第 5 期陈冬生等. 果蝇 Hsp83 蛋白多克隆抗体的制备及鉴定 455 奠定基础材料和方法 1 材料 E.coliDH5ɑ BL21(DE3) 菌株与 pet28a 载体野生型果蝇 oregon 转基因果蝇品系 P{hsp83P hsp83 GFPHA} 均由本实验室保存 ; 果蝇 hsp8

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炭申
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1 第 25 卷第 5 期 2016 年 10 月中国组织化学与细胞化学杂志 CHINESEJOURNALOFHISTOCHEMISTRYANDCYTOCHEMISTRY Vol.25.No.5 October.2016 果蝇 Hsp83 多克隆抗体的制备及鉴定陈冬生, 王双, 王剑, 周利娟, 陶小倩, 孙福玲 ( 安徽师范大学生命科学学院, 芜湖 ) 摘要目的制备和鉴定抗 Hsp83 蛋白的多克隆抗体方法利用 PCR 技术从果蝇 cdna 中获得 hsp83 基因片段, 构建重组质粒 ; 将其转化到 BL21(DE3) 菌株中诱导蛋白表达, 利用 Ni NTA 亲和法纯化重组蛋白 ; 再将纯化的蛋白免疫 BALB/C 小鼠制备多克隆抗体 ; 利用免疫印迹法 (Westernblot) 和免疫荧光染色法检测多克隆抗体的特异性结果构建的 pet28a hsp83 质粒在大肠杆菌中成功表达了 Hsp83 融合蛋白, 蛋白纯化后作为抗原免疫小鼠, 获得了抗 Hsp83 的多克隆抗体免疫印迹法和免疫荧光染色法检测显示, 抗果蝇 Hsp83 多克隆抗体具有较高的特异性, 并能检测出内源性 Hsp83 蛋白果蝇卵巢免疫荧光染色显示,Hsp83 蛋白定位在卵巢细胞的细胞质中结论成功制备了小鼠抗 Hsp83 蛋白的特异性抗体, 此工作为深入研究 Hsp83 蛋白的功能奠定了基础关键词 Hsp83 蛋白 ; 原核表达, 多克隆抗体中图分类号 Q786 文献标识码 A DOI: /j.cnki PreparationandcharacterizationofpolyclonalantibodyagainstHsp83ofDrosophila ChenDongsheng 牞 WangShuang 牞 WangJian 牞 ZhouLijuan 牞 TaoXiaoqian 牞 SunFuling 牗 TheColegeofLifeScience 牞 AnhuiNormalUniversity 牞 Wuhu 牞 China 牘 Abstract ObjectiveToprepareandidentifythepolyclonalantibodyagainstDrosophilaHsp83protein.MethodsThefrag mentofgenehsp83wasclonedfromdrosophilacdnalibrarybypcrandtheninsertedintotheexpresionvectorpet28atoconstruct recombinantplasmids.hsp83fusionproteinwasexpresedinbl21 牗 DE3 牘牞 purifiedbyni NTAafinitychromatographyandthenused toimmunizebalb/cmice.thepolyclonalantibodyagainstdrosophilahsp83wasgainedfromthemiceserum.thespecificityofthe antibodywasanalyzedbywesternblotingandimmunofluorescentstaining.resultsthehsp83fusionproteinwassuccesfulyex presedinbl21 牗 DE3 牘 fromthepet28a hsp83plasmidsconstructed.thepurifiedfusionproteinasantigenimmunizedbalb/cmice andstimulatedthegenerationofpolyclonalantibodyagainsthsp83.theanti Hsp83antibodyshowedrelativelyhighspecificityinthe westernblotandimmunofluorescentstaining 牞 andwasabletodetectendogenousdrosophilahsp83protein.inaddition 牞 Hsp83waslo