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1 畜牧兽医学报 伏马菌素 ' 单克隆抗体的制备及免疫学检测方法初步应用 姚静静 胡骁飞 韩俊岭 李青梅 王方雨 邓瑞广 张改平 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室农业部动物免疫学重点实验室 郑州 新乡医学院第一附属医院 新乡 河南农业大学 郑州 摘 要 拟制备灵敏高 特异性强的抗伏马菌素 7 单克隆抗体 并初步应用于 的检测 以期为 的免疫学快速检测提供技术支持 采用碳二亚胺法 40 制备人工抗原 7 " 和 A" 以免疫原 7 " 免疫 7"57( 小鼠 每四周免疫一次 四免后 小鼠脾 7 细胞与 骨髓瘤细胞融合后 采用 56 " 筛选 建立分泌抗 抗体的单克隆杂交瘤细胞株 采用动物体内诱生腹水方法制备出抗 单抗 并鉴定单抗的各种性能 初步建立 免疫学检测方法 结果得到 株稳定分泌抗 单抗的杂交瘤细胞株 # 该细胞株分泌的 %" 的效价高达 亲和力常数平均值为 5%' 亚型为 6- %" 的工作浓度为 与 发生特异性反应 间接竞争 56 " 测得 60%5 与 结构类似物 和 的交叉反应率分别为 : 和 : 与其他霉菌毒素及载体蛋白 7 " 和 A" 均无交叉反应 样品回收率在 :: 平均值为 : 变异系数为 : 本研究制备出了灵敏度高 特异性强 亲和力高的 单抗 并初步建立 免疫学检测方法 关键词 伏马菌素 7 单克隆抗体 杂交瘤 56 " 中图分类号 文献标志码 " 文章编号 70#%"" 0%"&0#"#6#"#0#"0"#&-"/%#""'." #? & #"' 56% /"- 3& 4-& +#"--& -% #4%)% ##%'"% #-4%)% ##%& /" # -"# 5'#"%5& -##"%& " %('&'&&&%7 )&'&&'& '&%%'( % )&(('(&)7 "& A"40('#%&(''(%('&&%"&& )&(% (')'7('7"57(%()()& %%) 7 "%)2&&%1%"&& ) &(&(%(1&&' %")&&)56 "3%%")'%&'&'%%' ( 1%"&& ))&&6- )( 收稿日期 基金项目 国家科技支撑计划课题 7"47 河南省农业科学院优秀青年基金项目. 河南省基础与前沿项目 作者简介 姚静静 女 河南禹州人 助理研究员 硕士 主要从事食品安全检测研究 %&'&'(2(% 通信作者 张改平 男 河南内黄人 中国工程院院士 %&'&&(%

2 %&%& 畜牧兽医学报 )3 卷 ;>M "#7 -" 06%% 5#' I;A# P -=#- #-# ;74MA %^.' &l%&) > #- A 3' /(l %&%&S/7# _% TH1& A )'.1-=/7S_% ' I; # #- # A ;Q? 7# -U0-"U A # " -= )X A; -#-A ;# ; - #=? -" >(1X -"30' ;O =A /(' (%X -" # -' I; #O # 7L A 7#-=(1' (1X %%) `&3X L > ; # # O #-A %&' %%X' I; 7#-# # M#"> QU% A ;; = =; > L -" M L #"? " -"L 7 " -77?-# #=>" 7 #-# QU% ' > >A > LL?+. 