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1 细 胞 生 物 学 实 验 指 导 细 胞 生 物 教 研 室

2 目 录 实 验 一 动 物 细 胞 的 基 本 形 态 观 察 和 显 微 测 量 1 实 验 二 线 粒 体 的 活 体 染 色 及 电 镜 照 片 观 察 4 实 验 三 液 泡 系 的 活 体 染 色 及 电 镜 照 片 观 察 6 实 验 四 细 胞 生 理 活 动 的 观 察 7 实 验 五 细 胞 组 分 的 化 学 反 应 11 实 验 六 细 胞 核 与 线 粒 体 的 分 级 分 离 14 实 验 七 细 胞 融 合 17 实 验 八 培 养 细 胞 的 形 态 观 察 和 计 数 19 实 验 九 细 胞 的 原 代 和 传 代 培 养 23 实 验 十 细 胞 中 微 丝 的 染 色 及 微 丝 与 细 胞 形 态 的 实 验 观 察 25 实 验 十 一 应 用 细 胞 融 合 技 术 制 备 染 色 体 提 前 凝 集 标 本 27 实 验 十 二 放 线 菌 素 D 诱 导 HL60 细 胞 凋 亡 的 实 验 观 察 29 实 验 十 三 MAPK 信 号 通 路 与 乳 腺 癌 细 胞 增 殖 及 可 能 机 制 的 探 索 性 实 验 36

3 实 验 一 动 物 细 胞 的 基 本 形 态 观 察 和 显 微 测 量 实 验 目 的 制 备 不 同 细 胞 的 临 时 制 片, 观 察 了 解 细 胞 的 基 本 形 态, 学 会 使 用 测 微 尺, 通 过 测 量 对 红 细 胞 的 进 化 进 行 分 析 实 验 用 品 一 材 料 和 标 本 蟾 蜍 一 只, 人 血 液 一 滴 二 器 材 和 仪 器 配 有 目 镜 测 微 尺 的 显 微 镜 一 台 载 片 十 张 盖 片 三 张 吸 水 纸 手 术 器 材 一 套 解 剖 盘 一 个 镜 台 测 微 尺 一 个 小 平 皿 一 个 牙 签 三 试 剂 1% 甲 苯 胺 兰 1% 甲 基 兰 Ringer 氏 液 ( 两 栖 类 用 ) 实 验 内 容 一 细 胞 的 基 本 形 态 观 察 ( 一 ) 原 理 细 胞 的 形 态 结 构 与 功 能 相 关 是 很 多 细 胞 的 共 同 特 点, 在 分 化 程 度 较 高 的 细 胞 更 为 明 显, 这 种 合 理 性 是 生 物 漫 长 进 化 过 程 所 形 成 的 例 如 : 具 有 收 缩 机 能 的 肌 细 胞 伸 展 为 细 长 形 ; 具 有 感 受 刺 激 和 传 导 冲 动 机 能 的 神 经 细 胞 有 长 短 不 一 的 树 枝 状 突 起 ; 游 离 的 血 细 胞 为 圆 形 椭 圆 形 或 圆 饼 形 不 论 细 胞 的 形 状 如 何, 细 胞 的 结 构 一 般 分 为 三 大 部 分 : 细 胞 膜 细 胞 质 和 细 胞 核 但 也 有 例 外 例 如 : 哺 乳 类 红 细 胞 成 熟 时 细 胞 核 消 失 ( 二 ) 观 察 方 法 与 结 果 1. 制 备 蟾 蜍 脊 髓 压 片 观 察 脊 髓 前 角 运 动 神 经 细 胞 取 蟾 蜍 一 只, 破 坏 脑 和 脊 髓, 在 口 裂 处 剪 去 头 部, 除 去 延 脑, 剪 开 椎 管, 可 见 乳 白 色 脊 髓, 取 下 脊 髓 放 在 平 皿 内, 用 Ringer 氏 液 洗 去 血 液 后 放 在 载 片 上, 剪 碎 将 另 一 载 片 压 在 脊 髓 碎 块 上, 用 力 挤 压 将 上 面 的 载 片 取 下 即 可 得 到 压 片 在 压 片 上 滴 一 滴 甲 苯 胺 兰 染 液, 染 色 10 分 钟, 盖 上 盖 片, 吸 去 多 余 染 液 在 显 微 镜 下 观 察, 染 色 较 深 的 小 细 胞 是 神 经 胶 质 细 胞 染 成 兰 紫 色 的 大 的 有 多 个 突 起 的 细 胞 是 脊 髓 前 角 运 动 神 经 细 胞, 胞 体 呈 三 角 形 或 星 形, 中 央 有 一 个 圆 形 细 胞 核, 内 有 一 个 核 仁 ( 参 照 照 片 ) 2. 蟾 蜍 骨 骼 肌 细 胞 的 剥 离 与 观 察 剪 开 蟾 蜍 腿 部 皮 肤, 剪 下 一 小 块 肌 肉, 放 在 载 片 上, 用 镊 子 和 解 剖 针 剥 离 肌 肉 块 成 为 肌 束, 继 续 剥 离, 可 得 到 很 细 的 肌 纤 维 ( 肌 细 胞 ) 尽 可 能 拉 直 肌 纤 维 在 显 微 镜 下 观 察, 肌 细 胞 为 细 长 形, 可 见 折 光 不 同 的 横 纹, 每 个 肌 细 胞 有 多 个 核, 分 布 于 细 胞 的 周 边 ( 参 照 照 片 ) 3. 蟾 蜍 肝 脏 压 片 的 制 备 与 观 察 剪 开 蟾 蜍 腹 腔, 取 一 小 块 ( 约 2~3mm 3 ) 肝 放 在 平 皿 内, 用 Ringer 氏 液 洗 净, 用 镊 子 轻 压 将 肝 中 的 血 挤 出 然 后 放 在 载 片 上, 制 片 方 法 同 脊 髓 压 片 染 色 用 甲 基 兰 显 微 镜 下 观 察 可 见 肝 细 胞 核 染 成 兰 色, 肝 细 胞 紧 密 排 列, 挤 成 多 角 形 ( 参 照 照 片 ) 4. 蟾 蜍 血 涂 片 的 制 备 与 观 察 取 一 滴 蟾 蜍 血 液, 靠 近 一 端 滴 在 载 片 上. 将 另 一 载 片 的 一 端 呈 45 角 紧 贴 在 血 滴 的 前 缘, 均 匀 用 力 向 前 推, 使 血 液 在 载 片 上 形 成 均 匀 的 薄 层 ( 图 l 一 1) 晾 干 显 微 镜 观 察 可

4 见 蟾 蜍 红 细 胞 为 椭 球 形, 有 核 白 细 胞 数 目 少, 为 圆 形 5. 人 血 涂 片 的 制 备 与 观 察 图 1 1 血 涂 片 的 制 备 取 人 血 一 滴, 制 片 方 法 同 上 显 微 镜 观 察 可 见 人 红 细 胞 为 凹 圆 盘 形, 无 核 自 细 胞 数 目 少, 为 圆 形 6. 人 口 腔 上 皮 细 胞 标 本 的 制 备 与 观 察 用 牙 签 刮 取 口 腔 上 皮 细 胞 均 匀 地 涂 在 载 片 上 ( 不 可 反 复 涂 沫 ), 滴 一 滴 甲 苯 胺 兰 染 液, 染 色 5 分 钟, 盖 上 盖 片, 吸 去 多 余 染 液 显 微 镜 下 观 察 可 见 复 盖 口 腔 表 面 的 上 皮 细 胞 为 扁 平 椭 圆 形, 中 央 有 椭 圆 形 核, 染 成 兰 色 二 测 微 尺 的 使 用 ( 一 ) 原 理 测 微 尺 分 目 镜 测 微 尺 和 镜 台 测 微 尺, 两 尺 配 合 使 用 目 镜 测 微 尺 是 一 个 放 在 目 镜 像 平 面 上 的 玻 璃 圆 片 圆 片 中 央 刻 有 一 条 直 线, 此 线 被 分 为 若 干 格, 每 格 代 表 的 长 度 随 不 同 物 镜 的 放 大 倍 数 而 异 因 此, 用 前 必 须 测 定 镜 台 测 微 尺 是 在 一 个 载 片 中 央 封 固 的 尺, 长 1 毫 米 (1000 μm), 被 分 为 100 格, 每 格 长 度 是 10 微 米 ( 二 ) 方 法 1. 将 镜 台 测 微 尺 放 在 显 微 镜 的 载 物 台 上 夹 好, 小 心 转 动 目 镜 测 微 尺 和 移 动 镜 台 测 微 尺 使 两 尺 平 行, 记 录 镜 台 测 微 尺 若 干 格 所 对 应 的 目 镜 测 微 尺 的 格 数 ( 图 1 2) 短 径 2. 按 下 式 求 出 目 镜 测 微 尺 每 格 代 表 的 长 度 目 镜 测 微 尺 每 格 代 表 的 长 度 (μm)= 三 测 量 人 口 腔 上 皮 细 胞 X10 从 显 微 镜 载 物 台 上 取 下 镜 台 测 微 尺, 换 上 人 口 腔 上 皮 细 胞 标 本, 测 量 细 胞 细 胞 核 的 长 作 业 一 分 别 求 出 使 用 低 倍 镜 (10X), 高 倍 镜 (40X) 时 目 镜 测 微 尺 每 格 代 表 的 长 度 : 低 倍 镜 : 目 镜 测 微 尺 每 格 代 表 的 长 度 = XlO(μm)= μm 高 倍 镜 : 目 镜 测 微 尺 每 格 代 表 的 长 度 = XlO(μm)= μm 二 分 别 绘 制 所 观 察 的 6 种 细 胞 并 注 明 基 本 结 构 三 计 算 蟾 蜍 红 细 胞 的 核 质 比 例 计 算 细 胞 细 胞 核 体 积 的 公 式 :

5 圆 形 V=4/3πr 3 (r 为 半 径 ) 椭 圆 形 V=4/3πab 2 (a b 为 长 短 半 径 ) 核 质 比 N/D=Vn/(Vc Vn)(Vn 为 核 的 体 积,Vc 是 细 胞 质 的 体 积 )

6 实 验 二 线 粒 体 (Mitochondrion) 的 活 体 染 色 及 电 镜 照 片 观 察 实 验 目 的 掌 握 一 种 活 体 染 色 方 法, 了 解 光 学 显 微 镜 和 电 子 显 微 镜 下 线 粒 体 基 本 形 态 结 构 实 验 用 品 一 材 料 和 标 本 兔 子 一 只 线 粒 体 的 电 镜 照 片 二 器 材 和 仪 器 注 射 器 吸 管 显 微 镜 手 术 器 材 一 套 解 剖 盘 小 平 皿 载 片 盖 片 吸 水 纸 10ml 三 试 剂 l/300 詹 纳 斯 绿 B 染 液 Ringer 氏 液 ( 哺 乳 类 用 ) 实 验 内 容 一 兔 肝 细 胞 线 粒 体 的 活 体 染 色 ( 一 ) 原 理 线 粒 体 是 细 胞 内 一 种 重 要 细 胞 器, 是 细 胞 进 行 呼 吸 作 用 的 场 所 细 胞 的 各 项 活 动 所 需 要 的 能 量, 主 要 是 通 过 线 粒 体 呼 吸 作 用 来 提 供 的 活 体 染 色 是 应 用 无 毒 或 毒 性 较 小 的 染 色 剂 真 实 地 显 示 活 细 胞 内 某 些 结 构 而 又 很 少 影 响 细 胞 生 命 活 动 的 一 种 染 色 方 法 詹 纳 斯 绿 B 是 线 垃 体 的 专 一 性 活 体 染 色 剂 线 粒 体 中 细 胞 色 素 氧 化 酶 使 染 料 保 持 氧 化 状 态 呈 蓝 绿 色, 而 在 周 围 的 细 胞 质 中 染 料 被 还 原, 成 为 无 色 状 态 ( 二 ) 方 法 用 空 气 栓 塞 处 死 兔 子, 置 于 解 剖 盘 内, 迅 速 打 开 腹 腔, 取 兔 肝 边 缘 较 薄 的 肝 组 织 一 小 块 (2~3mm 3 ), 放 入 盛 有 Ringer 氏 液 的 平 皿 内 洗 去 血 液 ( 用 镊 子 轻 压 ), 用 吸 管 吸 去 Ringer 氏 液, 在 平 皿 内 加 1/300 詹 纳 斯 绿 B 染 液, 让 组 织 块 上 表 面 露 在 染 液 外 面, 使 细 胞 内 线 粒 体 的 酶 系 可 进 行 充 分 的 氧 化, 这 样 才 有 利 于 保 持 染 料 的 氧 化 状 态, 使 线 粒 体 着 色 当 组 织 块 边 缘 染 成 篮 色 时 即 可, 一 般 需 要 染 30 分 钟 染 色 后, 将 组 织 块 移 到 载 片 上, 用 镊 子 将 组 织 块 拉 碎, 就 会 有 一 些 细 胞 或 细 胞 群 从 组 织 块 脱 离 将 稍 大 的 组 织 块 去 掉, 使 游 离 的 细 胞 或 细 胞 群 留 在 载 片 上, 加 一 滴 Ringer 氏 液, 盖 上 盖 片, 吸 去 多 余 水 分 ( 三 ) 结 果 显 微 镜 观 察, 肝 细 胞 质 中 许 多 线 粒 体 被 染 成 蓝 绿 色, 呈 颗 粒 状 二 线 粒 体 的 光 镜 切 片 观 察 用 詹 纳 斯 绿 B 染 色 的 兔 肝 细 胞 光 镜 切 片, 肝 细 胞 中 的 线 粒 体 呈 蓝 绿 色 的 颗 粒 三. 线 粒 体 的 电 镜 照 片 观 察 不 同 细 胞 中 线 粒 体 的 形 态 和 数 目 不 同 线 粒 体 的 外 形 多 样, 如 圆 形 椭 圆 形 哑 铃 形 和 杆 状 线 粒 体 的 数 目 与 细 胞 类 型 和 细 胞 的 生 理 状 态 有 关, 线 粒 体 多 聚 集 在 细 胞 生 理 功 能 旺 盛 的 区 域 线 粒 体 脊 的 数 目 与 分 布 方 式 是 多 种 多 样 的 一 般 与 线 粒 体 长 轴 垂 直 排 列, 但 也 可 见 到 与

7 线 粒 体 长 轴 平 行 排 列 的 脊 脊 的 横 切 面 呈 囊 状 或 管 状 脊 的 数 量 与 细 胞 呼 吸 机 能 的 强 度 有 很 大 关 系 这 有 三 张 线 粒 体 超 薄 切 片 的 电 镜 照 片 : 第 一 张 是 小 鼠 肾 小 管 上 皮 细 胞 中 线 粒 体 的 电 镜 照 片, 可 见 线 粒 体 呈 椭 圆 形 和 杆 状, 由 双 层 膜 包 围, 内 膜 向 内 突 起 成 平 板 状 脊, 脊 与 线 粒 体 长 轴 垂 直 排 列, 肾 小 管 上 皮 细 胞 重 吸 收 作 用 需 要 能 量, 线 粒 体 数 目 多 第 二 张 是 恒 河 猴 脊 髓 突 触 内 线 粒 体 可 见 线 粒 体 体 积 小 数 目 多, 脊 与 线 粒 体 呈 同 心 圆 排 列 第 三 张 是 小 鼠 睾 丸 间 质 细 胞 线 粒 体, 线 粒 体 的 脊 为 分 支 的 管, 在 照 片 上 呈 单 层 膜 泡 状 作 业 绘 制 光 镜 下 肝 细 胞 活 体 染 色 所 见 的 线 粒 体 及 电 镜 下 肾 小 管 上 皮 细 胞 中 线 粒 体 的 形 态 结 构

