148 激光生物学报第 25 卷 screening.result:therecombinantproteinwasthehumanprocalcitonin,whichhadgoodimmunoreacitvityandimmu nogenicity,and7monoclonalantibodie

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胡驯施
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1 第 25 卷第 2 期 2016 年 4 月激光生物学报 ACTA LASER BIOLOGY SINICA Vol.25No.2 Apr.2016 doi: /j.isn 降钙素原的原核表达及单克隆抗体制备郑姣 1a,b, 邱义兰 1b, 廖晶 1a, 李晓丹 1a, 张坚松 1a, 吴意 1c, 何赛 1b, 梁湘辉 2, 郭向荣 1b 1a, 刘如石 (1. 湖南师范大学 a. 医学院 ;b. 生命科学学院 ;c. 第一附属医院, 湖南长沙 ; 2. 中南大学湘雅医院, 湖南长沙 ) 摘要 : 目的 : 高效表达与纯化可溶性重组人 PCT 蛋白, 制备高灵敏度和高特异性的抗人 PCT 医用诊断单克隆抗体方法 : 大肠杆菌表达重组人 PCT 蛋白后, 利用饱和硫酸铵沉淀和亲和层析方法纯化 PCT 蛋白后, 经质谱 Westernblot 和间接 ELISA 法进行性质鉴定和分析重组蛋白的表达与免疫反应性 ; 重组蛋白免疫小鼠, 经细胞融合及筛选制备抗 PCT 单克隆抗体 (mab) 结果 : 在大肠杆菌中高效表达了人 PCT 蛋白 ; 重组人 PCT 蛋白具有良好的免疫反应性与免疫原性 ; 经筛选获得 7 株抗 PCT 单克隆抗体细胞株, 经 ELISA 鉴定, 筛选抗体可与 PCT 抗原有良好的特异性反应结论 : 利用重组人 PCT 蛋白免疫制备了抗人 PCT 单克隆抗体, 为进一步研发 PCT 快速诊断试剂提供了原料关键词 : 降钙素原 ; 原核表达 ; 酶联免疫吸附 (ELISA); 纯化 ; 单克隆抗体 (mab) 中图分类号 :R392 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) ProkaryoticExpresionofProcalcitoninandPreparationof Anti procalcitoninmonoclonalantibody ZHENGJiao 1a,b,QIUYilan 1b,LIAOMinjing 1a,LIXiaodan 1a,ZHANGJiansong 1a,WUYi 1c, HESai 1b,LIANGXianghui 2,GUOXiangrong 1b,LIURushi 1a (1.HunanNormalUniversity a.schoolofmedicine;b.colegeoflifesciences;c.thefirstafiliatedhospital; Changsha410081,Hunan,China;2.XiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410008,Hunan,China) Abstract:Purpose:RecombinanthumanPCTwaseficientlyexpresedinE.coli,andwaspurified,andthenthehigh lysensitiveandspecificmonoclonalantibodies(mab)againstpctwereprepared,whichcanbeusedasdiagnosticraw materialsforinfectiousdiseases.method:therecombinantpctwaspurifiedwithsaturatedammoniumsulfateprecipita tionandafinitychromatographymethod,andthentherecombinantproteinwasconfirmedbymasspectrometry.west ernblotandindirectelisaasaywasusedtodetecttheimmunoreactivityoftherecombinantprotein.themicewereim munizedwiththerecombinantprotein,andanti PCTmonoclonalantibodies(mAb)werepreparedbycelfusionand 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 湖南省科技计划重点研发计划 (2015SK20332,2015SK20665); 湖南省教育厅高等学校科研项目 (15C0829); 湖南省自然科学基金项目 (09J5027) 作者简介 : 郑姣 (1990-), 女, 微生物学硕士研究生通讯作者 : 刘如石 (1971-), 男, 博士, 教授, 硕士生导师, 主要从事抗体与基因工程药物研究 ( 电话 ) ;( 电子邮箱 )liurushi@hunu.edu.cn; 郭向荣 (1963-), 男, 博士, 教授, 博士生导师 ( 电子邮箱 )xrguo@hotmail.com