2?7# -U% & 7#-# #- M#">& ;>M "#7 & 6ST24 5?7# -#主要是由串珠镰刀菌属产 伏马菌素" 生的一 类 有 毒 害 和 致 癌 性 的 真 菌 毒 素包 括 QU% ( 于现场实时检测'免疫学检测方法具有样品处理简 QU0( QU 等 %% 种 "结 构 如 图 %#其 中 伏 马 菌 素 U% " QU%#是主要组分也是毒性最强的组分主要污染玉 测大量样品已成功 运 用 于 食 品 和 饲 料 中 霉 菌 毒 素 米(小麦(稻 米 等 粮 食 作 物 及 其 制 品 % + '采 食 含 有 QU% 的饲料和食品可导致 人 及 动 物 中 毒如 马 的 脑 白质软化症(猪肺水肿症(大鼠肝癌(人类食管癌和肝 ) 3+ '国际癌症研究中心" T4ZH#将 QU% 列为 0U 类致癌物质"即人类可能致癌物#(+并对其在饲料及 癌等 单(灵明度高(特异 性 强 等 优 点适 用 于 现 场 快 速 检 的检测 %1 %/ 00+ '0&&) 年江涛等制备出 QU% 单克隆 + 抗体 TH1& j%(' /1-=/ 7S_% %) &以 此 单 克 隆 抗 体 研制的试剂盒抑制曲线回归线 方程 `1(0& 7j_& Ja% `3/ &>0 j & `//& %TH1& j %.. `1/ + _% %1 / ' 至 年 间 学 者 们 先 后 制 备 0&&3 0&%0 -= 7S + 食品中含量做了限量" %"7=/P=_%#规定 / ' 目前检测 QU% 的 方 法 主 要 有 仪 器 分 析 "高 效 出 TH1& 为 /& `((( `(/ 和 % `) '=/ 7S_% 的 QU% + 74M%.%( '受 抗 体 灵 敏 度 的 限 制以 上 QU% 74M制备快速检 测 试 纸 时不 能 满 足 检 测 限 量 标 液相色谱法(质谱及液相色谱 _ 质谱#%&%%+和免疫学 准'因此有必要制 备 出 更 高 灵 敏 度 的 QU% 74M 检测方法 %0 %+ '仪器分析检测方法 尽管灵 敏度 高 准确性好但仪器 昂 贵检 测 成 本 比 较 高且 不 能 用 图 # 伏马菌素 # ) 的结构式 G : #I =. J / = J. H; 5.7J H -5 ;G# % G % G) EA 以便建立更为灵敏的 QU% 检 测方 法并 为 QU% 快 速 检测试纸的制备奠定基础'

3 期 姚静静等 伏马菌素 7 单克隆抗体的制备及免疫学检测方法初步应用 本研究以 7 " 为免疫原 结合杂交瘤技术和 56 " 检测制备出针对伏马菌素 7 的高亲和力 灵敏度和特异性的单克隆抗体 并初步建立了 免疫学检测方法 该单克隆抗体结合胶体金免疫层析技术 有望建立灵敏度更高的免疫学快速检测伏马菌素的方法 材料与方法 ) 试剂与仪器 伏马菌素 黄曲霉毒素 7 和 ; " "3; 1 毒素 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 4 玉米赤霉烯酮 + 赭曲霉毒素 1" 牛血清白蛋白 7 " 卵清白蛋白 A" 培养基 #"1#1- 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 羊抗鼠酶标二抗 -";6- # 抗体亚类测定试剂盒购自 %& 公司 胎牛血清 -( 公司 7& 型酶标仪 美国 7& 公司 0 培养箱 1% 公司 洁净台 生物倒置显微镜 5(& 公司? 紫外扫描仪?A 日本岛津 > 高速冷冻离心机 德国 %& 公司 4>4 电热恒温水槽 上海一恒科技有限 公司 #50; 购自 /& 公司 7"57( 小鼠购自郑州大学医学院实验动物中心 骨髓瘤购自中国农业大学动物实验室 其他试剂均为分析纯 ).1 溶液体系包被液 %'5 # 碳酸盐缓冲液 07 洗液 7 1%'5 # 磷酸盐缓冲液 7 含 : 1) 封闭液 : 猪血清的 7 1 显色液 1;7 的磷酸 柠檬酸缓冲液 终止液 %'5 硫酸溶液 ) 方法 人工抗原 7 " 的合成 称取 % 伏马菌素 7 充分溶于 %57 搅拌下加入 % 碳二亚胺 40 下搅拌 充分活化 将 %7 " 溶于 %57 的溶液逐滴加入以上溶液中 下避光反应 反应结束后 溶液澄清 用 7 为透析液 每 更换一次 透析 然后 将透析袋中液体 % 离心 % 收集上清 即得免疫抗原 7 " 冻存备用 合成路线如图 制备检测抗原 A" 的方法同上 图 抗原 /''1 的合成路线 /-)+&"#0"-"/''1 动物免疫 取 周龄雌性 7"57( 小鼠 只 首免将免疫原 7 " 与弗氏佐剂乳化 % 按 5 