8 实 验 三 液 泡 系 (Vacuolar system) 的 活 体 染 色 及 电 镜 照 片 观 察 实 验 目 的 掌 握 一 种 活 体 染 色 方 法, 了 解 光 学 显 微 镜 和 电 子 显 微 镜 下 液 泡 系 的 基 本 形 态 结 构 实 验 用 品 一 材 料 和 标 本 蟾 蜍 一 只, 软 骨 细 胞 电 镜 照 片 二 器 材 和 仪 器 光 学 显 微 镜 一 台 手 术 器 材 一 套 解 剖 盘 一 个 载 片 盖 片 吸 水 纸 三 试 剂 l/3000 中 性 红 染 液 Ringer 氏 液 ( 两 栖 类 用 ) 实 验 内 容 一 蟾 蜍 胸 骨 剑 突 软 骨 细 胞 液 泡 系 活 体 染 色 及 观 察 ( 一 ) 原 理 在 动 物 细 胞 内, 凡 是 由 膜 所 包 围 的 小 泡 和 液 泡 除 线 粒 体 外 都 属 于 液 泡 系, 包 括 高 尔 基 器 溶 酶 体 微 体 消 化 泡 自 噬 小 体 残 体 胞 饮 液 泡 和 吞 噬 泡, 都 是 由 一 层 单 位 膜 包 围 而 成 软 骨 细 胞 内 含 有 较 多 的 粗 面 内 质 网 和 发 达 的 高 尔 基 复 合 体, 能 合 成 与 分 泌 软 骨 粘 蛋 白 及 胶 原 纤 维 等, 因 而 液 泡 系 发 达 中 性 红 是 液 泡 系 特 殊 的 活 体 染 色 剂, 只 将 液 泡 系 染 成 红 色, 在 细 胞 处 于 生 活 状 态 时, 细 胞 质 及 核 不 被 染 色, 中 性 红 染 色 可 能 与 液 泡 中 的 蛋 白 有 关 ( 二 ) 方 法 取 一 只 蟾 蜍, 破 坏 脑 和 脊 髓, 剪 开 胸 腔, 取 胸 骨 剑 突 软 骨 最 薄 部 分 的 一 小 片, 放 在 载 片 上, 滴 两 滴 1/3000 中 性 红 染 液, 染 色 8~lO 分 钟, 用 吸 水 纸 吸 去 染 液, 加 一 滴 Ringer 氏 液, 盖 上 盖 片, 吸 去 多 余 Ringer 氏 液 ( 三 ) 结 果 显 微 镜 下 观 察, 可 见 软 骨 细 胞 为 椭 圆 形, 细 胞 核 周 围 有 许 多 染 成 玫 瑰 红 色. 大 小 不 一 的 小 泡, 即 软 骨 细 胞 液 泡 系 二 大 白 鼠 胫 骺 软 骨 细 胞 电 镜 照 片 的 观 察 动 物 细 胞 液 泡 很 小, 即 使 是 活 体 染 色 也 只 能 看 出 是 一 个 小 点, 为 了 进 一 步 看 清 液 泡 的 结 构 我 们 有 必 要 观 察 软 骨 细 胞 的 电 镜 照 片 大 白 鼠 胫 骺 骨 细 胞 电 镜 照 片, 细 胞 核 与 核 仁 很 清 楚, 细 胞 质 中 有 丰 富 的 粗 面 内 质 网, 液 泡 系 发 达, 液 泡 由 单 层 膜 包 围, 细 胞 周 边 有 液 泡 释 放 作 业 绘 制 光 镜 下 软 骨 细 胞 液 泡 系

9 实 验 四 细 胞 生 理 活 动 的 实 验 观 察 实 验 目 的 通 过 制 片 与 观 察 加 深 理 解 细 胞 的 运 动 吞 噬 等 生 理 活 动 实 验 用 品 一 材 料 和 标 本 雄 性 蟾 蜍 小 白 鼠 l% 鸡 血 悬 液 6% 淀 粉 肉 汤 草 履 虫 二 器 材 和 仪 器 管 玻 璃 片 黑 纸 光 镜 2ml 注 射 器 载 玻 片 盖 玻 片 解 剖 器 材 滴 管 移 液 管 试 三 试 剂 0.3% 台 盼 兰 1% 刚 果 红 实 验 内 容 一 细 胞 的 吞 噬 活 动 ( 一 ) 原 理 白 细 胞 是 机 体 防 御 系 统 中 能 游 走 的 单 位 它 分 为 粒 细 胞 系 单 核 细 胞 系 淋 巴 系 三 类 它 们 有 许 多 生 理 功 能, 如 游 走 性 变 形 运 动 趋 化 性 吞 噬 异 物 等 在 白 细 胞 中, 以 粒 细 胞 单 核 细 胞 的 吞 噬 活 动 较 强, 故 称 此 二 类 细 胞 为 吞 噬 细 胞 单 核 细 胞 由 血 液 进 入 组 织 后 逐 渐 演 变 成 巨 噬 细 胞 吞 噬 细 胞 主 要 靠 吞 噬 来 处 理 异 物 吞 噬 细 胞 首 先 由 于 趋 化 作 用 而 向 异 物 游 走, 然 后 伸 出 伪 足 包 围 异 物, 并 发 生 内 吞 作 用 形 成 吞 噬 泡 将 异 物 吞 入 细 胞, 继 而 溶 酶 体 与 吞 噬 泡 融 合 消 化 异 物 ( 二 ) 小 白 鼠 腹 腔 巨 噬 细 胞 吞 噬 活 动 的 观 察 l. 实 验 前 二 天, 每 天 向 小 鼠 腹 腔 注 射 6% 淀 粉 肉 汤 O.5~1ml( 含 O.3% 台 盼 兰, 起 标 记 作 用 ), 以 刺 激 腹 腔 产 生 较 多 的 巨 噬 细 胞 ( 此 步 由 教 师 在 实 验 前 进 行 完 毕 ) 2. 实 验 时, 每 组 取 一 只 经 上 述 处 理 的 小 鼠, 腹 腔 注 射 1% 鸡 血 悬 液 0.5~1ml, 注 射 后 轻 揉 小 鼠 腹 部 以 使 红 细 胞 悬 液 分 散 均 匀 3.1 小 时 后, 用 颈 椎 脱 位 法 处 死 小 鼠, 迅 速 剖 开 小 鼠 腹 壁, 向 腹 腔 注 入 O.5ml~1ml 生 理 盐 水, 用 牙 签 轻 轻 搅 拌 使 生 理 盐 水 与 腹 腔 液 混 匀 4. 用 注 射 器 抽 取 腹 腔 液, 滴 片, 然 后 盖 上 盖 片 5. 镜 检, 高 倍 镜 下 画 图 记 录 所 见 结 果 二 暗 视 野 观 察 细 胞 的 纤 毛 和 鞭 毛 运 动 ( 一 ) 原 理 暗 视 野 照 明 法 是 一 种 不 使 照 射 被 检 物 体 的 光 线 直 接 进 入 物 镜 的 照 明 方 法 常 常 用 它 来 观 察 没 有 染 色 的 活 体 细 胞 或 胶 体 粒 子 利 用 此 照 明 法, 在 镜 检 时 不 能 直 接 看 到 通 过 标 本 的 照 明 光 线, 只 有 被 检 物 体 反 射 或 衍 射 的 光 线 进 入 物 镜 可 以 提 高 分 辨 率, 在 暗 视 野 中 可 以 看 到 明 亮 的 被 检 物 体 的 存 在 和 运 动, 但 它 们 的 内 部 结 构 却 看 不 清 楚 ( 二 ) 自 制 遮 光 板 变 普 通 显 微 镜 为 简 单 的 暗 视 野 显 微 镜 步 骤 : 1. 将 显 微 镜 聚 光 器 调 到 最 高 位, 用 低 倍 镜 调 焦 至 清 楚 2. 取 下 目 镜, 从 镜 筒 中 观 察 并 调 节 光 圈 的 大 小, 使 其 与 镜 筒 中 所 见 物 镜 的 视 野 相 等

10 3. 放 一 块 透 明 玻 璃 于 载 物 台 透 光 孔 上, 用 尺 子 测 量 光 圈 孔 径 4. 按 照 图 6--1 的 形 状, 用 黑 纸 剪 成 与 调 节 后 光 圈 孔 径 一 样 大 小 的 中 央 遮 光 板 5. 将 中 央 遮 光 板 放 置 在 显 微 镜 的 滤 光 框 上, 即 可 进 行 标 本 的 暗 视 野 观 察 注 : 如 果 使 用 高 倍 镜 观 察 标 本 时, 应 按 高 倍 镜 调 焦 的 视 野 大 小 重 新 制 作 中 央 遮 光 板 图 6 1 中 央 遮 光 板 a. 光 圈 孔 径 b. 滤 光 片 直 径 ( 三 ) 观 察 蟾 蜍 上 颌 粘 膜 上 皮 细 胞 的 纤 毛 运 动 步 骤 : 1. 用 捣 毁 脑 脊 髓 的 方 法 处 死 蟾 蜍 2. 腹 部 向 上 将 蟾 蜍 固 定 在 蜡 盘 上 3. 沿 蟾 蜍 二 侧 口 角 向 后 剪 开 约 l 厘 米, 将 下 颌 翻 转 固 定 在 腹 部 4. 在 上 颌 中 线 距 喉 头 1 厘 米 处 放 置 腊 屑, 观 察 腊 屑 向 什 么 方 向 移 动? 记 录 腊 屑 开 始 移 动 到 消 失 的 时 间 ( 见 图 6--2 蟾 蜍 口 腔 内 面 图 ) 5. 然 后, 用 眼 科 剪 刀 剪 取 咽 头 前 部 的 上 颌 粘 膜 约 2 2cm 2 小 块, 用 牙 签 挑 取 剪 下 的 粘 膜, 将 纵 切 面 贴 于 载 片 上 6. 加 一 滴 生 理 盐 水 于 载 玻 片 标 本 上, 加 盖 玻 片, 镜 检 图 6 2 蟾 蜍 口 腔 内 面 图 结 果 : 1. 在 低 倍 镜 下 观 察 上 颌 粘 膜 细 胞 纤 毛 运 动 的 现 象 2. 换 高 倍 镜 仔 细 观 察 纤 毛 有 规 律 的 运 动 ( 四 ) 暗 视 野 观 察 蟾 蜍 精 子 的 鞭 毛 运 动

11 步 骤 : l. 将 前 面 实 验 所 用 蟾 蜍 沿 腹 中 线 开 腹, 暴 露 出 黄 色 圆 柱 状 精 巢 2. 剪 取 一 侧 精 巢 于 盛 有 自 来 水 的 平 皿 中, 用 镊 子 夹 住 精 巢 的 一 端, 清 洗 去 血 污 3. 移 取 洗 净 的 精 巢 于 另 一 干 净 的 平 皿 上, 用 眼 科 剪 将 精 巢 充 分 剪 碎 后, 加 入 数 滴 自 来 水 混 匀 察 4. 用 吸 管 吸 取 平 皿 内 液 体, 滴 一 滴 于 载 玻 片 上, 盖 上 盖 玻 片, 稍 待 2~3 分 钟 于 镜 下 观 结 果 : 1. 在 低 倍 镜 下 可 见 到 视 野 中 有 许 多 精 子 : 头 部 呈 长 锥 形, 尾 为 细 长 的 线 状 结 构 2. 置 高 倍 镜 下 观 察 : 可 见 有 许 多 靠 尾 部 鞭 毛 弯 曲 摆 动 驱 使 而 运 动 的 精 子, 测 量 鞭 毛 长 度 三 草 履 虫 纤 毛 运 动 及 食 物 泡 的 形 成 图 6 3 草 履 虫 草 履 虫 是 一 种 单 细 胞 动 物 虫 体 由 一 个 细 胞 组 成, 能 执 行 复 杂 的 生 理 功 能 其 体 表, 均 匀 密 布 纤 毛, 为 运 动 细 胞 器 身 体 的 前 部 有 口 沟, 由 前 端 斜 向 伸 至 体 中 部, 口 沟 的 底 部 为 胞 口, 下 部 一 短 管 斜 向 后 部 而 入 胞 质, 称 胞 咽 纤 毛 有 规 律 的 摆 动 使 食 物 在 胞 咽 聚 结 形 成 食 物 泡 ( 吞 噬 泡 ), 最 后 脱 离 胞 咽 入 胞 质 食 物 泡 随 细 胞 质 由 体 后 端 到 前 端 不 停 环 流, 并 与 溶 酶 体 ( 含 酸 性 水 解 酶 ) 融 合, 行 使 细 胞 内 消 化 根 据 食 物 泡 中 刚 果 红 指 示 剂 的 颜 色 变 化 ( 酸 性 时, 为 红 色 ; 近 中 性 时, 为 黄 色 ; 碱 性 时, 为 蓝 色 ) 可 以 观 察 到 消 化 过 程

12 实 验 步 骤 : 1. 取 一 滴 草 履 虫 培 养 液 于 载 玻 片 上, 放 上 几 根 棉 花 纤 维, 以 减 慢 草 履 虫 的 运 动 加 盖 玻 片, 制 成 临 时 装 片 2. 观 察 草 履 虫 的 运 动 方 式 ( 观 察 时 光 线 可 调 暗 些 ): 可 见 镜 下 有 许 多 样 似 倒 置 鞋 底 的 草 履 虫, 体 表 纤 毛 不 断 摆 动, 虫 体 以 其 中 轴 左 旋 前 进, 若 遇 阻 力 则 试 触 后 即 刻 回 避 而 转 向 3. 观 察 草 履 虫 的 食 物 泡 的 形 成 : 1) 在 盖 玻 片 一 侧 加 一 滴 l% 的 刚 果 红 指 示 剂, 用 吸 水 纸 从 另 一 侧 吸 引 使 指 示 剂 进 入 盖 片 下 方, 选 一 运 动 较 迟 缓 的 草 履 虫, 移 入 高 倍 镜 观 察 吞 噬 活 动 2) 几 分 钟 后 可 见 草 履 虫 体 内 出 现 许 多 红 色 食 物 泡, 随 着 食 物 泡 不 停 的 在 胞 质 中 环 流, 食 物 不 断 消 化, 泡 内 酸 性 减 弱 或 近 中 性, 颜 色 渐 渐 呈 黄 色, 食 物 泡 渐 小, 最 后 食 物 泡 颜 色 呈 蓝 色, 不 能 被 消 化 的 残 渣, 环 流 到 身 体 后 部 的 胞 肛 排 出, 不 排 出 时 不 易 见 到 胞 肛 作 业 1. 画 图 记 录 细 胞 吞 噬 实 验 所 见 结 果, 小 鼠 巨 噬 细 胞 吞 噬 实 验 如 何 解 释 细 胞 内 台 盼 兰 的 着 色? 2. 在 观 察 细 胞 纤 毛 和 鞭 毛 运 动 实 验 中, 记 录 一 下 腊 屑 从 开 始 运 动 到 消 失 的 时 间 3. 鞭 毛 和 纤 毛 有 何 异 同?

13 实 验 五 细 胞 组 分 的 化 学 反 应 实 验 目 的 了 解 核 酸 蛋 白 质 糖 及 酶 的 细 胞 化 学 反 应 原 理, 掌 握 Brachet 反 应 及 碱 性 蛋 白 酸 性 蛋 白 糖 原 和 过 氧 化 物 酶 的 细 胞 化 学 染 色 方 法 实 验 用 品 一 材 料 和 标 本 蟾 蜍 小 白 鼠 各 一 只 肝 脏 石 腊 切 片 培 养 的 Hela 细 胞 二 器 材 和 仪 器 光 学 显 微 镜 解 剖 器 材 蜡 盘 载 玻 片 吸 水 纸 染 色 缸 盖 玻 片 水 浴 箱 三 试 剂 PBS 缓 冲 液 (ph7.2) 甲 基 绿 一 呱 咯 宁 醋 酸 缓 冲 液 纯 丙 酮 l/2 丙 酮 +1/2 二 甲 苯 纯 二 甲 苯 70% 乙 醇 5% 三 氯 醋 酸 0.1% 碱 性 固 绿 0.1% 酸 性 固 绿 0.5% 硫 酸 铜 联 苯 胺 混 合 液 1% 番 红 无 水 乙 醇 过 碘 酸 酒 精 液 Schiff 氏 酒 精 液 亚 硫 酸 水 Ehrlieh 苏 木 精 95% 乙 醇 Carnoy 固 定 液 ( 甲 醇 : 冰 醋 酸 =3:1, 体 积 比 ) 实 验 内 容 细 胞 的 组 织 化 学 方 法, 是 研 究 细 胞 成 分 常 用 的 方 法 之 一 它 是 利 用 化 学 试 剂 与 细 胞 内 的 某 些 物 质 进 行 化 学 反 应, 从 而 在 细 胞 局 部 形 成 有 色 沉 淀 物, 再 通 过 显 微 镜 对 组 织 内 的 生 物 化 学 成 分 进 行 定 性 定 位 定 量 研 究 一 Brachet 反 应 一 显 示 细 胞 内 的 DNA 和 RNA ( 一 ) 原 理 细 胞 经 甲 基 绿 一 呱 咯 宁 混 合 液 处 理 后, 其 中 的 DNA 和 RNA 出 现 不 同 的 呈 色 反 应, 一 般 认 为 这 是 由 于 带 有 负 电 荷 的 核 酸 对 碱 性 染 料 呱 咯 宁 和 甲 基 绿 具 有 亲 和 力, 且 这 两 种 染 料 的 作 用 有 选 择 性, 甲 基 绿 染 高 聚 分 子 的 DNA 呈 蓝 绿 色, 呱 咯 宁 染 低 聚 分 子 的 RNA 呈 红 色 由 此 对 细 胞 中 的 DNA 和 RNA 进 行 定 位 定 性 和 定 量 分 析 ( 二 ) 方 法 l. 接 种 Hela 细 胞 于 盖 片 上 并 培 养 24~48 小 时, 使 长 成 单 层 2. 取 出 盖 片, 用 PBS(pH7.2) 轻 轻 冲 洗 盖 片 表 面 去 除 残 渣 3. 放 入 Carnoy 固 定 液 中 固 定 l 小 时 4. 浸 入 甲 基 绿 一 呱 咯 宁 醋 酸 缓 冲 液 中 30 分 钟 染 色 5. 取 出 盖 片 放 入 蒸 馏 水 中 轻 轻 漂 洗 2~3 次 (2~3 秒 钟 左 右 ), 吸 去 水 分 放 入 纯 丙 酮 中 分 色 2~3 秒 钟 6. 放 入 l/2 丙 酮 +1/2 二 甲 苯 中 5 秒 钟 7. 放 入 纯 二 甲 苯 中 透 明 5 分 钟 8. 滴 一 滴 中 性 树 胶 于 载 玻 片 上, 将 盖 片 标 本 面 朝 下 封 片 9. 镜 下 观 察 ( 三 ) 结 果 细 胞 质 被 染 成 浅 红 色, 细 胞 核 被 染 成 蓝 绿 色, 而 其 中 核 仁 被 染 成 紫 红 色 ( 参 照 照 片 ) 二 细 胞 内 碱 性 蛋 白 和 酸 性 蛋 白 的 显 示 ( 一 ) 原 理