2 148 激光生物学报第 25 卷 screening.result:therecombinantproteinwasthehumanprocalcitonin,whichhadgoodimmunoreacitvityandimmu nogenicity,and7monoclonalantibodiesagainsthumanpctwereobtained,andelisaindicatedtheantibodieshada goodspecificityandsensitivitytopctantigen.conclusion:highlysensitiveandspecificanti PCTmonoclonalantibody waspreparedforrecombinanthumanpct,whichwilprovidearawmaterialforthedevelopmentofpctrapiddiagnostic reagent. Keywords:procalcitonin;ProkaryoticExpresion;enzyme linkedimmunosorbentasay(elisa);purification; monoclonalantibody(mab) 降钙素原 (procalcitonin,pct) 是降钙素 (calcito nin,ct) 的前肽物, 无激素活性, 由 116 个氨基酸组成, 相对分子质量约为 13kD 的糖蛋白在空间结构上, 通过生物信息学软件预测有三种可能的空间结构 ( 图 1) PCT 半衰期为 20~24h, 在体内外稳定性很好在正常生理情况下, 健康人血液中 PCT 含量通常极低, 小于 0.10ng/mL [1] 当出现严重真菌细菌寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时, 血清中 PCT 的含量会迅速升高, 甚至会蹿升至正常情况下的 5000 倍 [2] 但过敏和病毒感染以及自身性免疫疾病不会引起血清中 PCT 升高, 局部细菌感染和慢性炎症同样不会导致血清 PCT 水平的明显变化 [3,4] 且在败血症脓毒血症等疾病中,PCT 是一种非常敏感的特异性诊断标志物, 并可反映其严重程度 [5,6] 在全身性炎症反应时,PCT 较 CRP IL 6 等其它炎症因子而言, 窗口期短, 约 2h 后可监测到, 而且 PCT 增长快速,12~48h 达到峰值, 这在早期检测中具有明显的优势 [7] 近年来还发现,PCT 与常用的血培养 CRP IL 6 等感染指标比较, 具有一定的优越性, 其可以监测疾病治疗的效果, 指导抗生素的应用, 并减少临床非必需抗生素的使用和抗生素的使用时间, 降低细菌耐药率和不良反应发生率 [8,9] 此外,PCT 半衰期较长, 能在一段时间内维持在高水平, 之后其含量随着病情恢复逐渐下降, 且恢复至正常水平所需时间比 CRP 短, 这有利于快速反映治疗效果随着不断深入的研究和大量临床资料的积累,PCT 测定现已广泛应用于临床感染性疾病的诊断和疗效判断, 也可用于 ICU 病房血液科肿瘤科儿科新生儿监护室外科内科和器官移植科等 [10,11] 在感染性临床诊断和治疗中, 传统检测指标如体温白细胞计数 (WBC) 和 CRP 的灵敏性和特异性均不高 [12], 而 PCT 与过去的生物学标记物相比, 具有较理想的准确性和特异性 [13] 因此,PCT 水平的检测有助于临床的早期诊断和制定合理的治疗方案尽管目前我国对 PCT 的研究做了很多工作, 其作为一种感染标志物已得到临床的普遍重视与认可, 但大部分研究集中于 PCT 的临床应用观察 [14,15] 目前使用的 PCT 试剂部分由国外进口, 价格昂贵 [16] ; 国内也有相关 PCT 的检测产品, 但其检测关键原料在一定程度上仍依赖进口, 本实验通过重组表达纯化 PCT 并制备单克隆抗体, 为 PCT 的基础研究和下一步研发低成本快速诊断试剂提供重要材料图 1 PCT 空间结构图 Fig.1 Three dimensionalstructureofpct 1 材料与方法 1.1 材料动物和细胞株 BALB/c 小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司 ; 降钙素原表达质粒由厦门大学夏宁邵教授惠赠 ; 大肠杆菌 E.coliTop10F ER2566 菌株由本实验室保存主要试剂 HRP 羊抗鼠二抗由厦门大学夏宁邵教授惠赠, 抗 PCT 多克隆抗体购于 Proteintech 公司, 质粒提取试剂盒 Ni IDAResin 和胎牛血清购自上海生工生物工程股份有限公司, 蛋白质相对分子质量标准购自 Thermo 公司,HRP DAB 底物显色试剂盒和 BCA 蛋白定量试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司,RPMI 1640 培养基购自美国 GIBCO 公司,HT 和 HAT 以及弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂为美国 Sigma 公司产品

3 第 2 期郑姣等 : 降钙素原的原核表达及单克隆抗体制备方法目的蛋白小量表达与活性鉴定先将 PCT 表达质粒转化到 ER2566 感受态细胞中, 再接种 PCT 的阳性菌株到 3mLKn + LB 液体培养基中 37 培养至 OD 600 值约为 0.6 时, 加入 IPTG 至终浓度为 200μg/mL 进行诱导表达, 同时以加 IPTG 诱导的转化空母体质粒菌株作为阴性对照, 其它培养条件均一致, 然后 37 诱导培养 4 h, 室温 12000g 离心 1min 收集菌体, 制备蛋白样品进行 12% 的 SDS PAGE 电泳切取 SDS PAGE 上表达重组蛋白, 进行质谱鉴定重组蛋白的质谱鉴定 [17] 重组蛋白经消化酶解后经由德国 Bruker 公司的电喷雾四极杆飞行时间串联质谱 MicroTOFQ Ⅱ 进行质谱分析, 配备戴安公司 UltriMate3000 毛细管液相色谱仪 (NanoLC) 和纳升 (Nano) 喷雾源, 所有分析都在正离子模式下进行雾化气为氮气, 碰撞气为氩气, 温源 150, 锥孔电压为 1200V 仪器的 MS 和 MS/MS 的转换通过 microtofcontrol3.0 软件自动进行样品经过 C18 预柱 (5mm 320 μm) 脱盐和浓缩后, 经过 5% 40% 的乙腈乙酸液 ( 乙晴乙酸体积比为 1 1) 梯度洗脱 C18 毛细管柱进行肽段分离, 流速为 300nL/min 分离肽段直接进入离子源一次选择三个最大强度的肽段进行 MS/MS 分析, 获得的数据输入数据库 (NCBInr), 使用 Mascot 软件 (MatrixScienceLtd.,UK) 中的串联质谱数据库搜索功能进行搜索重组蛋白的大量表达与鉴定将重组表达菌株接种到 50mLLB(Kn + ) 培养基中培养 12h, 然后以 2% (V/V) 的比例接种至 1L Kn + LB 液体培养基中培养待菌液 OD 600 值达到 0.6, 加入 IPTG 至终浓度为 200μg/mL37 进行诱导表达 4h 后,12000g 离心 8min 收集菌体加入 50mL 裂解液 (50mmol/LTris HCl,1mmol/LED TA,100mmol/LNaCl,pH8.0),Ф10mm 探头 200W 功率超声破碎细胞 12000g 离心 10min, 分别收集上清和沉淀制成蛋白样品, 通过 SDS PAGE 鉴定 PCT 蛋白在大肠杆菌细胞中的表达方式重组蛋白的纯化将上清转移到烧杯, 按公式 V 3 =V (100 Q 1 )/ (Q 1 Q 2 )(V 代表上清体积 ;Q 1 代表此次的硫浓度 ; Q 2 代表前一次硫浓度 ;V 3 代表加入的饱和硫酸铵体积 ) 缓慢滴入饱和硫酸铵 (ph 7.4), 在冰上搅拌 30min,4 静置 2h, 然后 4,12000g, 离心 10 min, 用 PBS(pH7.4) 将沉淀溶解依次进行 20% 30% 40% 50% 60% 五个梯度硫酸铵盐析纯化重组 PCT 蛋白, 收集样品进行 SDS PAGE 鉴定用 5 到 10 倍柱体积的 bufer0(50 mmol/l NaH 2 PO 4,300mmol/LNaCl,pH8.0) 以 1mL/min 的速度平衡 Ni IDA 柱 PBS 溶解的重组 PCT 蛋白上样于 Ni IDA, 然后用 bufer0 过柱, 再依次用 bufer0 配制的 mM 的咪唑梯度洗脱重组蛋白, 流速为 1mL/min 洗脱液于 4 用 PBS(pH7.4) 透析去除咪唑, 收集样品 SDS PAGE 鉴定以 0.5mL/min 的流速用 10 倍柱床体积的流动相 PBS(pH7.0) 平衡 TSK GELG3000SW 层析柱至 280nm 吸收值无明显变化, 将检测器吸收值归零, 然后加入咪唑洗脱透析后的蛋白样 2mL, 以 0.5mL/ min 的流速进行分子筛层析, 收集 280nm 处吸收值大于 0.5AU 的蛋白峰,SDS PAGE 和 Westernblot 