目录 u 基本概念 u 杂交瘤技术的诞生及发展 u 杂交瘤技术的原理 u 杂交瘤技术的基本程序 u 单克隆抗体的生产

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1 动物检疫检验技术 专业教学资源库 单克隆抗体技术

2 目录 u 基本概念 u 杂交瘤技术的诞生及发展 u 杂交瘤技术的原理 u 杂交瘤技术的基本程序 u 单克隆抗体的生产

3 一 基本概念 多克隆抗体 (polyclonal antibody) 简称多抗, 是针对多个不同抗原决定簇的抗体的混合物 本页图片源自百度搜索

4 单克隆抗体 (monoclonal antibody) 简称单抗, 是由一个 B 细胞克隆针对单一抗原决定簇产生 的抗体 本页图片源自百度搜索

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6 杂交瘤细胞系 (the hybridoma cell line) 既能像骨髓瘤细胞一样在体外培养中无限制增殖, 又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体, 通过克隆化得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系, 即杂交瘤细胞系 本页图片源自百度搜索

7 二 杂交瘤技术的诞生及发展 u 杂交瘤技术的诞生 1975 年 8 月 7 日,Koher 和 Mistein 在英国 自然 杂志上发表了题为 分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续性培养 的著名论文, 通过骨髓瘤细胞与免疫绵羊红细胞的小鼠脾细胞融合, 最终获得了很多能分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系 u 发展融合剂 : 聚乙二醇 (PEG) 建立的骨髓瘤细胞系 :SP2/0-Ag14,X63-G8653,NSO/1 等, 后来又建立了大鼠 人和鸡等的骨髓瘤细胞系

8 三 杂交瘤技术的原理 选择性培养基 HAT 本页图片源自百度搜索

9 融合后形成的细胞种类 细胞种类 选择性培养基 HGPRT 细胞生长状态 脾细胞 + 骨髓瘤细胞 + 长期生长 脾细胞 + 脾细胞 + 短期生长 HAT 骨髓瘤细胞 + 骨髓瘤细胞 - 不能生长 脾细胞 + 短期生长 骨髓瘤细胞 - 不能生长

10 SP2/0 细胞是缺陷性细胞, 无 HGRPT 细胞中核苷酸主要合成途径 细胞中核苷酸补救合成途径 氨基碟呤 (A) 次黄嘌呤 (H) HAT 胸腺嘧啶核苷 (T) HGRPT 核苷酸 DNA

11 四 杂交瘤技术的基本程序 用品超净工作台 CO2 培养箱 超低温冰箱 倒置显微镜 电子天平 液氮罐 离心机 纯水仪 水浴锅 融合管 细胞培养板 吸管 注射器 微量移液器 200 目筛网 解剖器械 平皿 酶标仪 加样器 细胞计数板等 步骤动物免疫 细胞融合 杂交瘤细胞的筛选与检测 杂交瘤细胞的克隆化 细胞的冻存 单抗的鉴定等

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13 1. 动物免疫 抗原制备 ---- 纯度 量 动物免疫 免疫动物 ----Balb/c 小鼠 LOU/C 大鼠 免疫程序的确定 免疫途径 ---- 皮下 肌肉 静脉 腹腔注射 本页图片源自百度搜索

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15 2. 细胞融合 骨髓瘤细胞 小鼠脾细胞 饲养细胞 融合前, 骨髓瘤细胞应处于对数生长期, 复苏后的细胞至少要 2 周时间才适合融合 加强免疫后的 第三天应杀鼠 取脾做细胞融合 选用腹腔渗出细胞, 其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞

16 1 骨髓瘤细胞悬液的制备 a. 将骨髓瘤细胞扩大培养, 一般按照一块 96 孔板需要 2-3 瓶 100mL 细胞培养瓶培养的细胞进行准备 b. 融合时, 将细胞从瓶壁吹下, 收集于 50mL 融合管内 c.1000r/min 离心 5-10min, 弃去上清 d. 加入 30mL 不完全培养基同法离心洗涤一次, 然后将细胞悬于 10mL 不完全培养基中混匀 e. 细胞计数

17 本页图片源自百度搜索 4 个大方格细胞总数 105 4

18 2 脾淋巴细胞的准备 a. 处死免疫过的 Balb/c 鼠, 分离血清 ( 摘眼球采血 ) b. 小鼠放于 75% 酒精中浸泡消毒, 取出固定于板上, 在无菌条件下取脾 c. 洗涤脾脏 d. 制备脾细胞悬液 e. 过滤, 收获脾细胞 1000r/min 离心 5-10min, 弃去上清 f. 将脾细胞重新悬于 10mL 不完全培养基中, 细胞计数

19 3 饲养细胞的制备 a. 拉颈处死小鼠, 浸泡消毒 b. 超净台中, 在小鼠腹部剪开一小口, 剥开皮肤, 露出腹膜 c. 用注射器取 10mL 不完全培养基注射至腹腔, 用手指轻揉 1min 回抽腹腔液体, 加入离心管 d. 离心, 弃上清 用 HAT 培养液重新悬浮 e. 细胞计数, 使每毫升含 40 万个活细胞 f.96 孔细胞板中, 每孔滴加 0.05ml, 含 2 万个细胞, 放入 CO2 培养箱培养, 可供细胞融合和亚克隆之用 如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少, 则可以在细胞换液时再加入一些