14 由 于 不 同 的 蛋 白 质 分 子 所 带 的 碱 性 和 酸 性 基 团 的 数 目 不 同, 在 ph 值 不 同 的 溶 液 中, 蛋 白 质 分 子 所 带 的 净 电 荷 多 少 不 同 如 在 生 理 条 件 下, 整 个 蛋 白 质 所 带 负 电 荷 多, 则 为 酸 性 蛋 白 质 ; 带 正 电 荷 多, 则 为 碱 性 蛋 白 质 据 此, 可 将 标 本 经 三 氯 醋 酸 处 理 提 出 核 酸 后, 用 不 同 ph 值 的 固 绿 染 液 分 别 染 色, 细 胞 内 的 酸 性 蛋 白 和 碱 性 蛋 白 质 显 示 出 来 ( 二 ) 方 法 1. 以 破 坏 脊 髓 法 处 死 蟾 蜍, 将 其 腹 面 向 上 放 人 蜡 盘 中, 剪 开 胸 腔, 打 开 心 包 小 心 将 心 脏 剪 一 小 口, 取 心 脏 血 一 滴 滴 在 干 净 载 玻 片 一 端, 推 片, 按 此 法 制 备 二 张 血 涂 片, 室 温 晾 干 2. 将 涂 片 作 好 标 记 放 在 70% 乙 醇 中 固 定 5 分 钟, 室 温 晾 干 3. 放 入 5% 三 氯 醋 酸 中 分 钟, 抽 提 出 核 酸 4. 清 水 冲 洗 多 次 (3 分 钟 以 上 ), 以 冲 去 痕 迹 的 三 氯 醋 酸 5. 滤 纸 吸 干 玻 片 上 水 分 6. 一 张 片 放 入 0.1% 碱 性 固 绿 (ph8.0~8.5) 中 染 色 10~15 分 钟, 另 一 张 片 放 入 0.1% 酸 性 固 绿 (ph2.0~2.5) 染 色 5~10 分 钟 7. 清 水 冲 洗, 盖 上 盖 片 镜 检 ( 三 ) 结 果 经 碱 性 固 绿 染 色 片 中, 胞 质 核 仁 不 着 色, 细 胞 核 大 部 分 被 染 成 绿 色, 是 为 碱 性 蛋 白 质 存 在 处 ( 参 照 照 片 ) 经 酸 性 固 绿 染 色 片 中, 因 胞 质 和 核 仁 中 有 酸 性 蛋 白, 被 染 成 绿 色 三 细 胞 内 过 氧 化 物 酶 的 显 示 ( 一 ) 原 理 过 氧 化 物 酶 能 把 许 多 胺 类 氧 化 为 有 色 化 合 物, 用 联 苯 胺 处 理 标 本, 细 胞 内 的 过 氧 化 物 酶 能 把 联 苯 胺 氧 化 为 蓝 色 的 联 苯 胺 蓝, 进 而 变 为 棕 色 产 物, 因 而 可 以 根 据 颜 色 反 应 来 判 定 过 氧 化 物 酶 的 有 无 或 多 少 ( 二 ) 方 法 1. 取 小 鼠 一 只, 以 颈 椎 脱 位 法 将 其 处 死, 迅 速 剖 开 其 后 肢 暴 露 出 股 骨, 将 股 骨 一 端 斜 向 剪 断, 用 PBS 缓 冲 液 湿 润 过 的 注 射 器 针 头 吸 出 骨 髓 一 滴 滴 到 载 玻 片 上 2. 推 片, 室 温 晾 干 3. 将 涂 片 放 入 0.5% 硫 酸 铜 中 浸 30 秒 ~1 分 钟 4. 取 出 涂 片 直 接 放 入 联 苯 胺 混 合 液 中 反 应 6 分 钟 5. 清 水 冲 洗, 放 入 1% 番 红 溶 液 中 复 染 2 分 钟 6. 清 水 冲 洗, 室 温 晾 干 7. 镜 检 或 封 片 后 镜 检 ( 三 ) 结 果 涂 片 中 可 见 一 些 细 胞 中 存 在 着 蓝 色 或 棕 色 颗 粒, 为 过 氧 化 物 酶 所 在 位 置 四 过 碘 酸 雪 夫 反 应 (PAS) 显 示 细 胞 内 糖 原 ( 参 照 照 片 和 示 教 片 ) ( 一 ) 原 理 组 织 细 胞 的 多 糖 粘 多 糖 及 粘 蛋 白 等 都 可 用 PAS 法 来 显 示, 其 化 学 基 础 是 利 用 过 碘 酸 的 氧 化 作 用, 打 开 碳 链 形 成 醛, 生 成 的 醛 基 与 Schiff 试 剂 中 的 无 色 品 红 反 应 形 成 紫 红 色 化

15 合 物 ( 二 ) 方 法 l. 取 l~2mm 厚 的 肝 组 织 块, 用 Carnoy 氏 液 4 固 定 4~6 小 时 2. 乙 醇 脱 水 二 甲 苯 透 明 石 蜡 包 埋, 切 片 3. 用 70% 乙 醇 展 片 4. 脱 蜡 : 二 甲 苯 (1)5 分 钟 二 甲 苯 (2)5 分 钟 100% 乙 醇 5 分 钟 含 1% 火 棉 胶 的 乙 醇 液 1 分 钟 70% 乙 醇 1 分 钟 5. 直 接 浸 入 过 碘 酸 酒 精 液 反 应 5~15 分 钟, 经 70% 乙 醇 洗 片 刻 6. 浸 入 Schiff 氏 酒 精 液 反 应 15 分 钟 7. 亚 硫 酸 水 洗 三 次, 以 洗 去 多 余 的 非 特 异 性 结 合 的 色 素, 以 及 扩 散 的 染 料 8. 流 水 冲 洗 3~5 分 钟 9. 蒸 馏 水 洗 10. 浸 入 Ehrlich 苏 木 精 复 染 20~30 秒, 使 细 胞 核 着 色 11. 脱 水 :95% 乙 醇 3 分 钟 二 次 100% 乙 醇 3 分 钟 二 次 二 甲 苯 透 明 10 分 钟 二 次 12. 加 盖 片 镜 检 或 树 胶 封 固 后 镜 检 ( 三 ) 结 果 细 胞 中 呈 紫 红 的 颗 粒 即 为 糖 原 ( 参 照 照 片 ) 五 苏 丹 Ⅲ 染 色 显 示 细 胞 内 脂 肪 ( 示 教 片 ) 作 业 1. 用 彩 色 笔 绘 出 Brachet 反 应 及 PAS 反 应 的 镜 下 所 见 2. 说 明 着 色 的 碱 性 蛋 白 可 能 是 什 么 物 质?

16 实 验 六 细 胞 核 与 线 粒 体 的 分 级 分 离 实 验 目 的 通 过 细 胞 匀 浆 和 离 心 的 方 法 分 级 分 离 细 胞 的 组 分, 以 了 解 其 原 理 及 过 程 实 验 用 品 一 材 料 和 标 本 小 白 鼠 冰 块 二 器 材 和 仪 器 玻 璃 匀 浆 器 普 通 离 心 机 台 式 高 速 离 心 机 普 通 天 平 光 学 显 微 镜 载 玻 片 盖 玻 片 刻 度 离 心 管 高 速 离 心 管 滴 管 10ml 量 筒 25ml 烧 杯 玻 璃 漏 斗 解 剖 剪 镊 子 吸 水 纸 纱 布 螬 盘 平 皿 牙 签 三 试 剂 0.25mol/L 蔗 糖 一 0.003mol/L 氯 化 钙 溶 液 1% 甲 苯 胺 兰 染 液 0.02% 詹 纳 斯 绿 B 染 液 0.9%NaCl 溶 液 实 验 内 容 一 原 理 细 胞 内 不 同 结 构 的 比 重 和 大 小 都 不 相 同, 在 同 一 离 心 场 内 的 沉 降 速 度 也 不 相 同, 根 据 这 一 原 理, 常 用 不 同 转 速 的 离 心 法, 将 细 胞 内 各 种 组 分 分 级 分 离 出 来 分 离 细 胞 器 最 常 用 的 方 法 是 将 组 织 制 成 匀 浆, 在 均 匀 的 悬 浮 介 质 中 用 差 速 离 心 法 进 行 分 离, 其 过 程 包 括 组 织 细 胞 匀 浆 分 级 分 离 和 分 析 三 步, 这 种 方 法 已 成 为 研 究 亚 细 胞 成 分 的 化 学 组 成 理 化 特 性 及 其 功 能 的 主 要 手 段 匀 浆 (Homogenization) 低 温 条 件 下, 将 组 织 放 在 匀 浆 器 中, 加 入 等 渗 匀 浆 介 质 ( 即 0.25mol/L 蔗 糖 一 0.003mol/L 氯 化 钙 ) 进 行 破 碎 细 胞 使 之 成 为 各 种 细 胞 器 及 其 包 含 物 的 匀 浆 分 级 分 离 (Fractionation) 由 低 速 到 高 速 离 心 逐 渐 沉 降 先 用 低 速 使 较 大 的 颗 粒 沉 淀, 再 用 较 高 的 转 速, 将 浮 在 上 清 液 中 的 颗 粒 沉 淀 下 来, 从 而 使 各 种 细 胞 结 构, 如 细 胞 核 线 粒 体 等 得 以 分 离 由 于 样 品 中 各 种 大 小 和 密 度 不 同 的 颗 粒 在 离 心 开 始 时 均 匀 分 布 在 整 个 离 心 管 中, 所 以 每 级 离 心 得 到 的 第 一 次 沈 淀 必 然 不 是 纯 的 最 重 的 颗 粒, 须 经 反 复 悬 浮 和 离 心 加 以 纯 化 分 析 分 级 分 离 得 到 的 组 分, 可 用 细 胞 化 学 和 生 化 方 法 进 行 形 态 和 功 能 鉴 定 二 细 胞 核 的 分 离 提 取 ( 一 ) 操 作 步 骤 1. 用 颈 椎 脱 位 的 方 法 处 死 小 白 鼠 后, 迅 速 剖 开 腹 部 取 出 肝 脏, 剪 成 小 块 ( 去 除 结 缔 组 织 ) 尽 快 置 于 盛 有 0.9%NaCl 的 烧 杯 中, 反 复 洗 涤, 尽 量 除 去 血 污, 用 滤 纸 吸 去 表 面 的 液 体 2. 将 湿 重 约 1g 的 肝 组 织 放 在 小 平 皿 中, 用 量 筒 量 取 8ml 预 冷 的 0.25mol/L 蔗 糖 一 0.003mol/L 氯 化 钙 溶 液, 先 加 少 量 该 溶 液 于 平 皿 中, 尽 量 剪 碎 肝 组 织 后, 再 全 部 加 入 3. 剪 碎 的 肝 组 织 倒 入 匀 浆 管 中, 使 匀 浆 器 下 端 浸 入 盛 有 冰 块 的 器 皿 中, 左 手 持 之, 右 手 将 匀 浆 捣 杆 垂 直 插 入 管 中, 上 下 转 动 研 磨 3~5 次, 用 3 层 纱 布 过 滤 匀 浆 液 于 离 心 管 中, 然 后 制 备 一 张 涂 片 1, 做 好 标 记, 自 然 干 燥 4. 将 装 有 滤 液 的 离 心 管 配 平 后, 放 入 普 通 离 心 机, 以 2500rpm, 离 心 15 分 钟 ;(1) 缓

17 缓 取 上 清 液, 移 入 高 速 离 心 管 中, 保 存 于 有 冰 块 的 烧 杯 中, 待 分 离 线 粒 体 用 ;(2) 同 时 涂 一 张 上 清 液 片 2 做 好 标 记, 自 然 干 燥 ;(3) 余 下 的 沉 淀 物 进 行 下 一 步 骤 5. 用 6ml0.25mol/L 蔗 糖 一 0.003mol/L 氯 化 钙 溶 液 悬 浮 沉 淀 物, 以 2500rpm 离 心 15 分 钟 弃 上 清, 将 残 留 液 体 用 吸 管 吹 打 成 悬 液, 滴 一 滴 于 干 净 的 载 玻 片 上, 涂 片 3, 自 然 干 燥 6. 将 涂 片 用 l% 甲 苯 胺 兰 染 色 后 盖 片 即 可 观 察 ( 二 ) 结 果 分 别 于 高 倍 镜 下 观 察 三 张 涂 片, 描 述 镜 下 所 见 三 高 速 离 心 分 离 提 取 线 粒 体 ( 一 ) 操 作 步 骤 1. 将 装 有 上 清 液 的 高 速 离 心 管, 从 装 有 冰 块 的 烧 杯 中 取 出, 配 平 后, 以 17000rpm 离 心 20 分 钟, 弃 上 清, 留 取 沉 淀 物 2. 加 入 0.25mol/L 蔗 糖 一 0.003mol/L 氯 化 钙 液 lml, 用 吸 管 吹 打 成 悬 液, 以 17000rpm 离 心 20 分 钟, 将 上 清 吸 入 另 一 试 管 中, 留 取 沉 淀 物, 加 入 0.1ml 0.25mol/L 蔗 糖 一 0.003mol /L 氯 化 钙 溶 液 混 匀 成 悬 液 ( 可 用 牙 签 ) 3. 取 上 清 液 和 沉 淀 物 悬 液, 分 别 滴 一 滴 于 干 净 载 玻 片 上 ( 分 别 标 记 4 5 涂 片 ), 各 滴 一 滴 0.02% 詹 纳 斯 绿 B 染 液 盖 上 盖 片 染 20 分 钟 ( 二 ) 结 果 油 镜 下 观 察, 颗 粒 状 的 线 粒 体 被 詹 纳 斯 绿 B 染 成 蓝 绿 色 作 业 1. 简 要 说 明 分 级 分 离 细 胞 的 原 理 及 意 义 2. 比 较 一 下 分 离 细 胞 核 时 涂 片 有 什 么 不 同? 涂 片 3 在 你 的 实 验 结 果 中 纯 度 如 何? 2. 描 述 一 下 涂 片 5 所 见 结 果

18 小 白 鼠 脱 颈 椎 处 死, 迅 速 开 腹 剪 取 肝 组 织 0.9%NaCl 洗 涤, 称 1g 剪 碎 加 8ml 预 冷 的 0.25mol /L 蔗 糖 一 0.003mol/L 氯 化 钙 溶 液 匀 浆 过 滤, 滤 液 移 入 离 心 管, 滤 液 涂 片 1 离 心 普 通 离 心 机 2500rpm,15 分 钟 滴 片 詹 纳 斯 绿 B 染 色 4 盖 片 滴 片 詹 纳 斯 绿 B 染 色 5 盖 片 镜 检 油 镜 检 图 8 1 细 胞 核 和 线 粒 体 分 离 图 解

