 岛 素 受 体 <DA bqxd 区 序 列进 行 比 对% bqxd 重 组 质 粒 中 *< <> _1\%'\# 分 别 为 %ZL 和 #"$L* 的 BA <7 Z1 % _1 % 为 *< bqxd 重 组 质 粒 YCD 产 <> 物# T_` 空 载 体 及 *< _1 #' 分 别 为 *< <> bqxd 重组质粒 Y<1 和 NL7 双酶切产物( 插入片 段 与 T1:[Z 中 胰 岛 素 受 体 <DA bqxd 序列有 个碱基不同$图 &%这恰好是 我 们 设 计 的 突 图 J"+. L & ' D UV89 重组质粒 的 R 及双酶切鉴定 M1 1$ 为 C[T1:[Z 数据库中大鼠胰岛素受体 <DA bqxd 区的部分6BA 序列#M1 1 U>1:6 U>1:6 bqxd 重组质粒的 BA 部分测序结果( % 为 *< <> 图 D"+. L & ' D UV89 重组载体?T1 测序的部分比对结果 致%这说明 *< bqxd 重组质粒中插入了胰 岛 D" 讨 " 论 素受体 <DA bqxd 区#该 质 粒 用 限 制 性 内 切 酶 以提取的 *< bqxd 重组质粒为模板%用 构建 *< bqxd 载体所用引物进行 YCD 扩 增 Y<1 和 NL7 双酶切后% %f 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 图 上 可 见 # 条 清 晰 条 带%一 条 与 载 体 大 小 一 致%而 位 于?"$ 后% %f 琼脂糖凝胶 电 泳 检 测 结 果 显 示 位 于 %$$$L* 和?"$L* 之 间 条 带 与 '%"L* 目 的 片 段 的 大 小 相 一 L* 和 %$$$L* 之 间 的 条 带 与 目 的 片 段 胰 岛 素 受 体 <DA bqxd$ '%"L*& YCD 产 物 的 大 小 完 全 一 致% ""+,-. ( :1 6:#; <7 8 < *(-<7 8. > 15> 6: * -. *1 =

5 第 卷 王美晨 等 含, 野生及突变结合位点的胰岛素受体,>:, 区报告基因载体的构建和鉴定 这进一步提示构建的 '>:, 重组质粒中有目的片段的插入 * 测序结果表明 ' >:, 重组质粒中插入片段与 6% 胰岛素受体,>:, 序列完全相同 进一步说明我们成功构建了含, 野生结合位点的胰岛素受体,>:, 区报告基因载体 '>:, 以提取的 %'>:, 重组质粒为模板 用构建 %'>:, 载体所用引物进行 ;+, 扩增后 B 琼脂糖凝胶电泳检测结果显示位于 和 之间条带与 ( 目的片段大小相一致 这说明 %'>:, 重组质粒中插入了目的片段 该质粒 ; 和 % 双酶切后 B 琼脂糖凝胶电泳图上可见 条清晰条带 一条与载体大小一致 而位于 和 之间的条带与目的片段 突变的胰岛素受体, > :,(;+, 产物的大小完全一致 这进一步提示构建的 '>:, 重组质粒中有目的片段插入 * 测序结果表明 %'> :, 重组质粒中插入片段除了 个碱基不同 其余均与 6% 胰岛素受体, >:, 序列相同 这进一步说明成功构建了含, 突变结合位点的胰岛素受体,>:, 区报告基因载体 %'>:, 以上实验结果表明 我们成功构建了包含, 野生和突变结合位点的胰岛素受体,> :, 区报告基因载体 这为我们今后研究, 对大鼠胰岛素受体调节的分子机制打下坚实的基础 参考文献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萨姆布鲁克 #8 拉塞尔著 # 黄培堂等译 # 分子克隆实验指南 第三版 # 科学出版社 # (#$(+$+("(+("$%$ "#$%&'$%&#"%%&#$

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标题 第 35 卷第 3 期 2014 年 9 月 FOREIGN MEDICALSCIENCESECTION OF MEDGEOGRAPHY Vol.35No.3 Sep.2014 189 基础医学 含 mir-497 野生及突变结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 区报告基因载体的构建和鉴定 王美晨 3 1,2 1,2 1,2 1,2, 王璇, 蓝茜, 李玥, 刘莉, 1,2 1,2 伊静, 李靖,

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