分析鉴定收集的蛋白峰间接 ELISA 检测重组蛋白的免疫反应性将纯化后的重组蛋白用 CB 稀释液 (15mmol/L Na 2 CO 3 35mmol/LNaHCO 3 ) 稀释至浓度为 0.5mg/L, 然后包被到 ELISA 用 96 孔板,4 过夜 ; 洗板 1 次后, 加入 200μLED 封闭液,37 放置 2h; 洗板 5 次, 加入比例稀释的抗 PCT 多克隆抗体, 37 孵育 30min; 洗板 5 次, 加入 HRP 羊抗兔二抗, 37 孵育 30min; 洗板 5 次, 最后加入 TMB 底物显色剂,37 反应 10min, 加入终止液终止反应, 最后双波长 (450nm/630nm) 进行检测 PCT 重组蛋白动物免疫将纯化后的 PCT 蛋白用 PBS 缓冲液透析后, 稀释至 1mg/mL, 按每只小鼠 30μg 50μg 100μg 和 150μg 四个剂量, 然后分别按 1 1 加入弗氏完全佐剂充分乳化采用皮下多点免疫的方法, 进行初次免疫, 每个剂量免疫 3 只小鼠两周后, 进行加强免疫时,1 1 加入蛋白溶液和弗式不完全佐剂, 充分乳化后以同样剂量免疫小鼠共进行 2 次加强免疫, 每次间隔 2 周, 每次免疫前一天收集小鼠血清进行间接 ELISA, 以检测 PCT 重组蛋白的免疫原性及血清抗体效价第三次免疫 8d 后, 小鼠尾静脉采血, 4,4000g 离心 5min, 取上清, 间接 ELISA 法检测血清效价, 选取血清效价最高的小鼠, 在融合前 4d 进行脾脏加强免疫, 剂量为每只小鼠 50μgPCT 蛋白,2d 后尾静脉注射 20μg 蛋白

4 150 激光生物学报第 25 卷细胞融合阳性杂交瘤细胞筛选与亚克隆及亚型鉴定将生长状态良好的 SP2/0 骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾脏细胞分别用无血清 1640 培养基洗涤至没有大颗粒沉淀后, 以 1 5~1 10 混合,1200g 离心 1min, 弃上清轻摇离心管使细胞均匀分散后, 缓缓加入 1mL37 预热的 PEG1500 并轻轻吹打混匀, 60s 后, 立即加入预热的 20mL1640 培养基终止融合, 然后加入 20% FBS HAT 1640 培养基悬浮细胞并混匀将混匀后的培养基均匀铺于 96 孔板中, 置于 5% CO 2,37 的培养箱中培养, 每天跟踪观察, 融合后 7~10d 用 10% FBS HT 1640 培养液换液, 当克隆长至孔底面积的 1/3~1/2 时, 用间接 ELISA 方法检测杂交瘤细胞上清液抗体效价, 通过有限稀释法对阳性值高且细胞集落数目少的孔进行克隆化经过 4 次亚克隆后, 即得到能稳定分泌特异性的阳性单克隆细胞株, 然后转移至 24 孔细胞培养板中扩大培养, 再取细胞上清进行亚型鉴定单克隆抗体的纯化与鉴定取 8 10 周龄 BALB/c 小鼠, 先腹腔注射无菌石蜡油, 每只 0.5mL 7d 后向腹腔内注入杂交瘤细胞, 调整细胞密度为 /ml, 每只小鼠大约注射 0.5mL 8 10d 后即开始采集腹水将采集好的腹水 1 1(V/V) 缓慢加入饱和硫酸铵, 冰上搅拌 30min,4,12000g 离心 10min 后弃上清沉淀用一定体积的 PBS 溶解, 移至透析袋中透析平衡至 20 倍体积的 Bindingbufer(ProteinASefinoseKit 中提供 ) 中以除去高浓度的离子, 然后用蛋白 A 柱纯化将纯化前与纯化后的腹水抗体经 SDS PAGE 电泳将纯化后的人重组 PCT 蛋白用 CB 稀释液 (15 mmol/lna 2 CO 3 35mmol/LNaHCO 3 ) 稀释至浓度为 1μg/mL, 然后包被到 ELISA 用 96 孔板,37 2h; 洗板 1 次后, 加入 200μLED 封闭液,37 放置 2h; 洗板 5 次, 加入比例稀释的纯化后的抗 PCT 单克隆抗体,37 孵育 30min; 洗板 5 次, 加入 HRP 羊抗鼠二抗,37 孵育 30min; 洗板 5 次, 最后加入 TMB 底物显色剂,37 反应 10min, 加入终止液终止反应, 最后双波长 (450nm/630nm) 进行检测 2 结果与分析 2.1 重组蛋白的诱导表达将诱导的重组菌株和阴性对照组菌株制备蛋白样品进行 SDS PAGE, 比较经 IPTG 诱导的重组菌株的实验组和加 IPTG 诱导的转化空母体质粒菌株的对照组, 结果显示, 诱导后的 PCT 重组菌株表达了一大小约 13kD 的蛋白条带 ( 图 2lane2 ~3), 而在对照组中没有出现这一条带 ( 图 2lane1), 而且表达蛋白相对分子质量与预期 PCT 蛋白大小一致, 初步说明重组基因在大肠杆菌中获得了有效表达 lanem: 预染色蛋白质相对分子质量标准 ;lane1: 加 IPTG 诱导的转化空母体质粒菌株表达的总蛋白 ;lane2 ~3: 加 IPTG 诱导的重组菌株表达的总蛋白 lanem:prestainedproteinladder;lane1:totalproteinex presionofe.colitranfectedpto T7withIPTGinduction; lane2~3:totalproteinexpresionofe.coliwithiptgin duction 图 2 SDS PAGE 鉴定重组蛋白 Fig.2 IdentificationofrecombinantproteinbySDS PAGE 2.2 质谱法检测重组蛋白性质重组蛋白电泳分离, 胰酶消化后, 再进行质谱仪分析, 将得到的数据输入数据库进行匹配分析, 结果显示检测蛋白与数据库中 PCT 蛋白高度一致 ( 图 3) 软件分析结果显示,Proteinscore 为 282( 表 1), 结果可靠多肽的蛋白覆盖率达到 40%, 同时也表明质谱分析结果可信度较高, 质谱结果显示 PCT 重组蛋白的相对分子质量约为 15572D, 与天然 PCT 蛋白的相对分子质量大小完全一致, 这也进一步提高了 PCT 重组蛋白的可信度

5 第 2 期郑姣等 : 降钙素原的原核表达及单克隆抗体制备 151 表 1 质谱分析重组 PCT 的性质与可信度 Tab.1 Theconfidenceandcharacteristicofrecombi nantpctbymasspectroscopy Protein name MW pi Mascot Score Number ofmatching peptide Protein sequence coverage PCT (7) 40% Notes:MW:molecularweigh;pI:isoelectricpoint 图 3 质谱鉴定 Mascot 得分直方图 Fig.3 Analysisofrecombinantproteinbymasspec trometry 2.3 重组蛋白表达方式鉴定及纯化将细胞进行超声波破碎后, 取少量悬液离心, 分别收集上清和沉淀制成蛋白样品通过 SDS PAGE 检测后, 结果显示, 目的蛋白主要分布在上清中 ( 图 4Alane2) 因此取表达菌株破碎后的细胞上清, 先进行 20% 60% 的饱和硫酸铵沉淀的粗纯化, 分别取样进行 SDS PAGE 鉴定结果显示, 重组蛋白主要沉淀在 20% ~30% 的饱和硫酸铵中 ( 图 4Blane2~ 3) PBS 溶解后的 PCT 蛋白用 Ni IDA 柱亲和层析纯化,SDS PAGE 显示 PCT 的纯度很高, 只有较少的其它杂带 ( 图 6lane2~5), 为进一步纯化 PCT 达到动物免疫抗原的要求, 采用分子筛层析, 收集保留时间为 7~9min 的蛋白, 进行 SDS PAGE 结果发现, 通过 TSK GELG3000SW 层析柱纯化的 PCT 蛋白从 SDS PAGE 上显示没有杂带, 纯度很高 ( 图 6lane6 和图 7Alane1), 达到电泳纯度, 满足动物免疫的要求层析色谱图为图 5, 而且 Westernblot 结果显示纯化后的 PCT 蛋白仍保持着较好的免疫反应性 ( 图 7B Lane1) 2.4 间接 ELISA 检测重组蛋白反应灵敏度用 0.5μg/mL 的 PCT 重组蛋白包被 ELISA 板, 以 PBS 为对照, 加入抗 PCT 多克隆抗体进行 ELISA 检测, 结果显示, 低浓度 PCT 可与抗体发生免疫反应, 以阴性值的 2.1 倍设为临界值, 结果表明该重组 4A: 重组 PCT 表达方式 (lanem: 预染色蛋白质相对分子质量标准品 ;lane1: 加 IPTG 诱导的重组菌株表达的总蛋白 ;lane2: 离心上清 ;lane3: 离心沉淀 );4B: 重组 PCT 硫酸铵沉淀 (lanem: 预染色蛋白质相对分子质量标准品 ;lane1: 加 IPTG 诱导的转化空母体质粒菌株表达的总蛋白 ;lane2:20% 硫酸铵沉淀 ;lane3: 30% 硫酸铵沉淀 ;lane4:40% 硫酸铵沉淀 ;lane5:50% 硫酸铵沉淀 ;lane6:60% 硫酸铵沉淀 ) 4A:Expresionform ofrecombinantpctine.coli(lane M:Prestainedproteinladder;lane1:Totalproteinsex presionofe.coliwithiptginduction;lane2:totalpro teinsinsupernatant;lane3:totalproteinsinprecitati on);4b:ammoniumsulfateprecipitationofrecombinant PCT(laneM:Prestainedproteinladder;lane1:Totalpro