19 实 验 七 细 胞 融 合 实 验 目 的 掌 握 细 胞 融 合 原 理 应 用 PEG 融 合 细 胞 的 方 法 以 及 细 胞 融 合 率 的 计 算 实 验 用 品 一 材 料 鸡 红 细 胞 二 器 材 和 仪 器 : 显 微 镜 离 心 机 水 浴 箱 刻 度 离 心 管 试 管 载 玻 璃 片 盖 玻 片 三 试 剂 50%PEG(MW4,000) Hanks 液 (ph7.4) 实 验 内 容 一 原 理 细 胞 融 合 (Cell fusion), 即 在 自 然 条 件 下 或 用 人 工 方 法 ( 生 物 的 物 理 的 化 学 的 ) 使 两 个 或 两 个 以 上 的 细 胞 合 并 形 成 一 个 细 胞 的 过 程 人 工 诱 导 的 细 胞 融 合, 在 六 十 年 代 作 为 一 门 新 兴 技 术 而 发 展 起 来 由 于 它 不 仅 能 产 生 同 种 细 胞 融 合, 也 能 产 生 种 间 细 胞 的 融 合, 因 此 细 胞 融 合 技 术 目 前 被 广 泛 应 用 于 细 胞 生 物 学 和 医 学 研 究 的 各 个 领 域 细 胞 融 合 的 诱 导 物 种 类 很 多. 常 用 的 主 要 有 灭 活 的 仙 台 病 毒 (Sendai virus), 聚 乙 二 醇 (Polyethyleneglycol,PEG) 和 电 脉 冲 目 前 应 用 最 广 泛 的 是 聚 乙 二 醇, 因 为 它 易 得 简 便, 且 融 合 效 果 稳 定 PEG 的 促 融 机 制 尚 不 完 全 清 楚, 它 可 能 引 起 细 胞 膜 中 磷 脂 的 酰 键 及 极 性 基 团 发 生 结 构 重 排 二 方 法 (1) 取 新 鲜 鸡 血 以 0.85% 生 理 盐 水 制 成 10% 的 悬 液 (2) 称 取 0.5 克 PEG(MW=4,000) 放 入 试 管 内, 在 酒 精 灯 上 融 化 之, 迅 速 加 入 0.5ml 预 热 的 Hanks 液 混 匀 制 成 50% 的 PEG 溶 液 放 入 37 水 浴 中 待 用 (3) 取 上 述 10% 的 鸡 红 细 胞 悬 液 1ml 放 入 离 心 管 中, 再 加 入 5ml Hanks 液 混 匀, 然 后 以 1,000rpm 离 心 5 分 钟, 小 心 弃 去 上 清, 用 指 弹 法 将 细 胞 团 块 弹 散 (4) 取 上 述 50%PEG 溶 液 0.5ml, 在 1 分 钟 内 滴 加 到 鸡 红 细 胞 悬 液, 边 加 边 轻 轻 摇 动 混 匀 待 PEG 全 部 加 入 后 静 置 1 分 钟 左 右 此 全 部 过 程 都 要 求 在 37 水 浴 内 进 行 (5) 缓 慢 滴 加 9ml Hanks 液 以 终 止 PEG 的 作 用, 在 37 水 浴 内 静 置 5 分 钟 (6) 离 心 弃 上 清 后, 取 一 滴 融 合 后 的 细 胞 悬 液 滴 片, 加 盖 片 镜 检 三 结 果 观 察 在 高 倍 镜 下 可 以 看 到 有 两 个 或 两 个 以 上 的 鸡 红 细 胞 膜 融 合 在 一 起, 形 成 一 个 异 核 体 细 胞 要 注 意 辨 别 融 合 细 胞 与 重 叠 的 鸡 红 细 胞 四 融 合 率 的 计 算 在 高 倍 镜 下 随 机 计 数 200 个 细 胞 ( 包 括 融 合 的 与 未 融 合 的 细 胞 ), 以 融 合 细 胞 ( 含 两 个 或 两 个 以 上 的 细 胞 核 的 细 胞 ) 的 细 胞 核 数 除 以 总 细 胞 核 数 ( 包 括 融 合 与 未 融 合 的 细 胞 核 ) 即 得 出 融 合 率 公 式 如 下 :

20 作 业 l. 在 显 微 镜 下 按 顺 序 绘 制 所 观 察 到 的 细 胞 融 合 各 阶 段, 并 注 明 主 要 特 点 2. 你 测 定 的 细 胞 融 合 率 为 多 少?

21 实 验 八 培 养 细 胞 的 形 态 观 察 和 计 数 实 验 目 的 了 解 培 养 中 的 动 物 细 胞 的 一 般 形 态 和 生 长 状 态 ; 掌 握 细 胞 计 数 的 基 本 方 法 实 验 用 品 一 材 料 和 标 本 胞 ) HL 一 60 细 胞 ( 人 白 血 病 细 胞 ) 二 器 材 和 仪 器 三 试 剂 实 验 内 容 培 养 中 的 HeLa 细 胞 ( 人 子 宫 颈 癌 上 皮 细 胞 ) NIH3T3( 小 鼠 成 纤 维 细 倒 置 显 微 镜 细 胞 计 数 板 普 通 光 学 显 微 镜 乳 头 吸 管 0.3% 台 盼 兰 染 液 0.25% 胰 蛋 白 酶 一 0.02%EDTA 混 合 消 化 液 一 培 养 细 胞 的 形 态 观 察 ( 一 ) 原 理 体 外 培 养 的 细 胞 主 要 有 两 种 状 态 一 种 是 能 贴 附 在 培 养 支 持 物 上 的 细 胞, 如 HeLa 细 胞 NH3T3 等, 叫 贴 壁 型 细 胞, 体 外 培 养 的 细 胞 绝 大 多 数 都 属 于 这 种 细 胞 另 一 种 细 胞 并 不 贴 附 在 容 器 的 壁 上, 而 是 悬 浮 在 培 养 液 中 生 长, 如 HL 60, 叫 做 悬 浮 型 细 胞, 这 类 细 胞 主 要 是 血 液 原 性 或 癌 原 性 的 细 胞 ( 二 ) 操 作 l. 将 细 胞 培 养 瓶 从 37 二 氧 化 碳 培 养 箱 ( 或 温 箱 ) 中 取 出, 注 意 观 察 细 胞 培 养 液 的 颜 色 和 清 澈 度 然 后, 将 细 胞 培 养 瓶 平 稳 地 放 在 倒 置 显 微 镜 载 物 台 上, 此 时 应 注 意 不 要 将 瓶 翻 转, 也 不 要 让 瓶 内 的 液 体 接 触 瓶 塞 或 流 出 瓶 口 2. 打 开 倒 置 镜 光 源, 通 过 双 筒 目 镜 将 视 野 调 到 合 适 的 亮 度 3. 调 节 载 物 台 的 高 度 进 行 对 焦, 在 看 到 细 胞 层 之 后, 再 用 细 调 节 器 将 物 像 调 清 楚, 注 意 观 察 细 胞 的 轮 廓 形 状 和 内 部 结 构 在 观 察 时, 最 经 常 使 用 的 是 10X 物 镜 ( 三 ) 结 果 贴 壁 细 胞 一 般 有 两 种 形 状, 即 上 皮 细 胞 形 和 成 纤 维 细 胞 形 细 胞 上 皮 细 胞 形 细 胞 呈 扁 平 的 不 规 则 多 角 形, 圆 形 核 位 于 中 央, 生 长 时 常 彼 此 紧 密 连 接 成 单 层 细 胞 片, 如 HeLa 细 胞 成 纤 维 细 胞 形 细 胞 形 态 与 体 内 成 纤 维 细 胞 形 态 相 似, 胞 体 呈 梭 形 或 不 规 则 三 角 形, 中 央 有 圆 核, 胞 质 向 外 伸 出 2~3 个 长 短 不 同 的 突 起, 细 胞 群 常 借 原 生 质 突 连 接 成 网, 如 NIH3T3( 参 照 照 片 ) 贴 壁 细 胞 在 生 长 状 态 良 好 时, 细 胞 内 颗 粒 少, 看 不 到 有 空 泡, 细 胞 边 缘 清 楚, 培 养 基 内 看 不 到 悬 浮 的 细 胞 和 碎 片, 培 养 液 清 澈 透 明, 而 当 细 胞 内 颗 粒 较 多, 透 明 差, 空 泡 多 时, 表 明 生 长 较 差 当 瓶 内 培 养 基 混 浊 时, 应 想 到 细 菌 真 菌 污 染 的 可 能 悬 浮 细 胞 当 边 缘 清 楚, 透 明 发 亮 时, 生 长 较 好 ; 反 之, 则 较 差 或 已 死 亡 由 于 培 养 基 内 有 ph 指 示 剂 的 存 在, 因 此 它 的 颜 色 往 往 可 以 间 接 地 表 明 细 胞 的 生 长 状 态 呈 橙 黄 色 时, 细 胞 一 般 生 长 状 态 较 好 ; 呈 淡 黄 色 时, 则 可 能 是 培 养 时 问 过 长, 营 养 不 足, 死 亡 细 胞 过 多 ; 如 呈 紫 红 色, 则 可 能 是 细 胞 生 长 状 态 不 好, 或 已 死 亡 实 际 上, 一 种 细 胞 在 培 养 中 的 形 态 并 不 是 永 恒 不 变 的, 它 随 营 养 ph 生 长 周 期 而 改 变, 但 在 比 较 稳 定 的 条 件 下 形 态 基 本 是 一 致 的 在 贴 壁 细 胞 培 养 中, 镜 下 折 光

22 率 高, 圆 而 发 亮 的 一 般 被 认 为 是 分 裂 期 细 胞 肿 瘤 细 胞 有 重 叠 生 长 的 特 征 二 培 养 细 胞 的 计 数 及 活 细 胞 的 鉴 定 ( 一 ) 在 细 胞 生 物 学 的 实 验 中, 往 往 要 进 行 活 细 胞 的 鉴 定 和 细 胞 的 计 数 调 整 细 胞 的 密 度, 是 进 行 实 验 必 不 可 少 的 一 种 基 本 技 能 图 13 1 细 胞 计 数 板 顶 面 观 和 侧 面 观 的 图 示 图 13 2 放 大 的 计 数 室 ( 二 ) 操 作 1. 将 培 养 瓶 中 的 培 养 液 倒 入 干 净 试 管 中, 向 培 养 瓶 中 加 入 0.25% 胰 蛋 白 酶 一 0.02% EDTA 混 合 消 化 液 lml, 静 置 3~5 分 钟, 待 见 到 细 胞 变 圆, 彼 此 不 连 接 为 止 2. 将 试 管 中 的 培 养 液 倒 回 培 养 瓶 中, 并 轻 轻 进 行 吹 打, 制 成 细 胞 悬 液 3. 取 细 胞 悬 液 0.5ml, 加 入 0.3% 台 盼 兰 染 液 0.5ml, 混 合 后 染 色 3~5 分 钟 4. 滴 加 少 许 已 染 色 的 细 胞 悬 液 于 放 有 盖 片 的 细 胞 计 数 板 的 斜 面 上, 使 液 体 自 然 充 满 计 数 板 小 室 注 意 不 要 使 小 室 内 有 气 泡 产 生, 否 则 要 重 新 滴 加 5. 在 普 通 光 镜 10X 物 镜 下 计 数 四 个 大 格 内 ( 如 图 13 1,13 2 示 ) 的 细 胞 数, 压 线 者 数 上 不 数 下, 数 左 不 效 右 ( 三 ) 结 果 按 下 式 进 行 细 胞 浓 度 的 计 数 :

23 注 1 4 大 格 中 的 每 一 大 格 体 积 为 0.1mm 3 1ml=l,0000 大 格, 因 此,1 大 格 细 胞 数 10 4 = 细 胞 数 /ml 注 2 染 色 标 本 在 15 分 钟 内 检 查 计 数, 因 为 台 盼 兰 染 液 可 以 迅 速 地 使 死 细 胞 染 上 蓝 色, 延 长 时 间 活 细 胞 也 将 着 色, 用 此 方 法 来 分 辨 死 活 细 胞 进 行 细 胞 计 数 时 应 力 求 准 确, 因 此, 在 科 学 研 究 中, 往 往 将 计 数 板 的 两 侧 都 滴 加 上 细 胞 悬 液, 并 同 时 滴 加 几 块 计 数 板 ( 或 反 复 滴 加 一 块 计 数 板 几 次 ), 最 后 取 结 果 的 平 均 值 作 业 一 问 题 下 面 是 某 些 贴 壁 细 胞 培 养 数 天 后 观 察 计 数 的 结 果 : 瓶 培 养 基 镜 下 观 察 计 数 清 澈 度 颜 色 细 胞 界 限 胞 内 颗 粒 空 泡 碎 片 总 死 甲 混 蚀 黄 不 清 多 多 大 满 视 野 乙 清 橙 黄 清 楚 少 少 无 丙 清 黄 清 楚 较 多 有 有 丁 清 紫 红 不 清 多 多 多 根 据 上 表 分 析 各 瓶 细 胞 的 生 长 情 况 是 : A 细 胞 生 长 状 态 良 好 ; B 培 养 时 间 太 短 ; C 细 胞 污 染 可 能 性 大 ; D 细 胞 与 环 境 生 长 不 适 ; E 细 胞 营 养 不 足 甲 ( ) 乙 ( ) 丙 ( ) 丁 ( ) 2. 根 据 你 的 判 断 应 采 取 的 措 施 是 : A 将 细 胞 弃 去 ; B 立 即 换 新 鲜 培 养 液 ; C 立 即 传 代 ; D 放 置 继 续 观 察 ;

24 E 换 到 新 的 培 养 瓶 中 甲 ( ) 乙 ( ) 丙 ( ) 丁 ( ) 二 作 图 将 你 观 察 到 的 培 养 细 胞 作 一 草 图 三 计 算 将 你 计 数 的 每 毫 升 细 胞 悬 液 中 的 细 胞 总 数, 死 活 细 胞 的 百 分 比 例 计 算 出 来

25 实 验 九 细 胞 的 原 代 和 传 代 培 养 实 验 目 的 初 步 掌 握 哺 乳 动 物 细 胞 的 原 代 培 养 与 传 代 培 养 的 基 本 操 作 过 程, 为 生 物 工 程 在 医 学 上 的 应 用 打 下 基 础 实 验 用 品 一 材 料 和 标 本 乳 兔 HeLa 细 胞 ( 人 宫 颈 癌 细 胞 ) 二 器 材 和 仪 器 手 术 器 械 平 皿 培 养 瓶 吸 管 离 心 管 ( 灭 菌 后 备 用 ) 酒 精 灯 烧 杯 超 净 工 作 台 二 氧 化 碳 培 养 箱 倒 置 显 微 镜 三 试 剂 含 有 5% 小 牛 血 清 的 MEM 培 养 液 0.01mol/L PBS,0.25% 胰 蛋 白 酶 一 0.02 %EDTA 混 合 消 化 液 75% 乙 醇 实 验 内 容 一 原 代 细 胞 培 养 ( 一 ) 原 理 细 胞 培 养 (Cell culture) 是 模 拟 机 体 内 生 理 条 件, 将 细 胞 从 机 体 中 取 出, 在 人 工 条 件 下 使 其 生 存 生 长 繁 殖 和 传 代, 进 行 细 胞 生 命 过 程 细 胞 癌 变 细 胞 工 程 等 问 题 的 研 究 近 年 来, 广 泛 地 应 用 于 分 子 生 物 学 遗 传 学 免 疫 学 肿 瘤 学 细 胞 工 程 等 领 域, 发 展 成 一 种 重 要 生 物 技 术, 并 取 得 显 著 成 就 由 体 内 直 接 取 出 组 织 或 细 胞 进 行 培 养 叫 原 代 培 养 原 代 培 养 细 胞 离 体 时 间 短, 性 状 与 体 内 相 似, 适 用 于 研 究 一 般 说 来, 幼 稚 状 态 的 组 织 和 细 胞, 如 : 动 物 的 胚 胎 幼 仔 的 脏 器 等 更 容 易 进 行 原 代 培 养 ( 二 ) 操 作 1. 取 材 用 颈 椎 脱 位 法 使 乳 兔 迅 速 死 亡 然 后, 把 整 个 动 物 浸 入 盛 有 75% 乙 醇 的 烧 杯 中 数 秒 钟 消 毒, 取 出 后 放 在 大 平 皿 中 携 入 超 净 台 用 消 过 毒 的 剪 刀 剪 开 用 碘 酒 和 乙 醇 再 次 消 毒 后 的 皮 肤, 剖 腹 取 出 肝 脏 或 肾 脏 置 于 无 菌 平 皿 中 2. 切 割 用 灭 菌 的 PBS 液 将 取 出 的 脏 器 清 洗 三 次, 然 后 用 眼 科 手 术 剪 刀 仔 细 将 组 织 反 复 剪 碎, 直 到 成 1mm 3 左 右 的 小 块, 再 用 PBS 清 洗, 洗 到 组 织 块 发 白 为 止 移 入 无 菌 离 心 管 中, 静 置 数 分 钟, 使 组 织 块 自 然 沉 淀 到 管 底, 弃 去 上 清 3. 消 化 接 种 培 养 吸 取 0.25% 胰 蛋 白 酶 一 0.02%EDTA 混 合 消 化 液 1ml, 加 入 离 心 管 中, 与 组 织 块 混 匀 后, 加 上 管 口 塞 子,37 水 浴 中 消 化 8~10 分 钟, 每 隔 几 分 钟 摇 动 一 下 试 管, 使 组 织 与 消 化 液 充 分 接 触, 静 止, 吸 去 上 清, 向 离 心 管 中 加 入 5~10ml 含 5% 小 牛 血 清 的 MEM 培 养 基, 用 吸 管 吹 打 混 匀, 移 入 二 个 培 养 瓶 中, 置 于 二 氧 化 碳 培 养 箱 中 培 养 ( 三 ) 结 果 细 胞 接 种 后 一 般 几 小 时 内 就 能 贴 壁, 并 开 始 生 长, 如 接 种 的 细 胞 密 度 适 宜,5 天 到 一 周 即 可 形 成 单 层