每只的剂量进行初免 颈部 皮下多点注射 免疫周期为 周 免疫剂量相同 共免 次 二 三 四免均用弗氏不完全佐剂 四免后 周采血 56 " 测定 选择血清效价高与 抑制强的小鼠 融合前 用完全抗原 5 每只 不添加佐剂 加强免疫 细胞融合 免疫脾细胞与 骨髓瘤细胞融合 融合前 无菌条件下取 7"57( 小鼠腹腔内细胞做饲养细胞 铺 孔板细胞培养板备 用 取加强免疫过的小鼠眼睛血 作阳性对照 将小鼠脱颈致死 无菌条件下取脾制备脾细胞 与 骨髓瘤细胞按照 的比例混合 用 : - 促融 将融合后的细胞悬液接种到已铺有饲养细胞的 孔细胞培养板中 先用 #"1 再用 #1 培养液培养 后用 完全培养基培养 杂交瘤筛选及抗体检测 间接非竞争与间接竞争 56 " 进行筛选 以 A" 为包被原 以 细胞上清为空白对照 间接非竞争 56 " 筛选分泌 抗体的细胞孔 间接竞争 56 " 确认并检测敏感性 选择阳性较高 抑制率

4 畜 牧 兽 医 学 报 卷 高 细胞生长旺盛的细胞孔进行有限稀释克隆化 之后扩大培养 液氮冻存 抗 %" 的大量制备 采用动物体内诱生腹水法制备 单抗 向 周左右 7"57( 小鼠腹腔注射液体石蜡 %5 只 后腹 腔注射单克隆阳性细胞 %5 只 个 后抽取腹水 离心除去油脂沉淀后 即得 %" 单克隆抗体的鉴定 单克隆抗体的纯化 采用辛酸 硫酸铵 法纯化 %" 蛋白 : 4 "- 检测蛋白的纯度并估算蛋白的相对分子质量 抗体亚类的测定 采用抗体亚类试剂盒测定 抗体效价 采用间接 56 " 测定抗体效价 以 %5 的包被原 A" 包板 将 %" 稀释至 倍比稀释 放置 % 加入 : 猪血清的 7 1 稀释 倍的 -";6-# 酶标 % 加入 1;7 底物显色 % 加入终止液 %'5 # % 内测吸光值 4 % 设阳性对照 0 阳性小鼠血清 阴性对照 0 细胞上清液 空白对照 70 抗体稀释液 各两孔 检测结果以 4 实验 4 空白 4 阴性 4 空白 为阳性 抗体亲和力测定 采用间接 56 " 测定单 克隆抗体的亲和力常数 分别以 和 %5 的抗原 7 " 包板 每孔 5 温育 后 7 1 洗板 用 : 猪血清的 7 1 封闭 每孔 5 温育 7 1 洗板 将 %" 稀释至 %5 倍比稀释测 4 % 方法参见 亲和力常数的计算方法 以抗体稀释倍数 4 % 值作图 计算不同抗原浓度时 4 % 对应的抗体浓度 代入公式 4 "C" 计算亲和力常数 2&5%' " 和 "C 分别表示当抗原浓度为 " 和 "C 时 4 % 对应的抗体浓度 %'5 ""C 灵敏度 通常以 : 抗原抗体结合抑制药物的浓度 60 表示 采用棋盘法 选择 4 值在 左右时包被原浓度为最佳工作浓度 灵敏度取决于标准曲线的斜率和零浓度标准点 7 变异的大小 斜率的绝对值越大 7 的变异越小 则灵敏度越高 零标准品的 4 值代表 : 的活性 7 77 为药物的抑制率 即抑制率 系列药物组 4 值 7 以 浓度的对数值为横坐标 77 为纵坐标 制作 %" 的抑制曲线 可得出 60 间接竞争 56 " 检测步骤如下 以包被原最佳工作浓度包板 每孔 5 温育 后 7 1 洗板 用 : 猪血清的 7 1 封闭 每孔 5 温育 洗板 浓度设置为 %5 每孔 5 加入 5 抗 抗体 稀释液为 7 设置阴性对照 0 和空白对照 70 温育 % 后洗板 加入 : 猪血清的 7 1 稀释 倍稀释的 -";6-# 每孔 5 加酶底物 1;7 显色液 每孔 5 室温反应 % 终止显色反应 加入终止液 %'5 # 每孔 5 用酶标仪读 4 % 值 抗 %" 特异性 采用间接竞争 56 " 测定 药物有伏马菌素 7 和 7 黄曲霉毒素 7 和 ; " "3; 1 毒素 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 4 玉米赤霉烯酮 + 赭曲霉毒素 1" 等真菌类毒素及载体蛋白 7 " 和 A" 方法同 回收率的测定 用 中建立的抑制曲线 测定含有 %5 标准溶液 次 计算测定值 回收率和变异系数 