calizedinthecytoplasmofovariancelsbyimmunofluorescentstaining.conclusionthepolyclonalantibodyagainsthsp83withhigh specificitywassuccesfulyprepared 牞 andthislaysthefoundationforfurtherstudyofthefunctionsofhsp83protein. Keywords Hsp83protein 牷 prokaryoticexpresion 牷 polyclonalantibody 热休克蛋白 90(Hsp90) 是一类在进化上高度保守的原核和真核生物中普遍存在的分子伴侣蛋白, 具有 ATPase 活性, 主要参与蛋白的激活蛋白质的自稳态调节细胞周期运转的调控及多种信号传递过程 [1 3], 在致癌信号转导应激损伤等过程中也发挥重要作用 [4,5] 果蝇 Hsp83 蛋白由 hsp83 基因编码, 是哺乳动物热休克蛋白 Hsp90 的同源物果蝇 hsp83 基收稿日期修回日期基金项目国家自然科学基金面上项目 ( ); 安徽省高校自然科学基金重点项目 (KJ2015A082); 安师大研究生科研创新与实践项目 (2015cxsj172); 安徽高校科研平台创新团队项目作者简介陈冬生, 男 (1973 年 ), 汉族, 副教授通讯作者 (Towhom corespondenceshouldbeaddresed): dschgene@163.com 因定位于 3 号染色体上, 是果蝇体内唯一带有一个内含子的热休克蛋白基因 [6] 研究表明, 果蝇 Hsp83 蛋白调控众多的生物学过程, 如参与果蝇胸眼翅膀刚毛等器官的形态发生 [7 9] ; 二聚化的 Hsp83 蛋白还可促进信号转导分子在活化和非活化状态之间精确转换, 调控信号传递 [10 12] ;Hsp83 蛋白还可以与翻译抑制因子 Cup 相互作用, 调控 Osk Grk 和 Nos 蛋白质的合成, 从而调控果蝇的卵子发生 [13] 此外, 脂性食物会产生氧化应激反应, 此反应会诱导果蝇 Hsp83 蛋白高表达, 从而防止氧化性损伤 [14] 本文采用原核表达系统制备并纯化了 His Hsp83 融合蛋白, 并将蛋白免疫小鼠获得抗 Hsp83 蛋白的多克隆抗体 ; 通过免疫印迹免疫组织化学染色技术检测该抗体的特异性此工作将为更广泛深入地研究 hsp83 基因的生物学功能及其分子机制

2 第 5 期陈冬生等. 果蝇 Hsp83 蛋白多克隆抗体的制备及鉴定 455 奠定基础材料和方法 1 材料 E.coliDH5ɑ BL21(DE3) 菌株与 pet28a 载体野生型果蝇 oregon 转基因果蝇品系 P{hsp83P hsp83 GFPHA} 均由本实验室保存 ; 果蝇 hsp 突变体 (bloomington 库, 美国 );DNA 聚合酶限制性内切酶 T4DNA 连接酶 (TaKaRa 公司, 日本 );DNA 凝胶回收试剂盒和质粒 DNA 小提试剂盒购自天根生化科技有限公司 ;Ni NTA 层析试剂盒 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 和 Western blot 显影底物购自全式金生物有限公司 ;DAPI 兔 GFP 抗体 AlexaFluor 488 标记羊抗兔 IgG AlexaFluor 555 标记羊抗小鼠 IgG(ab cam 公司, 美国 );Vasa 抗体由中科院动物所陈大华老师惠赠 ; 完全弗氏佐剂不完全佐剂 (Sigma 公司, 德国 ); 实验用 BALB/C 小鼠购自扬州大学比较医学中心 ; 其他试剂为国产分析纯或分子生物学专用试剂 2 重组表达载体的构建登陆果蝇 flybase 数据库 (htp://flybase.org), 获取 hsp83 基因序列, 设计一对引物, 上游引物 (5 3 )aaaggatcctacaagggcaagcagctggtctc( 划线部分为 BamH I 酶切位点 ); 下游引物 (5 3 ) tctcgagtactccatgtgggaagcgtcc( 划线部分为 XhoI 酶切位点 ) 以野生型果蝇 cdna 为模板, 扩增 hsp83 基因 C 端序列 (582bp) PCR 产物经 BamHI 与 XhoI 双酶切琼脂糖凝胶电泳切胶纯化回收目的片段纯化后的目的片段与载体用 T4 DNA 连接酶 16 连接过夜, 连接产物转化 DH5ɑ 感受态细胞, 在含有卡那霉素的平板上挑取单克隆并扩大培养,PCR 鉴定为阳性的菌液提取质粒, 送上海生工公司测序 3 