teinexpresionprofileofe.colitranfectedpto T7with IPTGinduction;lane2:20% ofammoniumsulfateprecip itation; lane 3:30% ammoniumsulfate precipitation; lane4:40% ofammoniumsulfateprecipitation;lane5: 50% ofammoniumsulfateprecipitation;lane6:60% of ammoniumsulfateprecipitation) 图 4 重组 PCT 在大肠杆菌中表达方式及硫酸铵沉淀 Fig.4 IdentificationofrecombinantPCTexpresionform in E. coli and the SDS PAGE result of ammoniumsulfateprecipitation 蛋白具有较高的反应灵敏度 ( 表 2), 该结果也进一步说明该重组抗原具有良好免疫反应性, 而且具有作为检测抗 PCT 抗体的潜力, 也可以用来制备检测抗 PCT 抗原的医用诊断单克隆抗体表 2 间接 ELISA 检测 PCT 重组蛋白免疫反应性 Tab.2 Theimmunoreactivityofrecombinantprotein PCTdetectedbyindirectELISA Antigen concentration/ (μg ml 1 ) Absorptionvalue(OD)

PAGEofpurifiedPCTprotein;7B:Detection ofimmunereactivityofpurifiedpctproteinbywestern blot(lanem:prestainedproteinladder;lane1:protein purifiedbytsk GELG3000SW) 图 7 纯化蛋白纯度与免疫反应性检测 Fig.

6 152 激光生物学报第 25 卷图 5 PCT 蛋白层析色谱图 Fig.5 PCTproteinpurificationbygelfiltrationchro matogram 7A:SDS PAGE 鉴定纯化后 PCT 蛋白 ;7B:Western blot 鉴定纯化后 PCT 蛋白免疫反应性 (lanem: 预染色蛋白质相对分子质量标准品 ;lane1: 分子筛层析纯化后的蛋白 ) 7A:SDS PAGEofpurifiedPCTprotein;7B:Detection ofimmunereactivityofpurifiedpctproteinbywestern blot(lanem:prestainedproteinladder;lane1:protein purifiedbytsk GELG3000SW) 图 7 纯化蛋白纯度与免疫反应性检测 Fig.7 Immunoreactivity detection ofpct protein afterpurification lanem: 预染色蛋白质相对分子质量标准品 ;lane1: 30% 硫酸铵沉淀 ;lane2 ~5:Ni IDAresin 纯化后的蛋白 ;lane6: 分子筛层析纯化后的蛋白 lanem:prestainedproteinladder;lane1:30% ofam moniumsulfateprecipitation;lane2~5:proteinpurified byni IDAresin;lane6:ProteinpurifiedbyTSK GEL G3000SW 图 6 PCT 蛋白纯化后鉴定 Fig.6 IdentificationofproteinPCTafterpurification 2.5 间接 ELISA 检测重组蛋白免疫原性通过间接 ELISA 试验检测 PCT 免疫小鼠血清抗体效价, 阴性对照为小鼠免疫前血清, 以 2.1 倍阴性值设定为临界值来判定是否为阳性值, 小鼠在初次免疫后体内抗体水平较低, 在第二次和第三次加强免疫后可以明显的发现血清阳性值上升较快, 且差异有统计学意义 (P<0.05)( 图 8), 说明 PCT 重组蛋白能在小鼠体内引起较强的免疫反应, 作为抗原具有良好的免疫原性, 在第三次免疫之后, 百万倍稀释后血清中抗 PCT 抗体效价已高达 1.0 以上 ( 图 8), 此时已达到制备单克隆抗体的要求 2.6 细胞融合阳性杂交瘤细胞筛选与亚克隆及亚型鉴定细胞融合后, 用间接 ELISA 方法检测杂交瘤细胞上清液抗 PCT 抗体效价, 通过有限稀释法对阳性值高且细胞集落数目少的孔进行克隆化经过 3~4 次克隆化后, 目前已获得了能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株 7 株, 取细胞上清进行抗体亚型鉴定, 将这些细胞株部分用于单克隆抗体的制备, 部分于液氮罐内冻存亚型鉴定结果显示为 :7H8 2D3 7F9 亚型为 IgG1;8E12 4G9 8E6 亚型为 IgG2a;3F9 亚型为 IgG2b( 图 9) 2.7 单克隆抗体的纯化与鉴定 SDS PAGE 鉴定纯化后的抗体, 出现了三条带 :