20 4 细胞融合原理小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的 B 淋巴细胞在融合因子 (PEG) 的作用下产生融合, 融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性, 又具有 B 淋巴细胞分泌特异性抗体的能力, 在 HAT 选择培养基中可以选择到杂交瘤细胞 通过在体外培养液中繁殖生长, 收集细胞上清液便可得到单克隆抗体

21 5 融合方法 a. 将 108 小鼠脾细胞与 骨髓瘤细胞 SP2/0, 混合于一支 50 毫升融合管中, 补加不完全培养基至 30mL b. 离心, 弃上清液 c. 用手指轻叩离心管底部, 使沉淀混匀,40 水浴中预热 d. 将 40 水浴中保温的 50%PEG 1mL, 用滴管缓慢滴入离心管中, 在 60 秒钟内滴完 e. 用吸管在 90 秒内加 20-30mL 预热至 37 的不完全培养基, 室温静置 10min f. 离心, 弃上清液 加 HAT 培养液吹打混匀, 补加含腹腔细胞的 HAT 培养液 g. 分装 96 孔细胞板, 每孔 mL 分装 24 孔板, 每孔 1-1.5mL, 37 5%CO2 培养箱中孵育 h.5 天后, 用 HAT 换出一半培养液,7-10 天后用 HT 培养基换出 HAT 培养基 f. 经常观察杂交瘤细胞生长情况, 待其长至孔底面积 1/10 以上时吸出上清供抗体检测

22 5 融合方法 本页图片源自百度搜索

23 3. 杂交瘤细胞的筛选 筛选方法选择的原则根据实验室的条件而定, 选择具有快速 敏感 特异性强 花费小 简便 便于一次处理大量样品的检测方法 常用的检测方法间接 ELISA 抗体捕捉 ELISA 竞争 ELISA Dot- ELISA 免疫组化染色法 间接免疫荧光法 间接血凝试验 放射免疫测定 血凝抑制试验等

24 4. 杂交瘤细胞的克隆化 克隆化的原因从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞, 可能来源于多个杂交瘤细胞, 因此他们所分泌的抗体是不同质的 为了得到完全同质的单克隆抗体, 必须对杂交瘤细胞进行克隆化 克隆化的方法有限稀释法 软琼脂法 单细胞显微操作法 单克隆细胞集团显微操作法 荧光激活细胞分类仪分离法等 比较常用的是有限稀释法和软琼脂法

25 有限稀释法 ( 亚克隆, 至少 2 次 ) 将待克隆化的杂交瘤细胞稀释成每毫升含 10 个 15 个 20 个细胞的稀释度, 然后加入 96 孔板, 每孔加 0.1mL 同时补加腹腔细胞 37 5%CO2 培养箱中孵育 7-10 天, 待出现肉眼可见的克隆即可检测抗体, 做好标记 本页图片源自百度搜索 计数 1-2/ 孔

26 5. 杂交瘤细胞的冻存与复苏 6. 单抗特性的鉴定杂交瘤细胞染色体分析 单抗免疫球蛋白类和亚类的鉴定 单抗纯度的鉴定 单抗理化性质的鉴定 单抗反应性测定等

27 五 单克隆抗体的生产 1. 单抗的大规模生产 目前大量制备单抗的方法主要有两大系统, 动物体内生产 法和体外生产法

28 动物体内生产法一般采用成年 BALB/C 小鼠, 体内注射适量降植烷或液体石蜡, 大约 7-10 天后将杂交瘤细胞注射入小鼠的腹腔, 观察小鼠腹水的产生情况 如腹部明显膨大时, 便可采集腹水 腹水离心后测定抗体效价, 分装,-70 冻存备用 本页图片源自百度搜索

29 体外生产法主要采用两种类型的杂交瘤细胞培养系统, 一是悬浮培养系统, 采用转瓶或发酵罐式的生物反应器 ; 二是细胞固定化培养系统, 包括中空纤维细胞培养系统和微囊化细胞培养系统 本页图片源自百度搜索

30 2. 单抗的纯化 单抗的纯化方法有很多, 应根据单抗的特性和实验条件选择适宜的方 法, 常采用的技术有 : 离子交换层析柱 凝胶过滤法 亲和层析等 本页图片源自百度搜索

31 3. 单抗的标记目前动物用单抗在动物疫病诊断和检疫 妊娠检测 性别鉴定等方面有广泛的应用, 大多以诊断试剂盒的形式提供, 其中的核心试剂为标记的单抗 常见的标记方法有 : 酶标法 荧光素标记 同位素标记 生物素标记 金标记 化学发光标记 SPA 标记 铁蛋白标记等

32 动物检疫检验技术 专业教学资源库

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