0( &&0A 回收率 新样品测定值 原样品测定值 已知加标量 : 液相色谱 质谱串联 #50; 法验证 由河南省粮油饲料产品质量监督检验中心提供的 个霉变玉米样品 经粉碎处理 分别采用 #50; 和本研究建立的免疫学检测方法进行测定 每个样品每种方法测 次 检测结果以 " 表示 采用 软件进行单因素独立 检验分析 说明差异显著 结 果 ) 融合小鼠的选择 采用人工免疫抗原 7 " 免疫 7"57( 小鼠 四免后一周 采免疫鼠血清 包被原 A" 的工作浓度为 %5 将编号为 小鼠的血清分别按照 的比例用 7 稀释 采用间接 56 " 测效价 结果见表 说明四只小鼠均产生良好的免疫反应 血清效价高达 接着 将以上编号为 小鼠的血清分别按照 稀释 采用间接竞

5 期 姚静静等 伏马菌素 7 单克隆抗体的制备及免疫学检测方法初步应用 争 56 " 测小鼠血清的敏感性 结果见表 标品对四只小鼠血清均产生较强的抑制 选择抑制 效果最好的 号鼠进行细胞融合 表 间接.1 测多抗血清效价 +0+#"% &".1 小鼠编号 血清稀释倍数 4'((&&% 空白 阴性 ;( 7'&2 & 表 间接竞争.1 测多抗血清抑制效价 +0"#"%-"/'&"#%.1 小鼠编号 ;( 标品浓度 %5 &&((& 空白 7'&2 ) 杂交瘤细胞株的筛选细胞融合后 块细胞培养板上 孔均形成杂交瘤细胞株 融合率达 : 间接 56 " 检测均为阳性孔 间接竞争 56 " 检测以上 4 值较高的 阳性孔中有 孔为假阳性 其中 "3 和 7 这四孔的细胞上清的效价较高且抑制效果较好 经过一次亚克隆后获得 株杂交瘤细胞 # 经传代一个月 冻存与复苏后 杂交瘤细胞分泌抗体稳定 ) 抗体的纯度及其特性鉴定 抗体纯度的鉴定 经过辛酸 硫酸铵纯化前与纯化后的 %" 蛋白的 : 4 "- 电泳 图见图 结果表明 纯化后的抗 单克隆抗体蛋白具有较高的纯度 该蛋白的两条链分别约为 和 2 经 7& 分析估算出该抗体的相对分子质量约为 2 抗体亚类的鉴定 # 杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经过抗体亚类试剂盒测定 鉴定其为 6- 抗体效价 抗 单克隆抗体的大量制备参见方法 杂交瘤细胞株 # 的细胞上清和纯化后的 %" 采用间接非竞争 56 " 测定效价 细胞上清效价达 以上 纯化后的 %" 效价高达 结果见表 表 间接.1 测纯化后抗 /'% 效价 +0+# %-"/' &".1 纯化后单抗稀释倍数 4'%" 空白 7'&2 4%

6 畜 牧 兽 医 学 报 卷 图 抗体亲和力测定曲线 /-)"&#%-"/' 56 " 方阵确定包被原 A" 的最佳工作浓度 图 抗 /' 单克隆抗体的 171 /-)171#%-"/' 抗体亲和力测定 方法见 得到系列 4 % 值见图 代入公式 得到该 %" 的亲和力常数平均值为 5%' 间接竞争 56 " 方法的建立 采用 为 %5 抗 单抗的稀释倍数为 # 标记羊抗鼠 6- 的浓度为 倍稀释 抗体与抗原反应时间为 % 酶标时间为 %1;7 底物反应时间为 % 标准品 的浓度范围为 %5 结果见表 说明 标品对抗 单抗具有较高的抑制水平 表 间接竞争.1 测抗 /' 单克隆抗体抑制水平 +0"#%-"/' &"#%.1 标品浓度 %5 &&((& 空白 7'&2 4% 抗体灵敏度与特异性 采用间接竞争 56 " 检测抗 单克隆抗体对伏马菌素 7 的抑制 由表 中的试验数据按照 的方法作标准曲线 结果见图 标准曲线的线性范围为 %5 回归线方程 % = 60 %5 检出限为 %5 完全抑制时的浓度为 %5 说明以上制备的抗 %" 对 具有较高的灵敏度 该 %" 与伏马菌素 7 和 7 黄曲霉毒素 7 和 ; " "3; 1 毒素 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 4 玉米赤霉烯酮 + 赭曲霉毒素 1" 等真菌类毒素及载体蛋白 7 " 和 A" 的交叉反应的测定方法参见 结果见表 说明该抗体与 的亲和力很强 具有较高的特异性 同时 可用于检测结构类似物 回收率的测定 为了评估本研究建立的对 的免疫学检测方法的准确性 对回收率及变 表 抗 /' 单克隆抗体与其他竞争物的交叉反应 +0+##"#%-"/' (# "0#- 竞争物 0% &&' 半数抑制浓度交叉反应率 : %5 0&( 60 " "3; " 7 " A"