26 二 传 代 细 胞 培 养 ( 一 ) 原 理 体 外 培 养 的 原 代 细 胞 或 细 胞 株 要 在 体 外 持 续 地 培 养 就 必 须 传 代, 以 便 获 得 稳 定 的 细 胞 株 或 得 到 大 量 的 同 种 细 胞, 并 维 持 细 胞 种 的 延 续 培 养 的 细 胞 形 成 单 层 汇 合 以 后, 由 于 密 度 过 大 生 存 空 间 不 足 而 引 起 营 养 枯 竭, 将 培 养 的 细 胞 分 散, 从 容 器 中 取 出, 以 1:2 或 l:3 以 上 的 比 率 转 移 到 另 外 的 容 器 中 进 行 培 养, 即 为 传 代 培 养 细 胞 一 代 指 从 细 胞 接 种 到 分 离 再 培 养 的 一 段 期 间, 与 细 胞 世 代 或 倍 增 不 同 在 一 代 中, 细 胞 培 增 3~6 次 细 胞 传 代 后, 一 般 经 过 三 个 阶 段 : 游 离 期 指 数 增 生 期 和 停 止 期 常 用 细 胞 分 裂 指 数 表 示 细 胞 增 殖 的 旺 盛 程 度, 即 细 胞 群 的 分 裂 相 数 /100 个 细 胞 一 般 细 胞 分 裂 指 数 介 于 0.2%~0.5%, 肿 瘤 细 胞 可 达 3~5% 细 胞 接 种 2~3 天 分 裂 增 殖 旺 盛, 是 活 力 最 好 时 期, 称 指 数 增 生 期 ( 对 数 生 长 期 ), 适 宜 进 行 各 种 试 验 ( 二 ) 操 作 1. 将 长 成 单 层 的 原 代 培 养 细 胞 或 HeLa 细 胞 从 二 氧 化 碳 培 养 箱 中 取 出, 在 超 净 工 作 台 中 倒 掉 瓶 内 的 培 养 液, 加 入 少 许 消 化 液 ( 以 液 面 盖 住 细 胞 为 宜 ), 静 置 5~10 分 钟 2. 在 倒 置 镜 下 观 察 被 消 化 的 细 胞, 如 果 细 胞 变 园, 相 互 之 间 不 再 连 接 成 片, 这 时 应 立 即 在 超 净 台 中 将 消 化 液 倒 掉, 加 入 3~5ml 新 鲜 培 养 液, 吹 打, 制 成 细 胞 悬 液 3. 将 细 胞 悬 液 吸 出 2ml 左 右, 加 到 另 一 个 培 养 瓶 中 并 向 每 个 瓶 中 分 别 加 3ml 左 右 培 养 液, 盖 好 瓶 塞, 送 回 二 氧 化 碳 培 养 箱 中, 继 续 进 行 培 养 ( 三 ) 结 果 一 般 情 况, 传 代 后 的 细 胞 在 2 小 时 左 右 就 能 附 着 在 培 养 瓶 壁 上,2~4 天 就 可 在 瓶 内 形 成 单 层, 需 要 再 次 进 行 传 代 三 器 材 及 液 体 的 准 备 和 无 菌 操 作 的 注 意 事 项 ( 一 ) 器 材 和 液 体 的 准 备 细 胞 培 养 用 的 玻 璃 器 材, 如 : 培 养 瓶 吸 管 等 在 清 洗 干 净 以 后, 装 在 铝 盒 和 铁 筒 中,120,2 小 时 干 烤 灭 菌 后 备 用 ; 手 术 器 材 瓶 塞 配 制 好 的 PBS 液 用 灭 菌 锅 15 磅,20 分 钟 蒸 气 灭 菌 ;MEM 培 养 液 小 牛 血 清 消 化 液 用 G6 滤 器 负 压 抽 滤 后 备 用 ( 二 ) 无 菌 操 作 中 的 注 意 事 项 在 无 菌 操 作 中, 一 定 要 保 持 工 作 区 的 无 菌 清 洁 为 此, 在 操 作 前 要 认 真 地 洗 手 并 用 75 % 乙 醇 消 毒 操 作 前 20~30 分 钟 起 动 超 净 台 吹 风 操 作 时, 严 禁 说 话, 严 禁 用 手 直 接 拿 无 菌 的 物 品, 如 瓶 塞 等, 而 要 用 器 械, 如 止 血 钳 镊 子 等 去 拿 培 养 瓶 要 在 超 净 台 内 才 能 打 开 瓶 塞, 打 开 之 前 用 乙 醇 将 瓶 口 消 毒, 打 开 后 和 加 塞 前 瓶 口 都 要 在 酒 精 灯 上 烧 一 下, 打 开 瓶 口 后 的 操 作 全 部 都 要 在 超 净 台 内 完 成 操 作 完 毕 后, 加 上 瓶 塞, 才 能 拿 到 超 净 台 外 使 用 的 吸 管 在 从 消 毒 的 铁 筒 中 取 出 后 要 手 拿 末 端, 将 尖 端 在 火 上 烧 一 下, 戴 上 胶 皮 乳 头, 然 后 再 去 吸 取 液 体 总 之, 在 整 个 无 菌 操 作 过 程 中 都 应 该 在 酒 精 灯 的 周 围 进 行 作 业 一 原 代 细 胞 和 传 代 细 胞 培 养 有 哪 些 区 别? 二 总 结 一 下 你 自 己 的 经 验, 怎 样 才 能 既 迅 速, 又 保 证 无 菌 操 作

27 实 验 十 细 胞 中 的 微 丝 染 色 及 微 丝 与 细 胞 形 态 的 实 验 观 察 实 验 目 的 掌 握 考 马 斯 亮 蓝 R250 染 细 胞 骨 架 微 丝 的 方 法, 了 解 动 物 细 胞 骨 架 的 基 本 形 态 结 构 实 验 用 品 1. 材 料 和 标 本 盖 片 的 培 养 的 成 纤 维 细 胞 C6 三 片 2. 器 材 和 仪 器 光 学 显 微 镜, 镊 子, 小 平 皿, 载 片, 吸 水 纸 37 恒 温 箱 3. 试 剂 PBS(pH7.2), 2%Triton X-100 液,M- 缓 冲 液,3% 戊 二 醛 固 定 液,0.2% 考 马 斯 亮 蓝 染 液, 100μL/mL 的 细 胞 松 弛 素 B,DEME 培 养 液 实 验 原 理 真 核 细 胞 胞 质 中 纵 横 交 错 的 纤 维 网 称 为 细 胞 骨 架 (cytoskeleton) 根 据 纤 维 直 径 组 成 成 分 和 组 装 结 构 的 不 同, 分 为 微 管 (microtubule, MT) 微 丝 (microfilament, MF) 和 中 间 纤 维 (intermediate filament, IF) 微 丝 是 肌 动 蛋 白 构 成 的 纤 维 (F-action) 单 根 微 丝 直 径 约 7nm, 在 光 学 显 微 镜 下 看 不 到 本 实 验 用 考 马 斯 亮 蓝 R250(Coomassie brilliant blue, R250) 显 示 微 丝 组 成 的 应 力 纤 维 应 力 纤 维 在 体 外 培 养 的 贴 壁 细 胞 中 尤 为 发 达, 形 态 长 而 直, 常 与 细 胞 的 长 轴 平 行 并 贯 穿 细 胞 全 长 细 胞 松 弛 素 B 可 与 微 丝 的 亚 单 位 肌 动 蛋 白 结 合, 从 而 破 坏 微 丝, 改 变 细 胞 的 形 状 考 马 斯 亮 蓝 R250 可 以 染 各 种 蛋 白, 并 非 特 异 染 微 丝 但 在 该 实 验 条 件 下, 微 管 结 构 不 稳 定, 有 些 类 型 的 纤 维 太 细, 光 镜 下 无 法 分 辨 因 此, 我 们 看 到 的 主 要 是 由 微 丝 组 成 的 应 力 纤 维 实 验 内 容 1. 成 纤 维 细 胞 微 丝 的 染 色 (1) 在 平 皿 中 用 盖 片 培 养 C6 成 纤 维 细 胞 (2) 将 盖 片 放 入 盛 有 PBS 的 平 皿 内 用 吸 管 轻 轻 吹 洗 盖 片, 换 液 三 次, 每 次 3min, 洗 去 培 养 液 (3) 将 盖 片 移 入 2%Triton X-100 液, 置 37 恒 温 箱 内 处 理 20~30min M- 缓 冲 液 有 稳 定 细 胞 骨 架 的 作 用 (4) 立 刻 将 盖 片 移 入 M- 缓 冲 液, 换 洗 三 次, 每 次 3min (5) 将 盖 片 移 入 3% 戊 二 醛 固 定 5min (6) 将 盖 片 移 入 0.2% 考 马 斯 亮 蓝 染 液 染 液 中, 染 色 15min 然 后 小 心 的 用 自 来 水 冲 洗, 空 气 干 燥 2. 成 纤 维 细 胞 微 丝 对 细 胞 松 弛 素 B 的 反 应 (1) 在 平 皿 中 有 三 张 成 纤 维 细 胞 贴 壁 生 长 的 盖 片, 在 超 净 工 作 台 内 将 一 张 盖 片 移 入 另 一 平 皿 中 继 续 培 养, 用 作 对 照

28 (2) 在 有 两 片 的 平 皿 内 加 100μL/mL 的 细 胞 松 弛 素 B 4 滴 继 续 培 养 半 h (3) 将 用 细 胞 松 弛 素 B 处 理 过 的 两 张 盖 片 取 一 张 做 染 色 处 理, 另 一 张 用 培 养 液 洗 五 次 ( 在 平 皿 内 换 5 次 培 养 液, 每 次 都 要 摇 动 ), 继 续 培 养 观 察 2h 后 细 胞 形 态 恢 复, 接 近 正 常 (4) 对 恢 复 的 盖 片 与 第 一 张 没 用 药 的 盖 片 一 同 做 染 色 处 理 注 意 事 项 1. 洗 片 时 要 轻 柔, 以 免 把 细 胞 从 载 片 上 洗 去 2. 恢 复 时 间 要 足 够, 否 则 细 胞 不 会 恢 复 到 未 处 理 前 的 情 况 3. 细 胞 盖 片 注 意 正 反 面 4. 染 色 后 应 冲 洗 盖 片 背 面, 避 免 损 伤 细 胞 观 察 要 点 1. 光 镜 下 观 察 被 染 成 蓝 色 的 微 丝 聚 集 成 的 张 力 纤 维 束 ( 注 意 成 纤 维 细 胞 中 微 丝 分 布 的 特 点 ); 2. 注 意 观 察 正 常 对 照 片 与 用 药 处 理 后 的 标 本 成 纤 维 细 胞 形 状 的 区 别 ; 3. 观 察 用 药 处 理 后 又 洗 去 药 的 标 本 细 胞 形 状 是 否 恢 复 正 常

29 实 验 十 一 应 用 细 胞 融 合 技 术 制 备 染 色 体 提 前 凝 集 标 本 实 验 目 的 通 过 细 胞 融 合 技 术, 初 步 了 解 染 色 体 提 前 凝 集 标 本 制 备 原 理 方 法 及 间 期 细 胞 三 种 时 相 的 提 前 凝 集 染 色 体 特 点 实 验 用 品 1. 材 料 人 宫 颈 癌 上 皮 细 胞 (Hela 细 胞 ) 2. 器 材 和 仪 器 光 学 显 微 镜 离 心 机 水 浴 箱 热 吹 风 机 10ml 刻 度 离 心 管 5 号 针 头 注 射 器 试 管 架 试 管 夹 染 色 槽 废 液 缸 冰 冻 载 玻 片 吸 水 纸 擦 镜 纸 香 柏 油 瓶 记 号 笔 酒 精 灯 3. 试 剂 50%PEG Hanks 液 (ph7.4) RPMI-1640 培 养 基 ( 含 10% 灭 活 小 牛 血 清,pH7.4) 10ug/ml 秋 水 仙 素 0.075mol/L KCl 低 渗 液 0.2% 次 甲 基 兰 染 液 1/15mol/L PBS Carnoy 固 定 液 Giemsa 染 液 实 验 原 理 在 自 然 条 件 下 或 用 人 工 的 方 法 ( 物 理 化 学 或 生 物 ) 将 两 个 或 两 个 以 上 的 同 种 或 不 同 种 细 胞 融 合 成 一 个 细 胞 的 过 程 称 为 细 胞 融 合 七 十 年 代 初, 由 于 发 现 M 期 细 胞 内 有 某 种 促 进 染 色 体 凝 集 因 子, 它 无 种 属 特 异 性, 所 以 在 细 胞 融 合 和 染 色 体 技 术 的 基 础 上, 建 立 了 制 备 染 色 体 提 前 凝 集 标 本 的 方 法 即 让 M 期 细 胞 与 间 期 (I 期 ) 细 胞 融 合, 从 而 诱 导 I 期 细 胞 染 色 质 提 前 浓 缩 成 染 色 体 形 成 的 这 种 染 色 体 称 提 前 凝 集 的 染 色 体 (Prematurely Condensed Chromosome, PCC) 这 项 技 术 已 应 用 于 细 胞 周 期 分 析 正 常 细 胞 和 肿 瘤 细 胞 染 色 体 的 微 细 结 构 的 研 究 多 种 因 素 作 用 细 胞 使 染 色 体 损 伤 及 修 复 效 应 的 研 究, 预 测 某 种 血 液 病 的 病 程 愈 后 及 复 发 的 临 床 实 践 等 方 面 实 验 方 法 1. 收 集 培 养 的 M 期 Hela 细 胞 (1) 取 一 瓶 处 于 对 数 生 长 期 的 Hela 细 胞, 向 培 养 基 中 加 入 10ug/ml 的 秋 水 仙 素 使 终 浓 度 为 0.04ug/ml (2) 在 37 二 氧 化 碳 培 养 箱 中 继 续 培 养 12h, 使 大 量 生 长 的 细 胞 被 阻 断 于 M 期 (3) 每 组 取 一 瓶 经 上 述 处 理 的 细 胞, 以 平 行 于 细 胞 生 长 面 方 向 反 复 振 摇, 使 培 养 液 不 断 冲 刷 细 胞 层 ( 或 用 吸 管 吹 打 ),M 期 细 胞 因 变 成 球 形 容 易 脱 离 瓶 壁 而 悬 浮 (4) 将 含 有 M 期 细 胞 的 培 养 基 移 入 离 心 管 中,1000rpm 离 心 5min (5) 弃 去 上 清, 加 入 5ml Hanks 液, 用 吸 管 吹 打 成 细 胞 悬 液 2. 收 集 培 养 的 Hela 细 胞 (1) 取 一 瓶 生 长 良 好 的 Hela 细 胞, 弃 去 培 养 基 (2) 加 入 少 量 0.25% 的 胰 蛋 白 酶 消 化 2-3min, 弃 去 胰 酶 消 化 液 (3) 加 入 5ml Hanks 液, 用 吸 管 吹 打 成 单 个 悬 浮 细 胞 备 用