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析将构建好的重组表达质粒 pet28a hsp83 转化到大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态细胞中挑取单克隆接种于 5mL 含卡那霉素的 LB 培养液中培养过夜, 然后按 1:25 比例将过夜培养物接种于 20ml 培养液中,37 振荡培养至 OD 600 为 0.6( 约 2h) 时, 取出 5 ml 培养物作为诱导前对照, 向剩余的培养物中加入 IPTG 至终浓度为 0.1mmol/L,25 继续培养 4h, 诱导 His Hsp83 融合蛋白表达将 10ml 培养物,4000 g 室温离心 10min, 弃上清, 加 HisBindingbufer ( 含 PMSF1:100) 对细胞进行超声破碎, 离心后分别收集上清和沉淀,SDS PAGE 分析蛋白可溶性 4 重组蛋白的纯化将重组表达细菌进行大量培养诱导蛋白表达与超声破碎, 离心后上清经 0.45 孔径滤膜过滤待用取 1.0mlNi NTA 树脂用 bindingbufer 活化, 然后加入过滤后的蛋白上清, 经 washingbufer 漂洗 3 次, 用 elutionbufer 洗脱, 获得高纯度目的蛋白 5 动物免疫及多克隆抗体的制备选取 5~6 周健康 BALB/C 小鼠 ( 体重约 20~ 25g), 采用断尾法取血约 200μl, 用于制备免疫前的正常血清将纯化后的 6 His Hsp83 融合蛋白溶于 ph7.4 的磷酸盐缓冲液中 ( 浓度约 0.2mg/ml), 与等体积弗氏完全佐剂采用双推法充分混匀 ( 浓度约 0 1mg/ml) 经腹腔注射 BALB/C 小鼠, 每只小鼠注射 1ml( 约 100μg) 其后每 2~3 周免疫一次, 抗原与等量不完全弗氏佐剂同上法混匀后免疫 ( 抗原用量减半 ), 一共免疫 4 次, 最后心脏取血制备抗血清 [15] 6 多克隆抗体的 Westernblot 分析分别提取野生型果蝇 oregon 转基因果蝇 P {hsp83p hsp83 GFPHA} 卵巢总蛋白及纯化后蛋白, SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 转移至硝酸纤维素 (NC) 膜上, 经 50g/L 脱脂牛奶封闭后, 用小鼠 Hsp83 多克隆抗体 (1:5000) 孵育过夜,HRP 标记羊抗鼠单克隆抗体 (1:5000) 孵育 3h, 暗室曝光显色 7 多克隆抗体的免疫荧光染色检测分别解剖野生型果蝇 oregon 转基因果蝇 P {hsp83p hsp83 GFPHA} 及 hsp 突变体果蝇的卵巢,40g/L 甲醛固定 30min,2ml/LTriton X100 透化处理 1.5h,15g/LBSA 封闭 1h, 分别加入免疫前血清 (1:500) 小鼠 Hsp83 多克隆抗体 (1:500) 兔 Vasa 抗体 (1:4000) 及 GFP 抗体 (1:500) 置于 4 孵育过夜 ; AlexaFluor 488 标记的山羊抗兔 IgG(1:1000) Alexa Fluor 555 标记的山羊抗小鼠 IgG(1:1000) 室温孵育 3h,DAPI 染色 30min; 进行压片观察 [16] 结果 1 pet28a hsp83 表达载体按照图 1A 所示的目标重组质粒的设计要求, 将 hsp83 开放阅读框序列置于 6 His 标签的下游, 选取 BamHI XhoI 作为插入位点以野生型果蝇卵巢 cdna 为模板扩增 hsp83 编码区 C 端片段, 长度为 582bp, 符合理论值 ( 图 1B) 将目的片段与 pet28a 载体分别用 BamHI XhoI 双酶切后 16 连接 12h, 转化 E.coliDH5ɑ 菌株, 菌落 PCR 选出阳性克隆

456 中国组织化学与细胞化学杂志第 25 卷然后对阳性克隆进行 LB 液体培养提取质粒 BamH I 与 XhoI 双酶切, 琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物结果如图 1C 所示, 重组质粒切出两条带, 一条是 582 bp 目的条带, 另一条是约 5300bp 线性化的 pet28a 载体此结果表明, 目的条带已正确插入到 pet28a 原核表达载体上图 1 pet28a hsp83

a,mapoftherecombinantplasmid.b,amplificationofthehsp83genebypcr:m,dnamarker; 1,PCRproductsofhsp83geneamplification.