7 期 姚静静等 伏马菌素 7 单克隆抗体的制备及免疫学检测方法初步应用 图 抗 /' 单克隆抗体的抑制曲线 /-)+"#%-"/' 异系数进行测定 方法参见 结果见表 结果表明 测定 %5 的标准液 次 测定值在 %5 平均值为 %5 回收率在 :: 平均值为 : 变异系数为 : 说明已建立的检测方法具有较高的准确性 与 #50; 检测结果的对比 采用本研究建立的 检测方法与 #50; 法分别对 个霉变的玉米样品 测定结果见表 将两种方法的检测结果进行单因素独立 检验分析 说明差异不显著 说明该 56 " 对 的测定结果具有较高可靠性 表 回收率测定结果 +0+0##& 序号 测定值 %5 1 回收率 : ( 序号 测定值 %5 1 回收率 : ( 序号 测定值 %5 1 回收率 : ( 平均值 表 本检测方法与.61 测定结果对比 A +0+#%#"#.1(.61 A 样品编号 56 " 测定值 #50; 测定值 &%' 156 " 1#50; 每种方法测 次 1&& )(&'(&&% % 讨 论伏马菌素 7 作为一种相对分子质量只有 的小分子真菌毒素 获得该毒素的抗体 合成 的人工抗原就显得尤为重要 的分子结构式 图 含有 个羧基 个氨基和 个羟基 可采 用 40 法或戊二醛法直接与载体蛋白 7 "A" 偶联 制备免疫原 7 " 和包被原 A" 鉴于戊二醛法是通过醛基与氨基形成亚胺键的偶联 而亚胺键在水溶液会发生水解 导致 从载体蛋白上脱离 同时 由于 分子中的氨基活性远高于载体蛋白中的氨基 极易发生 的自联 本研究采用 40 法 采取 407 " A" 的物质的量之比为 进行偶联 以尽量避免 的自联 获得人工抗原 7 " 和包被原 A" 得到高特异性和亲和力的单克隆抗体证实了人工抗原合成上的成功 关于该抗体的灵敏度 采用间接竞争 56 " 检测抗 单克隆抗体的抑制效价 标准曲线的回归线方程为 % = 60 %5 检出限为 %5 完全抑制时的浓度为 %5 相比于早期报 道的抗 单克隆抗体而言 该抗体具有更高

8 畜 牧 兽 医 学 报 卷 的灵敏度 结合胶体金层析技术 有望建立灵敏度更高的免疫学快速检测 的方法 更方便 快捷地检测玉米及其制品中伏马菌素的含量 对抗体特异性的检测 本研究选择了几种常见的污染谷物的真菌毒素及伏马菌素 7 7 与抗 %" 进行交叉反应 其中与其他种类的真菌毒素的交叉反应率均 : 不干扰 的检测 与 的交叉反应率分别为 : 和 : 可能由于伏马菌素是一类长链状的小分子 与 相比 在结构上少了一个羟基 # 图 这样的微小差别对分子的结构和性质的影响较小 相应的动物产生的免疫应答的差别会较小 这是该抗 单克隆抗体与 交叉反应率较高的原因 考虑到 是伏马菌素的主要成分 也是毒性最强的组分 以上交叉反应的存在并不影响该单克隆抗体在检测 中的使用 同时可用于检测 的累计含量 基于该单克隆抗体建立的 56 " 检测方法 样品回收率在 : : 平均值为 : 变异系数为 : 与 #50; 的检测结果对比 差异不显著 说明该方法具有较高的准确性和可靠性 结 论作者通过合成人工抗原 免疫小鼠 细胞融合及筛选 成功获得能够稳定分泌抗 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 并制备灵敏度较高 60 %5 亲和力和特异性均较好的抗 %" 基于该单克隆抗体建立的 56 " 检测方法具有较高的准确性和可靠性 希望该抗体可以结合胶体金免疫层析技术 建立灵敏度更高的快速检测 的方法 &'/')%(&%& (&(&(.& -6" "7 "06 " ;&' '2(&'%&'&(&5;%7 &7"&"0" +;7 +>.