30 3.50% PEG 的 制 备 (1) 称 取 0.5g PEG(MW 4,000), 倒 入 离 心 管 中 (2) 在 酒 精 灯 上 加 热 使 之 融 化 ( 约 为 0.5ml) (3) 再 加 入 预 热 的 Hanks 液 0.5ml, 混 匀, 置 37 水 浴 中 待 用 4. 细 胞 融 合 (1) 将 上 述 两 管 细 胞 倒 入 一 个 离 心 管 中 充 分 混 匀 1000rpm 离 心 5min, 弃 上 清, 再 小 心 地 吸 尽 残 液 (2) 用 指 弹 法 弹 散 细 胞, 在 37 水 浴 条 件 下 吸 取 0.5ml 50% PEG, 逐 滴 加 入 离 心 管 中, 并 不 断 地 轻 轻 摇 动, 整 个 过 程 约 90 秒 钟 然 后, 迅 速 加 入 5ml Hanks 液 以 终 止 PEG 的 作 用 在 37 水 浴 中 静 置 5min (3)1000rpm 离 心 5min, 弃 上 清, 加 入 2ml 含 有 血 清 的 RPML-1640 培 养 基, 同 时 用 5 号 针 头 的 注 射 器 垂 直 加 入 10ug/ml 的 秋 水 仙 素 1 滴, 轻 轻 吹 打 成 悬 液,37 水 浴 中 温 育 30~ 60min 5. 制 备 PCC 标 本 (1) 细 胞 温 育 后, 以 1000rpm 离 心 5min, 弃 上 清, 加 入 10ml 0.075mol/L KCL 低 渗 液 轻 轻 制 成 悬 液 (2) 在 37 处 理 25min 左 右, 终 止 时 加 入 1ml Carnoy 固 定 液 进 行 固 定 (3)1000rpm 离 心 8min, 弃 上 清, 指 弹 离 心 管 底 部 使 细 胞 分 散, 加 入 10ml Carnoy 固 定 液 固 定 30min (4)1000rpm 离 心 5min, 弃 去 上 清, 留 0.2ml 残 液, 用 吸 管 轻 轻 吹 打 成 悬 液 (5) 取 预 冷 的 载 玻 片, 制 一 张 滴 片, 烤 干 (6)Giemsa 染 色 15min 左 右, 水 洗, 干 燥 后 镜 检 观 察 要 点 在 低 倍 镜 下, 可 以 容 易 地 找 到 M 期 与 I 期 细 胞 融 合 而 诱 导 产 生 的 PCC 图 像, 由 于 处 于 I 期 不 同 时 相 的 细 胞 均 能 与 M 期 细 胞 融 合 而 被 诱 导 产 生 PCC, 因 此 有 三 种 不 同 形 态 特 点 的 提 前 凝 集 染 色 体 :G 1 期 PCC S 期 PCC 和 G 2 期 PCC 其 形 态 特 点 分 别 是 : G 1 期 PCC 为 单 线 染 色 体, 细 长, 着 色 浅 呈 蓬 松 的 线 团 状 ; S 期 PCC 由 于 染 色 体 解 旋,DNA 以 多 点 进 行 复 制, 复 制 后 的 部 分 着 色 较 深, 以 双 线 染 色 体 片 段 形 式 存 在, 故 呈 粉 碎 颗 粒 状 结 构 ; G 2 期 PCC 因 DNA 复 制 完 毕, 所 以 可 见 凝 集 的 双 线 染 色 体, 但 较 M 期 染 色 体 细 长 根 据 上 述 I 期 各 时 期 PCC 特 点, 在 自 己 制 备 的 标 本 中 观 察 并 分 析 各 期 PCC 的 图 像

31 实 验 十 二 放 线 菌 素 D 诱 导 HL60 细 胞 凋 亡 的 实 验 观 察 实 验 目 的 1. 熟 悉 凋 亡 细 胞 的 形 态 学 特 征 和 生 化 改 变 2. 掌 握 细 胞 传 代 培 养 的 基 本 步 骤 及 无 菌 操 作 技 术 3. 掌 握 基 因 组 DNA 的 常 规 提 取 方 法 4. 掌 握 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 及 SDS-PAGE 的 基 本 原 理 和 操 作 要 点 5. 熟 悉 Hoechst33258 和 Giemsa 两 种 细 胞 染 色 方 法, 学 会 荧 光 显 微 镜 的 使 用 6. 掌 握 Western 免 疫 印 迹 方 法 的 原 理 和 基 本 操 作 7. 了 解 采 用 流 式 细 胞 仪 进 行 细 胞 分 析 的 原 理 和 操 作 过 程 实 验 用 品 1. 材 料 和 标 本 人 白 血 病 细 胞 HL60 细 胞 2. 器 材 和 仪 器 微 量 加 样 器 微 量 注 射 器 加 样 枪 头 玻 璃 匀 浆 器 离 心 管 三 角 烧 瓶 载 波 片 电 泳 仪 垂 直 电 泳 槽 水 平 电 泳 槽 水 浴 锅 涡 流 振 荡 器 微 波 炉 高 压 锅 转 移 电 泳 槽 恒 温 水 浴 摇 床 多 用 脱 色 摇 床 紫 外 透 射 仪 高 速 冷 冻 离 心 机 普 通 高 速 离 心 机 CO2 孵 箱 超 净 台 紫 外 - 可 见 光 分 光 光 度 仪 流 式 细 胞 仪 20 低 温 冰 箱 3. 试 剂 放 线 菌 素 D 琼 脂 糖 异 丙 醇 70% 乙 醇 DNA marker 溴 化 乙 锭 Giemsa 染 液 PI 染 液 0.15mol/L NaCl 溶 液 TAE 缓 冲 液 丙 稀 酰 胺 过 硫 酸 胺 双 蒸 水 TEMED SDS TE 缓 冲 液 考 马 斯 亮 蓝 R250 甲 醇 冰 醋 酸 电 泳 样 品 缓 冲 液 转 移 缓 冲 液 甘 氨 酸 Tris 碱 浓 HCl 双 蒸 水 甲 醇 单 去 污 剂 裂 解 液 0.01mol/L PBS (ph7.3) 蛋 白 分 子 量 Marker 封 闭 液 TBST TBS 洗 脱 抗 体 缓 冲 液 显 影 液 定 影 液 抗 体 化 学 发 光 试 剂 实 验 原 理 细 胞 凋 亡 是 发 生 于 细 胞 内 的 由 基 因 控 制 的 自 主 性 死 亡 过 程 伴 随 凋 亡 的 发 生, 细 胞 将 出 现 一 系 列 的 形 态 学 和 生 化 改 变, 主 要 包 括 细 胞 皱 缩 染 色 质 凝 集 凋 亡 小 体 形 成 DNA 片 段 化 等 目 前 已 发 展 了 各 种 针 对 凋 亡 细 胞 特 征 的 检 测 方 法, 可 对 凋 亡 细 胞 进 行 分 析, 以 研 究 凋 亡 的 发 生 机 制 及 各 种 诱 导 因 素 的 作 用 等 本 实 验 将 通 过 抗 肿 瘤 药 物 放 线 菌 素 D 对 人 白 血 病 细 胞 的 诱 导 凋 亡 作 用, 检 测 凋 亡 过 程 中 细 胞 的 形 态 学 及 生 化 改 变 细 胞 培 养 是 一 种 模 拟 体 内 生 理 环 境, 使 细 胞 在 体 外 存 活 并 生 长 繁 殖 的 技 术, 可 为 各 种 细 胞 研 究 提 供 具 有 良 好 均 一 性 的 细 胞 来 源 维 持 细 胞 体 外 繁 殖 的 主 要 手 段 是 进 行 细 胞 的 传 代 培 养, 即 将 培 养 中 的 细 胞 分 散, 从 容 器 中 取 出, 以 1:2 或 1:3 以 上 的 比 率 转 移 到 另 外 的 容 器 中 进 行 培 养 本 实 验 将 通 过 传 代 培 养 过 程 获 得 所 细 胞 放 线 菌 素 D 是 抗 肿 瘤 类 抗 生 素, 其 主 要 作 用 是 通 过 与 DNA 结 合, 阻 断 依 赖 DNA 的 mrna 的 合 成, 从 而 阻 碍 蛋 白 质 合 成, 抑 制 瘤 细 胞 分 裂, 引 起 细 胞 凋 亡 细 胞 凋 亡 时, 发 生 染 色 质 凝 集 核 破 裂 凋 亡 小 体 形 成 等 形 态 学 改 变, 在 对 细 胞 进 行 染

32 色 处 理 后, 可 在 光 学 显 微 镜 下 观 察 Hoechst33258 为 与 A-T 结 合 的 特 异 性 DNA 荧 光 染 料, 对 活 细 胞 和 固 定 细 胞 均 能 染 色 Giemsa 是 一 种 复 合 染 料, 可 对 染 色 体 染 色 流 式 细 胞 术 是 一 种 可 对 细 胞 进 行 精 确 分 选 和 分 析 的 技 术 PI 是 一 种 DNA 特 异 性 荧 光 染 料, 同 细 胞 的 结 合 与 DNA 含 量 成 正 比, 利 用 此 特 点 流 试 细 胞 仪 可 将 处 于 不 同 细 胞 周 期 的 细 胞 分 开 细 胞 凋 亡 时, 染 色 质 凝 聚,DNA 裂 解, 在 制 备 样 品 过 程 中, 低 分 子 量 的 DNA 片 段 扩 散, 加 之 凝 聚 的 染 色 质 排 斥 染 色, 致 使 凋 亡 细 胞 的 可 染 性 低, 在 直 方 图 的 G0/G1 期 峰 前 出 现 特 殊 的 亚 二 倍 体 峰 细 胞 凋 亡 时, 细 胞 内 核 酸 内 切 酶 活 化, 特 异 性 地 切 断 核 小 体 连 接 区 DNA, 形 成 长 度 为 bp 整 数 倍 的 核 苷 酸 片 段, 进 行 琼 脂 糖 电 泳 时 会 出 现 特 征 性 的 梯 形 条 带 EB 染 液 能 特 异 性 插 入 双 链 DNA, 在 紫 外 照 射 下 可 检 测 到 DNA 条 带 目 前 研 究 表 明,Bcl2 基 因 家 族 与 细 胞 凋 亡 的 发 生 密 切 相 关,Bcl2 是 Bcl2 家 族 的 主 要 代 表, 具 有 抑 制 凋 亡 的 作 用, 放 线 菌 素 D 在 诱 导 细 胞 凋 亡 过 程 中 Bcl2 的 表 达 量 下 调, 可 通 过 western blot 检 测 Western blot 即 免 疫 印 迹 技 术, 是 一 种 检 测 混 合 蛋 白 组 分 中 特 定 蛋 白 成 分 的 方 法 基 本 过 程 是 将 经 过 SDS-PAGE 分 离 的 蛋 白 条 带, 通 过 电 转 移 的 方 式 从 凝 胶 转 至 硝 酸 纤 维 素 薄 膜 等 固 相 载 体 上, 膜 上 蛋 白 质 保 持 与 胶 相 对 应 的 原 位 上 固 相 载 体 上 的 蛋 白 质 作 为 抗 原, 与 特 异 性 的 抗 体 孵 育 反 应, 再 与 酶 标 记 的 第 二 抗 体 反 应, 经 过 底 物 显 色 即 可 对 特 定 蛋 白 成 分 进 行 检 测 实 验 内 容 一 细 胞 的 传 代 培 养 1. 取 培 养 于 培 养 瓶 中, 处 于 对 数 生 长 期 的 HL60 细 胞, 倒 入 10ml 无 菌 离 心 管 中 rpm 离 心 5min. 3. 弃 去 培 养 液, 加 入 新 鲜 培 养 液, 分 装 于 2 个 培 养 瓶 中, 培 养 箱 中 培 养 二 : 细 胞 基 因 组 DNA 的 提 取 1. 药 物 处 理 : 取 处 于 对 数 生 长 期 的 HL60 细 胞 ( 个 /ml) 加 入 放 线 菌 素 D 至 终 浓 度 50 μg/ml,37 度 孵 育 20h. 2. 收 集 细 胞 :4 0 C,1500 g, 离 心 5min, 弃 上 清 3. 细 胞 重 悬 于 冰 冷 的 PBS 漂 洗 一 次, 离 心 收 集 4. 加 入 DNA 消 化 液 500μl, 再 加 入 20mg/ml 的 蛋 白 酶 K5μl, 翻 转 混 匀 ( 动 作 轻 ),55 0 C 水 浴 1h 5. 加 入 体 积 的 酚 : 氯 仿 : 异 丙 醇, 慢 慢 旋 转 混 匀, 倾 斜 使 两 相 接 触 面 积 增 大 C 离 心,10,000g,10min. 7. 小 心 吸 取 上 层 含 DNA 的 水 相 至 新 管, 加 入 1/10 体 积 的 3mol/l 醋 酸 钠, 小 心 充 分 混 匀, 再 加 入 2.5 倍 体 积 的 预 冷 无 水 乙 醇, 混 匀,-20 0 C 放 置 30min C 离 心,12,000g,5min, 弃 上 清,75% 预 冷 无 水 乙 醇 月 1ml 洗 涤 沉 淀 C 离 心,12,000g,5min, 弃 上 清, 室 温 干 燥 约 10min 10. 加 入 适 量 的 TE 溶 液 ( 约 40μl) 溶 解,4 0 C 保 存 备 用

33 三. 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 细 胞 凋 亡 1. 灌 制 琼 脂 糖 凝 胶 (1) 备 好 注 胶 槽, 插 上 梳 子 (2) 称 1g 琼 脂 糖, 加 100ml TAE 于 锥 形 瓶 中, 微 波 炉 加 热 溶 解 (3) 向 胶 槽 中 注 入 温 热 的 1% 琼 脂 糖 胶, 胶 层 厚 度 约 3-5mm. (4) 室 温 静 置 30-45min, 使 琼 脂 糖 完 全 凝 结 小 心 拔 出 梳 子, 将 凝 胶 放 入 电 泳 槽, 使 梳 孔 端 靠 近 阴 极 ( 黑 色 ) (5) 向 电 泳 槽 中 加 入 TAE, 使 液 面 超 过 凝 胶 层 1cm 2. 加 样, 电 泳 (1) 在 蜡 膜 上 分 别 加 3 滴 6 lodingbuffer, 每 滴 2μl (2) 从 4 0 C 冰 箱 中 取 出 制 备 好 的 未 经 放 线 菌 素 D 和 经 过 放 线 菌 素 D 处 理 的 DNA 样 品 各 10 μl, 加 入 到 loding buffer 中 在 余 下 的 一 滴 中 加 入 5μl DNAmarker 和 5μl 灭 菌 去 离 子 水, 反 复 吸 打, 充 分 混 合 (3) 用 加 样 器 分 别 把 上 述 样 品 缓 慢 加 至 琼 脂 糖 凝 胶 的 加 样 孔 中 (4) 盖 上 电 泳 槽 盖, 接 好 电 泳 插 头, 打 开 电 源, 电 压 调 至 v, 电 泳 45-60min. (5) 将 电 压 调 至 零, 关 电 源, 拔 出 电 源 插 头, 打 开 电 泳 槽 盖 3. 染 色 观 察 (1) 取 出 凝 胶, 加 入 含 有 EB 的 溶 液 中, 室 温 浸 染 20min (2) 于 暗 室 中, 在 紫 外 灯 下 进 行 观 察 (3) 染 色 结 果 : 经 放 线 菌 素 D 处 理 的 细 胞 在 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 上 呈 现 阶 梯 状 DNA 区 带 图 谱 (DNA ladder), 这 是 细 胞 凋 亡 的 重 要 化 学 特 征 而 未 经 处 理 的 细 胞 则 没 有 DNA 凋 亡 所 特 有 的 梯 形 条 带 DNA 断 裂 情 况 可 与 对 照 比 较, 断 裂 程 度 用 DNAmarker 所 显 条 带 度 量 四. 凋 亡 细 胞 普 通 光 镜 下 的 形 态 观 察 Giemsa 染 色 法 1. 收 集 凋 亡 细 胞 悬 液 于 1.5ml 离 心 管 中,4 0 C,500g, 离 心 5min 2. 弃 上 清, 将 细 胞 重 悬 于 PBS 液 中, 制 成 细 胞 悬 液 3. 取 100ml 细 胞 悬 液, 涂 于 载 玻 片 上, 晾 干 4. 用 甲 醇 固 定 1min, 充 分 晾 干 5. 滴 加 Giemsa 染 液, 室 温 染 色 5min. 6. 用 二 甲 苯 浸 泡 3min, 去 除 杂 质, 待 载 片 透 明 后, 以 树 脂 封 片 7. 用 普 通 显 微 镜 观 察 8. 观 察 结 果 :Giemsa 染 色 的 标 本, 细 胞 核 红 紫 色, 细 胞 质 兰 色, 凋 亡 细 胞 的 核 染 色 质 固 缩 边 集, 染 色 较 深 或 核 破 裂 ; 细 胞 膜 褶 皱, 卷 曲, 或 出 苞 芽 生, 形 成 凋 亡 小 体 五. 凋 亡 细 胞 的 荧 光 显 微 镜 下 形 态 观 察 1. 收 集 凋 亡 细 胞 :1000g/ml 离 心 5min, 弃 上 清