第 2 期郑姣等 : 降钙素原的原核表达及单克隆抗体制备 153 因此,100kDa 的条带为重链与重链的聚合体, 原因是两条重链间的二硫键没有完全破坏从凝胶上看不到其它杂蛋白条带, 这说明经亲和柱层析后, 单克隆抗体达到了相当高的纯度, 可以用于后续实验以纯化的人重组 PCT 为抗原, 将 7 株纯化后的抗 PCT 单克隆抗体按 1 5000 稀释后进行间接 ELISA 检测,

7 第 2 期郑姣等 : 降钙素原的原核表达及单克隆抗体制备 153 因此,100kDa 的条带为重链与重链的聚合体, 原因是两条重链间的二硫键没有完全破坏从凝胶上看不到其它杂蛋白条带, 这说明经亲和柱层析后, 单克隆抗体达到了相当高的纯度, 可以用于后续实验以纯化的人重组 PCT 为抗原, 将 7 株纯化后的抗 PCT 单克隆抗体按稀释后进行间接 ELISA 检测, 结果显示纯化后的 7 株单抗全为阳性 ( 表 3) 1~4: 分别以 μgPCT 蛋白免疫小鼠 1~4:Miceimmunizedwith μgPCT proteinrespentively 图 8 间接 ELISA 检测小鼠血清中抗体效价 Fig.8 Antibodytitersofserum inmicedetectedbyin directedelisa 图 9 单克隆抗体亚型鉴定 Fig.9 Subtypeidentificationofanti PCTmonoclonalanti bodies 50kDa 的重链 25kDa 的轻链和约 100kDa 大小的条带, 但不煮沸时主要为 100kDa 的条带, 煮沸后重链条带明显变强,100kDa 的条带变弱, 且大小是重链的两倍, 煮沸前后轻链条带强弱相差不大 ( 图 10), lanem: 预染色蛋白质相对分子质量标准 ;lane1: 未煮沸的纯化前腹水 ;lane2: 煮沸的纯化前腹水 ;lane 3: 未煮沸的纯化后单克隆抗体 ;lane4: 煮沸的纯化后单克隆抗体 lanem:prestainedproteinladder;lane1:mouseasci tesunboiled beforepurified; lane2:mouseascites boiledafterpurified;lane3:monoclonalantibodyun boiled afterpurified; lane 4:Monoclonalantibody boiledafterpurified 图 10 单克隆抗体纯化 Fig.10 Purificationofmonoclonalantibody 表 3 间接 ELISA 检测单抗阳性率 Tab.3 DetectionofmonoclonalantibodypositiveratebyindirectELISA Numberofmonoclonalantibody 阴性 7H8 3F9 8E12 2D3 7F9 4G9 8E6 Absorptionvalue(OD)

8 154 激光生物学报第 25 卷 3 讨论 PCT 作为感染性疾病诊疗中用于协助早期诊断监测用药及预后的一种全新炎性标志物, 主要来源于甲状腺 C 细胞, 受细菌毒素 (LPS) 及多种炎性细胞因子调节 Asicot 等首次发现脓毒血症患者血液中 PCT 含量明显升高, 意味着 PCT 可作为炎症脓毒血症等细菌感染病症的血清学标志物 [18] 而脓毒症会议在 2000 年认定 PCT 是对脓毒症的诊断预后及监测性能最优异的生物标志物目前国内外 PCT 最新研究主要有 :Klinikum re chtsderisar 实验室与 BRAHMSAG 合作使用 E411 电化学发光免疫分析仪, 利用抗 PCT 单克隆抗体进行临床血清 PCT 的测定, 结果显示灵敏度很高而 Kremmer 用夹心 ELASA 法检测 PCT 的生物素化的抗 PCT 单克隆抗体, 结果显示, 与 BRAHMS 的电化学发光免疫测定方法相比, 同一测定结果下, 该实验所能检测到的 PCT 含量更低, 即灵敏度更高 [19] 研究人员 Wang 等将所获得的抗 PCT 单克隆抗体配对, 并建立双抗体夹心法, 应用于临床检测, 特异性高达 96.64%; 研发的抗体标记荧光胶乳后, 进行免疫层析平台配对成功, 建立了荧光胶乳免疫层析方法, 应用于临床检测, 特异性可达到 97.8% [20] ; 而且抗体用于电化学免疫检测方法,PCT 的检测下限可达到 0.5pg/mL [21] 目前临床中对 PCT 检测主要方法有荧光分析免疫法胶体金法和电化学发光法等, 这些方法的建立都依赖于高特异性和灵敏度的单克隆抗体, 