>AE0 ;>AE0 3#; &'6&%& (%7%'& ''%&'"."+-+#"- ##?"3&'( %7 #5"('&&&& (&)&-('- 1# / ;(&%& &&'&''&'&'&+ "" 6"06&&'"(&(0&( 3%76"053&( /"-.# 0 #+#- #&'0&&(& &(%&% 7( &% '# 王军淋 胡玲玲 蔡增轩 等 超高压液相色谱法同时检测玉米中的伏马毒素 777 食品安全质量检测学报 /"-5#? 5 50"6+ &'%'& %&%77&7 %& '&'(%&&# / % 2#% 0 李正翔 陈小龙 曹赵云 等 液相色谱 串联质谱法 测定粮谷中的伏马毒素 分析测试学报 参考文献 ".4#"; /-5475; / 0 "1#65 -&'(&&'((( %7&%((3&% %' %(/& #6 / 1"77" # >"7?>""; ; &'3%&((& %&'%%&(%%(&%& # ##"4-1#65-10> 1; 56+0# 50"+.&'4%& %(&''(%&& &% %&(%# "+ ##%""0 王 君 伏马毒素 7 免疫学检测方法的研究 4 上海 上海交通大学 /"- %%&&% 7 4&&&&&1? 0 王 耀 伏马菌素 7 免疫学快速检测方法的研究

9 期 姚静静等 伏马菌素 7 单克隆抗体的制备及免疫学检测方法初步应用 4 河南 河南科技大学 /"-.%7%%&&& ( %4#&#&? ((&1('0 江 涛 王玉平 韩春卉 等 抗伏马菌素 7 单克隆抗体的制备和特性 军事医学科学院院刊 6"-1/"-.#"0 #&'4'% %('&'&&&%7 0# % '#% '#+ "0 江 涛 宫慧之 李凤琴 等 抗伏马菌素 7 单克隆抗体的制备及试剂盒的研制 卫生研究 6"- 1-- # +563 &'4'% %('&'& &&% 7 & 56 "2&&&&'% 7 # -%" 0 许金俊 陈 飞 秦爱建 等 抗伏马菌素 7 单克隆抗体的制备与特性鉴定 细胞与分子免疫学杂志?0#36 "&'-&& (&%('&'&&&% 7&"# &## '#+ ##%0 王 莹 郑 浩 何成华 等 伏马菌素 7 单克隆抗体的制备及鉴定 中国农业科学 /"-.+#- ##0 #&'-&& (& %('&'&&& %7# 0 许 杨 邹 龙 刘师文 等 伏马菌素 7 单克隆抗体制备及化学发光免疫检测方法的建立 分析化学?.+? 556? /&'(% ('&'& ( % 7 (%'%((%'2%%& &&&"# #%#&"% 0 宫慧芝 抗伏马菌素 7 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及 56 " 试剂盒的研制 4 沈阳 中国医科大学 -- # +4'%%&('' ( %('&'&&&% 7 &56 "24&0& ;(&'?0 宫慧芝 计 融 杨 军 等 伏马菌素 7 单抗 56 " 检测试剂盒研制 中国公共卫生 -- # +6."- &'4'% 56 "2&&&&'% 7 &"# )#-# 0 樊海新 李寒松 李复辉 等 伏马菌素 7 胶体金免疫层析试纸条的研制 南京农业大学学报 3" # 56 # 563 #&'4'% '%%(%&&(%& %7 # 7 + ##"% 0.? 56#560 5&'-'&&('& '&&'')%%&&)'&% '& ( % 7 & &''/&# 刘晓波 蔡美英 王 霞 等 一种简单实用纯化腹水 ;(" 方法 辛酸 硫酸铵法 华西医科大学学报 56? 70"6;./"- &'%'& ( %(&6- ;("% %(&((&'(&(&%%%'&( &# 3"&"% '+ #"0 万文徽 董志伟 单克隆抗体亲和常数的测定 单克隆抗体通讯 /" / #4-+ /4%&& (& %('&'&# '##)%0 编辑 白永平

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