34 2.PBS 漂 洗 悬 浮 细 胞 3. 固 定 液 固 定 5min, g, 离 心 5min, 弃 上 清. 4. 蒸 馏 水 洗, g, 离 心 5min, 弃 上 清 5. 调 整 细 胞 数 至 /ml. 6. 取 100μl 细 胞 悬 液, 加 入 1μl Hoeschst33258 染 液, 染 色 10min 7. 将 10μl 染 色 的 悬 浮 细 胞 涂 于 载 波 片 8. 放 于 荧 光 显 微 镜 下 观 察 选 用 UV 激 发 滤 片 和 nm 阻 断 滤 片 9. 结 果 观 察 : 细 胞 核 呈 蓝 色 凋 亡 细 胞 的 核 染 色 质 凝 聚 且 边 缘 化, 或 玻 珠 化, 并 可 呈 现 DNA 荧 光 碎 片 六. 凋 亡 细 胞 的 流 式 细 胞 法 检 测 1. 收 集 凋 亡 细 胞 2. 冷 PBS 洗 2 次 后 制 成 /ml 细 胞 悬 液 3. 加 入 冷 100% 乙 醇 ( 乙 醇 : 细 胞 悬 液 =7:3), 4 0 C 固 定 12h 以 上 4. 冷 PBS 洗 两 次 5. 用 500μl PBS 重 悬 细 胞, 加 入 RNA 酶 ( 终 浓 度 为 0.1mg/ml) 目 的 尼 龙 网 过 滤 7. 加 入 PI 800μl 4 0 C 保 持 30min 8. 流 式 细 胞 仪 分 析 : 检 验 样 品 前, 通 过 调 整 流 式 细 胞 仪 的 域 值 排 除 细 胞 碎 片 细 胞 碎 片 前 散 射 光 (FSC), 侧 散 射 光 (SSC) 和 FL2 都 很 低 ; 凋 亡 细 胞 的 SSC 高,FL2 中 等 凋 亡 细 胞 在 直 方 图 的 亚 二 倍 体 区 在 FSC 对 SSC 的 散 点 图 上, 与 正 常 细 胞 相 比, 凋 亡 细 胞 的 前 散 射 光 降 低, 侧 散 射 光 可 高 可 低 依 细 胞 类 型 而 定 七.SDS-PAGE 电 泳 及 western blot 检 测 凋 亡 前 后 细 胞 的 Bcl2 表 达 量 ( 一 ) 蛋 白 样 品 的 制 备 1. 取 经 过 和 未 经 过 放 线 菌 素 D 处 理 的 细 胞 2. 将 细 胞 悬 液 分 别 倒 至 15ml 离 心 管 中, 于 2500rpm 离 心 5min 3. 弃 上 清, 加 入 4ml PBS 并 轻 轻 吹 打 洗 涤,2500rpm 离 心 5min 弃 上 清, 用 PBS 重 复 洗 涤 一 次 4. 吸 去 上 清, 加 100 l 裂 解 液 ( 含 PMSF) 冰 上 裂 解 30min, 裂 解 过 程 中 要 经 常 弹 一 弹, 以 使 细 胞 充 分 裂 解 5.4,12000rpm 离 心 5min, 取 上 清, 分 装 于 0.5ml 离 心 管 中, 作 好 标 记,-20 保 存 ( 二 ) 蛋 白 含 量 的 测 定 1. 制 作 标 准 曲 线 (1) 配 制 1mg/ml BSA 水 溶 液 (2) 取 18 个 1.5ml 离 心 管,3 个 一 组, 分 别 标 记 为 0 g,2.5 g,5.0 g,10.0 g,20.0 g, 40.0 g

35 (3) 按 下 表 在 各 管 中 加 入 各 种 试 剂 0 g 2.5 g 5.0 g 10.0 g 20.0 g 40.0 g 1mg/ml BSA l 5.0 l 10.0 l 20.0 l 40.0 l 0.15mol/L NaCl 100 l 97.5 l 95.0 l 90.0 l 80.0 l 60.0 l G250 考 马 斯 亮 蓝 溶 液 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml (4) 混 匀 后, 室 温 放 置 2min 在 生 物 分 光 光 度 计 (Bio-Photometer,Eppentoff) 上 比 色 分 析, 绘 制 标 准 曲 线 2. 检 测 样 品 蛋 白 含 量 (1) 取 3 个 1.5ml 离 心 管, 每 管 加 入 考 马 斯 亮 蓝 溶 液 1ml,0.15mol/L NaCl 溶 液 95 l, 混 匀 (2) 3 个 离 心 管 中 分 别 加 入 5 l 双 蒸 水 处 理 和 未 经 放 线 菌 素 D 处 理 的 蛋 白 样 品 (3) 将 样 品 倒 入 比 色 池, 空 白 作 参 比, 进 行 检 测 (4) 根 据 标 准 曲 线 计 算 蛋 白 含 量 ( 三 )SDS-PAGE 电 泳 1. 样 品 制 备 取 上 述 测 定 蛋 白 含 量 后 的 样 品, 计 算 含 50 g 蛋 白 的 溶 液 体 积 即 为 上 样 量 加 入 等 体 积 的 2 电 泳 样 品 缓 冲 液, 制 成 样 品 液 取 配 制 好 的 样 品 液 及 蛋 白 分 子 量 Marker 95 加 热 5min, 备 用 2. 灌 胶 取 两 块 平 板 玻 璃 ( 其 中 一 块 带 有 垫 片 ), 安 装 到 制 胶 装 置 上, 分 别 灌 制 分 离 胶 和 浓 缩 胶, 待 胶 凝 固 后, 从 预 制 装 置 上 取 下 移 入 电 泳 槽 (1) 12% 分 离 胶 的 灌 制 双 蒸 水 3.3ml 30% 丙 稀 酰 胺 4.0ml 1.5mol/L Tris-HCl (ph 8.8) 2.5ml 10% SDS 0.1ml 10% 过 硫 酸 胺 0.1ml TEMED 5μl 按 上 述 配 方 和 顺 序 配 制 分 离 胶, 一 旦 加 入 TEMED 后, 应 立 即 混 匀 注 入 电 泳 板 中, 直 至 胶 面 距 玻 璃 板 顶 端 约 2.5cm 用 吸 管 吸 取 蒸 馏 水 适 量 加 到 胶 的 顶 端, 覆 盖 封 闭 室 温 聚 合 30min, 待 胶 凝 固 后 ( 可 见 聚 合 凝 胶 与 表 面 水 层 之 间 出 现 明 显 界 面 ), 倒 掉 胶 表 面 水 分, 双 蒸 水 洗 凝 胶 上 部 二 次, 滤 纸 吸 干 水 分 (2)5% 浓 缩 胶 的 灌 制 双 蒸 水 6.8ml 30% 丙 稀 酰 胺 1.7ml 1.0mol/L Tris-HCl (ph 6.8) 1.25ml

36 10% SDS 0.1ml 10% 过 硫 酸 胺 0.1ml( 现 用 现 配 ) TEMED 10μl 将 按 上 述 配 方 和 顺 序 配 制 的 浓 缩 胶 加 至 已 经 凝 固 的 分 离 胶 上 应 注 意 控 制 加 入 体 积, 距 电 泳 板 顶 端 留 出 一 定 距 离, 插 入 梳 子 室 温 聚 合 30min 后, 将 其 从 予 制 装 置 上 取 下, 移 入 电 泳 槽 3. 加 样 电 泳 在 电 泳 上 下 槽 中 放 入 1 电 泳 缓 冲 液, 将 梳 子 从 电 泳 板 中 取 出, 用 上 槽 缓 冲 液 冲 洗 梳 孔, 取 煮 沸 处 理 的 处 理 前 及 未 处 理 蛋 白 样 品 液 各 20μl, 蛋 白 分 子 量 Marker 5μl 注 入 加 样 孔 连 接 好 正 负 极 及 电 源,80V 恒 压 下 电 泳, 待 溴 酚 蓝 指 示 剂 移 动 接 近 胶 边 缘 时, 停 止 电 泳 ( 四 ) 转 膜 1. 将 电 泳 后 的 胶 取 出, 浸 入 转 移 缓 冲 液 平 衡 5min 2.PVDF 膜 在 甲 醇 中 短 暂 浸 泡, 在 转 移 缓 冲 液 中 浸 泡 15min 3. 将 专 用 滤 纸 和 垫 片 浸 泡 于 转 移 缓 冲 液 中 4. 安 装 电 泳 三 明 治, 应 在 转 移 液 中 进 行, 安 装 顺 序 为 : 阳 极 - 垫 片 - 专 用 滤 纸 -PVDF 膜 - 蛋 白 PAGE 胶 - 专 用 滤 纸 - 垫 片 - 阴 极 注 意 : 在 放 完 最 上 面 一 层 滤 纸 后, 用 试 管 或 玻 璃 棒 赶 走 所 有 气 泡 5. 将 夹 心 凝 胶 放 入 电 转 移 仪 中, 加 入 转 移 缓 冲 液 45V 恒 压, 于 4 电 转 过 夜 6. 电 泳 结 束 后, 切 除 膜 多 余 部 分, 切 角 标 记 方 向 ( 五 ) 杂 交 1. 将 膜 用 TBS 从 下 向 上 浸 湿 后, 移 至 含 有 封 闭 液 的 平 皿 中, 室 温 下 脱 色 摇 床 上 摇 动 封 闭 1h 2. 将 一 抗 Bcl2 抗 体 及 GAPDH 抗 体 用 TBST 稀 释 至 适 当 浓 度 ( 在 1.5ml 离 心 管 中 ); 室 温 下 孵 育 1~2h. 3.TBST 室 温 下 洗 两 次, 每 次 10min 4.TBS 洗 一 次,10min 5. 加 入 二 抗 稀 释 液, 室 温 下 孵 育 1~2h 6.TBST 室 温 下 洗 两 次, 每 次 10min 7.TBS 洗 一 次,10min ( 六 ) 化 学 发 光, 显 影, 定 影 1. 将 A 和 B 两 种 试 剂 在 保 鲜 膜 上 等 体 积 混 合, 静 止 1min 2. 将 膜 蛋 白 面 朝 下 与 混 合 液 充 分 接 触 3.1min 后, 将 膜 移 至 另 一 保 鲜 膜 上, 去 尽 残 液, 包 好, 放 入 X- 光 片 夹 中 4. 在 暗 室 中 在 红 灯 下 取 出 X- 光 片, 剪 裁 至 适 当 大 小 5. 打 开 X- 光 片 夹, 把 X- 光 片 放 在 膜 上, 关 上 X- 光 片 夹 6. 根 据 信 号 的 强 弱 适 当 调 整 曝 光 时 间, 一 般 为 1min 或 5min, 也 可 选 择 不 同 时 间 多 次 压 片, 以 达 最 佳 效 果

37 7. 曝 光 完 成 后, 取 出 X- 光 片, 迅 速 浸 入 显 影 液 中 显 影, 待 出 现 明 显 条 带 后, 即 刻 终 止 显 影 显 影 时 间 一 般 为 1~2min(20~25 ) 8. 显 影 结 束 后, 马 上 把 X- 光 片 浸 入 定 影 液 中, 定 影 时 间 一 般 为 5~10min, 以 胶 片 透 明 为 止 9. 用 自 来 水 冲 去 残 留 的 定 影 液 后, 室 温 下 晾 干 ( 七 ) 凝 胶 图 象 分 析 1. 将 胶 片 进 行 扫 描 或 拍 照, 用 凝 胶 图 象 处 理 系 统 分 析 目 标 带 的 分 子 量 和 净 光 密 度 值 2. 与 内 参 照 GAPDH 的 比 值 代 表 Bcl2 蛋 白 表 达 的 相 对 水 平 3. 结 果 : 与 凋 亡 前 相 比,Bcl2 的 量 明 显 减 少 注 意 事 项 1. 对 大 片 段 DNA 不 能 振 荡, 应 轻 轻 反 复 翻 动 离 心 管, 以 免 机 械 剪 切 力 损 伤 DNA 链 2. 收 集 沉 淀 DNA 时 需 格 外 小 心 3. 样 品 加 入 样 孔 的 位 置 应 该 合 适 4. 由 教 师 或 实 验 员 操 作 流 式 细 胞 仪 5. 撬 玻 璃 板 时 一 定 要 小 心, 玻 板 很 易 裂 6. 膜 两 边 的 滤 纸 不 能 相 互 接 触, 接 触 后 会 发 生 短 路 7. 拿 放 X 光 片 的 时 候 要 注 意 避 光 8.EB 染 液,PI 染 液, 聚 合 前 丙 稀 酰 胺 有 巨 毒, 应 带 乳 胶 手 套 操 作 9. 污 染 物 应 放 入 专 用 容 器 内, 妥 善 处 理

38 实 验 十 三 MAPK 信 号 通 路 与 乳 腺 癌 细 胞 增 殖 及 可 能 机 制 的 探 索 性 实 验 实 验 目 的 1. 探 讨 乳 腺 癌 细 胞 中 MAPK 信 号 转 导 通 路 异 常 激 活 与 乳 腺 癌 细 胞 增 殖 的 关 系 及 可 能 机 制 2. 掌 握 western blot 实 验 的 原 理 及 操 作 过 程 3. 掌 握 检 测 细 胞 生 长 情 况 的 三 种 不 同 方 法 4. 实 验 用 品 1. 材 料 和 标 本 MCF-7 细 胞 2. 器 材 和 仪 器 微 量 加 样 器 枪 头 离 心 管 电 泳 仪 转 印 槽 荧 光 显 微 镜 酶 标 仪 流 式 细 胞 仪 BIO-RAD 转 印 仪 水 平 摇 床 恒 温 水 浴 箱 PCR 扩 增 仪 低 温 高 速 离 心 机 3. 试 剂 脂 质 体 台 盼 兰 MTT 液 盐 酸 异 丙 醇 乙 醇 PI 染 液 EGF 磷 酸 盐 缓 冲 液 p - ERK1/ 2 抗 体 Protein A sepharose 激 酶 缓 冲 液 髓 鞘 碱 性 蛋 白 Laemmli 缓 冲 液 脱 脂 奶 粉 TBST cyclind1 抗 体 c-myc 抗 体 绿 色 荧 光 蛋 白 载 体 (pegfp-c1) Tris, 甘 氨 酸, 灭 菌 去 离 子 水 甲 醇 Tween20 ECL 发 光 kit M-MuLV 反 转 录 酶 氯 仿 Trizol Taq DNA 聚 合 酶 引 物 琼 脂 糖 凝 胶 DNA 纯 化 试 剂 Kit 聚 丙 烯 酰 胺 实 验 原 理 表 皮 生 长 因 子 受 体 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 属 于 Ⅰ 型 受 体 酪 氨 酸 激 酶, 是 原 癌 基 因 ErbB1(HER1) 的 表 达 产 物 EGFR 广 泛 分 布 于 哺 乳 动 物 的 上 皮 细 胞 膜 上, 其 信 号 可 介 导 细 胞 的 生 长 增 殖 分 化 黏 附 移 动 等 生 命 现 象 研 究 表 明, 包 括 乳 腺 癌 胃 癌 结 肠 癌 等 多 数 肿 瘤 上 皮 可 高 表 达 EGFR, 常 与 肿 瘤 生 长 侵 袭 转 移 血 管 生 成 等 密 切 相 关, 因 此, 已 成 为 肿 瘤 治 疗 的 重 要 靶 点 在 EGFR 的 信 号 转 导 通 路 中, 比 较 经 典 的 通 路 是 有 丝 分 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 (mitogen activated protein kinase, MAPK) 途 径 :EGF EGFR Grb2 SOS Ras raf MEK MAPK, 最 后 入 细 胞 核 调 控 细 胞 周 期 相 关 基 因 的 表 达, 导 致 细 胞 异 常 增 殖 MAPK 信 号 通 路 主 要 包 括 ERK1/2 JNK p38mapk 通 常 定 位 于 细 胞 质 中, 受 激 活 后 移 行 进 入 细 胞 核, 并 产 生 相 应 的 生 理 作 用 用 表 达 人 野 生 型 ERK1/2 基 因 全 长 cdna 的 真 核 载 体 pcdna3.1 转 染 人 乳 腺 癌 细 胞 (MCF-7), 在 EGF 刺 激 下, 以 生 长 曲 线 MTT 法 检 测 ERK1/2 对 乳 腺 癌 细 胞 生 长 和 增 殖 的 影 响, 并 利 用 流 式 细 胞 仪 DNA 含 量 分 析 法 探 讨 ERK1/2 对 乳 腺 癌 细 胞 周 期 的 影 响 此 外, 采 用 Western blot 技 术 检 测 乳 腺 癌 细 胞 中 磷 酸 化 ERK1/2 蛋 白 的 活 性 以 及 对 相 应 细 胞 周 期 起 调 节 性 作 用 的 细 胞 周 期 素 ( 主 要 为 cyclind1) 和 与 细 胞 生 长 有 关 的 c-myc 基 因 的 表 达 情 况 最 后,