但抗 PCT 高特异性和灵敏度的单克隆抗体的制备具有一定的难度, 目前国内优质的单抗很大程度上依赖于进口, 价格昂贵, 限制了 PCT 检测在国内临床上的推广使用, 而优质单抗的筛选首先要获得高纯度和蛋白构象正确的 PCT 蛋白本研究利用大肠杆菌表达经过密码子优化后的 PCT 序列, 结果显示 37 诱导 4h 即可获得可溶性高效表达, 经硫酸铵沉淀初步纯化后, 用 Ni IDA 柱进一步纯化,SDS PAGE 结果显示, 仅有少量的杂蛋白, 最后过分子筛层析纯化后, 即可得到纯度 99% 以上的 PCT 蛋白, 有利于后续单克隆抗体的制备与筛选本研究原核表达的人重组 PCT 蛋白序列为依大肠杆菌密码子嗜性优化后全基因序列, 囊括了根据生物信息学预测的所有的抗原表位, 且可溶性表达能很好的模拟天然蛋白构象, 刺激 B 细胞分泌多种不同表位的抗体, 为筛选特异性好亲和力高灵敏度高的抗体库提供了基础, 同时也为诊断试剂的研制提供了很好的原材料本研究通过对动物免疫这一关键步骤的把握, 保证了较好的阳性克隆率细胞融合后生长到孔底面积的 1/2 1/3 时进行亚克隆, 避免发生阳性细胞漏检和染色体丢失的情况采用操作简便的有限稀释法, 确保了杂交瘤细胞系的稳定性和抗体分泌效价高的特点经过 4 次克隆化, 获得的杂交瘤细胞阳性率均为 100% 得到的杂交瘤细胞株能稳定高效分泌抗人 PCT 单克隆抗体经过我们的初步评估, 本研究制备的单克隆抗体的成功研发将打破对国外降钙素原单克隆抗体产品的依赖性, 为开发优良的本土诊断试剂, 降低诊断试剂的成本奠定了良好的基础参考文献 [1] GENDRELD,BOHUONC.Procalcitonin,amarkerofbacterial infection[j].infection,1997,25(3): [2] LEEH.Procalcitoninasabiomarkerofinfectiousdiseases[J]. TheKorean JournalofInternalMedicine, 2013, 28(3): [3] GRAMMHJ,DOLLINGERP,BEIERW.Procalcitonin anew markerofinflammatoryhostresponse.serialstudiesinpatients withsepsisandperitonitis[j].chirurgischegastroenterologie, 1995,11: [4] MONNERETG,LABAUNEJM,ISAACC,etal.Procalcitonin andc reactiveproteinlevelsinneonatalinfections[j].acta Paediatrica,1997,86(2): [5] DANDONAP,NIXD,WILSONM F,etal.Procalcitoninin creaseafterendotoxininjectioninnormalsubjects[j].the JournalofClinicalEndocrinology&Metabolism,1994,79(6): [6] 黄彩芝, 莫丽亚, 李先斌, 等. 不同细菌感染所致脓毒症患儿血清降钙素原水平的研究 [J]. 国际检验医学杂志, 2010,31(10): HUANGCaizhi,MOLiya,LIXianbin,etal.Thelevelofserum procalcitonininchildrenwithsepsiscausedbydiferentbacteria [J].InternationalJournalofLaboratoryMedicine,2010,31 (10): [7] MEISNERM.Updateonprocalcitoninmeasurements[J].An nalsoflaboratorymedicine,2014,34(4): [8] FERRIEREF.Procalcitonin,anewmarkerforbacterialinfec tions[j].annbiolclin(paris),2000,58(1): [9] BECKERKL,SNIDERR,NYLENES.Procalcitoninasayin systemicinflammation,infection,andsepsis:clinicalutilityand limitations[j]. CriticalCare Medicine, 2008, 36(3): [10] BENOISTJF,MIMOZO,ASSICOTM.Laprocalcitonine

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材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人