39 将 ERK1/2 基 因 导 入 绿 色 荧 光 蛋 白 (GFP) 载 体 转 染 MCF-7, 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察 EGF 刺 激 前 后 ERK1/2 在 细 胞 中 定 位 的 变 化 通 过 对 以 上 实 验 结 果 的 分 析, 探 讨 乳 腺 癌 细 胞 中 ERK1/2 信 号 转 导 通 路 异 常 激 活 对 乳 腺 癌 细 胞 增 殖 的 影 响 及 可 能 机 制 实 验 内 容 一 检 测 ERK1/2 对 乳 腺 癌 细 胞 生 长 的 影 响 ( 一 ) 野 生 型 ERK1/2 基 因 真 核 表 达 载 体 的 构 建 及 鉴 定 1. 组 织 细 胞 RNA 的 纯 化 (1) 废 弃 细 胞 培 养 基 质, 加 1ml Trizol 试 剂 至 培 养 瓶 中, 吸 头 冲 洗 若 干 次, 直 至 贴 附 在 瓶 壁 上 的 细 胞 脱 落, 将 细 胞 分 解 物 移 入 到 1.5mlEP 管 中, 样 本 在 室 温 下 静 置 1~5min (2) 样 品 中 加 0.2ml 氯 仿, 振 摇 15s, 然 后 室 温 静 置 2~15min (3) 离 心 15min(12000 g,2~8 ) (4) 吸 取 离 心 后 上 层 水 相 0.4~0.5ml 到 新 的 EP 管 中, 加 入 0.5ml/1mlTripure 试 剂 异 丙 醇, 上 下 颠 倒 混 匀, 室 温 放 置 5~10min (5) 离 心 10min(12000 g,2~8 ), 弃 上 清 (6) 加 入 1ml 75% 乙 醇, 振 摇 数 次 (7) 离 心 5min(7500 g,2~8 ), 弃 上 清 (8) 真 空 干 燥 ( 或 者 自 然 干 燥 ) 后, 用 DEPC 处 理 过 的 蒸 馏 水 30-40ul 溶 解 沉 淀,55~60 孵 育 10~15min (9) 测 量 OD 值 后, 样 品 放 置 -70 保 存 2. 用 M-MuLV 反 转 录 酶 (RNase H-) 进 行 第 一 链 cdna 的 合 成 (1) 在 无 菌 管 中 加 入 以 下 样 品 : 总 R N A 1 ~ 1 0 μ l ( 1 n g ~ 2 μ g ) O l i g o d T 2 3 V N 引 物 ( 5 0 μ M ) 2 μ l d N T P 混 合 物 ( 2. 5 m M ) 4 μ l 加 D E P C 水 至 1 6 μ l (2) 70 加 热 5min, 短 暂 离 心 后 放 置 于 冰 上 (3) 混 合 以 下 样 品 : 步 骤 1 的 混 合 物 16μl 1 0 R T 反 应 缓 冲 液 2 μ l R N a s e 抑 制 剂 1 μ l M - M u L V 反 转 录 酶 1 μ l 总 体 积 2 0 μ l (4) 42 温 育 1hrs (5) 95 5min 使 酶 失 活 (6) 加 RNaseH 1μl,37 作 用 20min 降 解 RNA 然 后 95 5min 使 酶 失 活 (7) 用 无 核 酸 酶 污 染 水 将 反 应 体 系 稀 释 到 50μl, 取 2~5μl 进 行 PCR 扩 增 反 应 3. PCR 反 应 扩 增 ERK1/2 基 因 片 段

40 (1) 按 下 列 组 分 配 制 PCR 反 应 液 : 10 PCR Buffer(Mg2+) dntp 混 合 物 ( 各 2.5mM) 模 板 DNA 引 物 1(20uM) 引 物 2(20uM) Taq DNA polymerase(5u/ul) ddh2o 2.5μl 4μl 1μl 0.5μl 0.5μl 0.25μl 至 25μl (2)PCR 反 应 条 件 94 5min 94 30sec 55 30sec 30 Cycles 72 1min 72 10min 4 forever (3) 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 结 果 4. 凝 胶 回 收 PCR 反 应 片 段 (1) 在 紫 外 灯 下 切 出 含 有 目 的 DNA 的 琼 脂 糖 凝 胶, 用 纸 巾 吸 尽 凝 胶 表 面 的 液 体, 此 时 应 注 意 尽 量 切 除 不 含 目 的 DNA 部 分 的 凝 胶, 尽 量 减 少 凝 胶 体 积, 提 高 DNA 回 收 率 (2) 称 量 胶 块 重 量, 计 算 胶 块 体 积 ( 按 照 1mg=1μl) (3) 向 胶 块 中 加 入 胶 块 融 化 液 DE-A Buffer,DE-A Buffer 的 加 量 如 下 表 : 凝 胶 浓 度 DE-A Buffer 使 用 量 1.0% 3 个 凝 胶 体 积 量 1.0~1.5% 4 个 凝 胶 体 积 量 1.5~2.0% 5 个 凝 胶 体 积 量 (4) 均 匀 混 合 后,75 加 热 融 化 胶 块 ( 低 熔 点 琼 脂 糖 凝 胶 于 40 加 热 ) 此 时 应 间 断 振 荡 (2-3min) 混 合, 使 胶 块 充 分 融 化 ( 约 6~8min) (5) 向 上 述 胶 块 融 化 液 中 加 入 DE-A Buffer 量 的 1/2 体 积 量 的 DE-BBuffer, 均 匀 混 合, 当 分 离 的 DNA 片 段 小 于 400bp 时, 加 入 一 个 凝 胶 体 积 的 异 丙 醇 (6) 将 试 剂 盒 中 的 Spin Column 安 置 于 Collection Tube 上 (7) 将 上 述 操 作 5 的 溶 液 转 移 至 Spin Column 中,12000g 离 心 1min, 弃 滤 液 (8) 将 500μl 的 BufferW1 加 入 Spin Column 中,12000g 离 心 30Secs, 弃 滤 液 (9) 将 700μl 的 BufferW2( 确 认 BufferW2 中 已 加 入 无 水 乙 醇 ) 加 入 Spin Column 中, 12000g 离 心 30Secs, 弃 滤 液

41 (10) 重 复 步 骤 9, 然 后 12000g 再 离 心 1min,12000g 再 离 1min (11) 将 Spin Column 安 置 于 新 的 EP 管 中, 在 Spin Column 膜 的 中 央 处 加 入 25-30μl 的 水 或 Eluent, 室 温 静 置 1min (12)12000rpm 离 心 1min 洗 脱 DNA 5. 将 ERK1/2 克 隆 到 pcdna3.1 真 核 表 达 载 体 (1) 用 限 制 性 内 切 酶 对 ERK1/2 目 的 基 因 和 载 体 分 别 进 行 双 酶 切 反 应 体 系 (20 ul 体 系 ) 目 的 基 因 ( 载 体 ) 2ul 10 Buffer 2ul 限 制 性 内 切 酶 1 1ul 37oC for 2hrs 限 制 性 内 切 酶 2 1ul ddh2o 14ul (2) 凝 胶 回 收 酶 切 产 物 (3)ERK1/2 目 的 基 因 和 载 体 的 连 接 反 应 体 系 : 2 R a p i d L i g a t i o n B u f f e r 5 μ l pcdna3.1 Vector 酶 切 纯 化 产 物 1μl E R K 1 / 2 酶 切 纯 化 产 物 X μ l T 4 D N A L i g a s e 1 μ l d d H 2 O 至 1 0 μ l 室 温 2hrs, 或 者 4oC 过 夜 6. 转 化 感 受 态 细 胞 (1) 100ul 感 受 态 细 胞 在 冰 中 融 化 (2) 分 装 2 管,50ul/ 管 (3) 加 入 连 接 产 物 5 ul (4) 冰 中 放 置 30min (5) 42 放 置 45~60sec (6) 冰 中 放 置 2~3min (7) 加 入 37 预 温 好 的 SOC 培 养 基,250μl/ 管 (8) 37 振 荡 培 养 1hrs (9) 涂 平 板,100μl/ 管 37 温 箱 培 养 12~16hrs 7. 提 取 质 粒 并 进 行 酶 切 鉴 定 (1) 挑 取 含 有 目 的 DNA 重 组 体 的 单 个 菌 落 接 种 在 3ml LB 液 体 培 养 基 中,37,225rpm 培 养 12~16hrs (2) 提 取 质 粒

42 ⑴ 离 心 菌 液 12000rpm,1min 废 弃 上 清 ⑵ 加 入 100ul SolutionⅠ, 使 菌 片 重 悬, 务 必 使 片 状 物 不 可 见 ⑶ 加 入 200ul SolutionⅡ, 上 下 颠 倒 EP 管 4~6 次, 操 作 时 间 要 少 于 5min ⑷ 加 入 150ul SolutionⅢ, 上 下 颠 倒 EP 管 4~6 次, 可 见 絮 状 沉 淀 ⑸ 离 心 13000rpm,10min ⑹ 离 心 后 的 上 清 液 移 入 Prep Spin Column ⑺13000rpm 离 心 30~60Secs, 弃 滤 液 ⑻ 加 入 0.5ml Buffer PB,13000rpm 离 心 30~60Secs, 弃 滤 液 ⑼ 加 入 0.75ml Buffer PE,13000rpm 离 心 30~60Secs, 弃 滤 液 ⑽13000 rpm 再 离 心 1min, 弃 滤 液 ⑾ 将 Prep Spin Column 加 到 新 的 1.5ml EP 管 上 ⑿ 加 50ul Buffer EB 至 滤 膜 中 央, 室 温 静 置 1min,13000rpm 离 心 1min 即 获 得 所 需 质 粒 (3) 酶 切 鉴 定 反 应 体 系 (20ul 体 系 ): 提 取 的 质 粒 2ul 10 Buffer 2ul 限 制 性 内 切 酶 1 1ul 37oC for 2hrs 限 制 性 内 切 酶 2 1ul ddh2o 14ul (4) 电 泳 : 观 察 酶 切 结 果 ( 二 ) pcdna3.1 -ERK1/2 质 粒 转 染 MCF-7 细 胞 1. 在 转 染 实 验 前 天 接 种 细 胞, 各 种 细 胞 的 平 板 密 度 依 据 各 种 细 胞 的 生 长 率 和 细 胞 形 状 而 定 进 行 转 染 当 天 细 胞 应 达 到 60%-80% 覆 盖 一 般 要 求,6 孔 培 养 皿 (35mm), 每 孔 1-2ml 培 养 基 细 胞 依 据 不 同 大 小 培 养 板 调 整 每 平 方 厘 米 的 细 胞 数 2. 转 染 当 天, 加 入 脂 质 体 / DNA 混 合 物 之 前 的 短 时 间 内, 更 换 1ml 无 血 清 无 抗 生 素 的 DMEM 培 养 液 培 养 2-24h 3. 混 合 A 溶 液 于 一 个 1.5ml 离 心 管 中 : 质 粒 DNA(1-2ug) 溶 于 100ul 无 血 清 培 养 基, 轻 轻 混 匀 5. 混 合 B 溶 液 于 另 一 个 1.5ml 离 心 管 中 : 脂 质 体 试 剂 溶 于 100ul 无 血 清 培 养 基 中, 混 匀, 室 温 孵 育 5min 当 A 溶 液 孵 育 5min 后, 混 合 溶 液 A 和 B, 轻 柔 混 合 ( 不 要 振 荡 ), 室 温 孵 育 20min, 以 便 脂 质 体 /DNA 混 合 物 形 成 6. 加 800ul 无 血 清 培 养 基, 混 匀 后, 逐 滴 加 入 细 胞 表 面,37,5%CO2 培 养 箱 内 培 养 3hr 7. 3h 后, 用 新 鲜 2-3ml 含 血 清 培 基 更 换 含 有 转 染 复 合 物 的 不 完 全 培 养 基, 继 续 培 养 h

43 以 空 白 对 照 和 转 染 空 pcdna3.1 质 粒 作 为 阴 性 对 照 ( 三 ) 细 胞 生 长 曲 线 在 24 孔 板 中 每 孔 加 入 个 细 胞, 每 隔 24 h 消 化 并 用 台 盼 蓝 染 色 计 数 3 孔 内 活 细 胞 数, 连 续 7 d, 绘 制 细 胞 生 长 曲 线 ( 四 )MTT 法 检 测 细 胞 生 长 情 况 在 96 孔 板 中 每 孔 加 入 个 细 胞, 第 3 天 加 入 浓 度 为 5 g L - 1 的 MTT 液 20μl,37 作 用 4 h, 弃 MTT 液, 每 孔 加 入 盐 酸 异 丙 醇 200μl, 然 后 用 酶 标 仪 测 定 OD 值 ( 五 ) 流 式 细 胞 术 检 测 细 胞 周 期 1. 胰 酶 收 集 个 细 胞 2. 用 预 冷 的 磷 酸 缓 冲 盐 溶 液 洗 1-2 次 % 预 冷 的 乙 醇 固 定 40min 4. 用 预 冷 的 磷 酸 缓 冲 盐 溶 液 洗 1 次 5. 加 1 ml PI 染 液 闭 光 染 色 30 min, 细 网 过 滤, 于 流 式 细 胞 仪 上 进 行 检 测, 根 据 测 定 的 结 果 分 析, 哪 类 细 胞 周 期 素 在 此 过 程 中 可 能 参 与 了 细 胞 周 期 调 控 二 检 测 乳 腺 癌 细 胞 中 ERK1/2 激 酶 活 性 以 及 细 胞 周 期 素 ( 推 测 主 要 为 cyclind1) 与 c-myc 基 因 的 表 达 情 况 ( 一 )EGF 刺 激 因 子 刺 激 MCF-7 细 胞 并 收 集 蛋 白 1. 将 细 胞 种 植 于 直 径 为 60 mm 的 培 养 皿 中 2. 待 细 胞 约 90% 长 满 时, 静 息 24 h, 用 10 ng/ml EGF 作 用 细 胞 5 min, 未 加 EGF 的 细 胞 作 为 空 白 对 照 3. 预 冷 磷 酸 盐 缓 冲 液 冲 洗 3 遍 4. 加 入 裂 解 液 收 集 裂 解 的 细 胞, 涡 旋 2 次 5. 置 于 冰 盒 中 静 止 15 min, 离 心 后 将 上 清 移 至 新 EP 管 中 ( 二 )ERK1/2 激 酶 活 性 分 析 1. 取 各 组 蛋 白 提 取 液 20μl, 含 蛋 白 总 量 约 100μg 2. 加 5 μg p - ERK1/2 抗 体, 4 沉 淀 4 h ; 3. 加 30 μl Protein A -sepharose 混 悬 液 沉 淀 抗 原 抗 体 复 合 物 1 h 4. 免 疫 沉 淀 缓 冲 液 漂 洗 Protein A -sepharose 抗 原 抗 体 复 合 物 3 次 后, 再 悬 浮 于 激 酶 缓 冲 液 ( 含 25 mmol/l Tris-HCl ph 7.4,10 mmol/l MgCl2,1 mmol/l DTT, 40 mmol/l ATP, Bq [γ-32p]atp,2 mmol/l 蛋 白 激 酶 抑 制 剂 和 0.5 mmol/l EGTA) 5. 再 与 25 mmol/l 髓 鞘 碱 性 蛋 白 (myelin basic protein,mbp) 25 反 应 10 min 6. 加 入 Laemmli 缓 冲 液 (0.002% 溴 酚 蓝,pH 7.0 的 10 mmol/l 磷 酸 盐 缓 冲 液,10% 甘 油,0.4% SDS, 1% 2- 巯 基 乙 醇 ) 终 止 反 应 7. 样 本 煮 沸 5 min, 取 上 清 液 电 泳 后, 放 射 自 显 影 观 察 ERK1/2 激 酶 活 性 ( 三 )western 印 迹 检 测 EGF 刺 激 前 后 细 胞 周 期 素 cyclind1 与 c-myc 基 因 的 表 达 情 况 1. 结 合 流 式 细 胞 术 的 结 果, 取 各 组 蛋 白 提 取 液 20μl 行 SDS-PAGE 电 泳 (1) 配 制 并 灌 注 分 离 胶, 配 方 见 下 表 1 (2) 分 离 胶 凝 固 后 灌 注 浓 缩 胶, 配 方 见 下 表 2

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