3 456 中国组织化学与细胞化学杂志第 25 卷然后对阳性克隆进行 LB 液体培养提取质粒 BamH I 与 XhoI 双酶切, 琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物结果如图 1C 所示, 重组质粒切出两条带, 一条是 582 bp 目的条带, 另一条是约 5300bp 线性化的 pet28a 载体此结果表明, 目的条带已正确插入到 pet28a 原核表达载体上图 1 pet28a hsp83 重组质粒 A,pET28a hsp83 重组质粒图谱 B,PCR 扩增 hsp83 基因 :M,DNAmarker;1,hsp83 基因 PCR 扩增产物 C, pet28a hsp83 质粒双酶切鉴定 (BamHI 和 XhoI):M,DNAMarker;1, 阳性克隆双酶切结果 Fig.1 TherecombinantplasmidofpET28a hsp83.a,mapoftherecombinantplasmid.b,amplificationofthehsp83genebypcr:m,dnamarker; 1,PCRproductsofhsp83geneamplification.C,identificationofpET28a hsp83bydoubleenzymedigestion(bamhiandxhoi):m,dnamarker;1 resultofdoubleenzymedigestionofpositiveclones 2 原核表达与纯化的 Hsp83 蛋白上清与沉淀分别用 SDS PAGE 电泳分析如图 2A 用 IPTG 诱导表达目的蛋白, 从 IPTG 浓度及培所示, 上清中有大量的 Hsp83 蛋白表达, 沉淀中表达养温度两个方面对蛋白表达条件进行优化最终选较低用 Ni NTA 树脂亲和纯化的方法, 纯化上清液用 0.1mmol/LIPTG 及 25 室温进行诱导培养,4h 中的目标蛋白, 纯化效果良好 ( 图 2B) 后, 收集细菌, 用细胞超声粉碎仪裂解,4 离心后, 图 2 表达与纯化的 Hsp83 融合蛋白 A, 融合蛋白的 SDS PAGE 分析 :M, 蛋白质 marker;1, 未诱导菌体总蛋白 ;2 和 3,IPTG 诱导菌体总蛋白 ;4, 诱导后沉淀 ;5, 诱导后上清 B, 融合蛋白的纯化分析 :M, 蛋白质 marker;1, 未纯化上清 ;2, 过 Ni NTA 树脂流下的上清 ( 未结合的非目标蛋白 );3, 洗脱液 Fig.2 TheexpresionandpurificationofHsp83fusionprotein.A.SDS PAGEanalysisofHsp83fusionprotein:M,proteinmarker;1,totalbacteria proteinwithoutiptginduction;2and3,totalbacteriaproteinafteriptginduction;4,theprecipitationafterinduction;5,thesupernatantafterinduc tion.b,purificationofhsp83fusionprotein:m,proteinmarker;1,thesupernatantbeforepurification;2,thesupermatantflowingthroughtheni NTA resin(unboundnon targetproteins);3,theeluent

4 第 5 期陈冬生等. 果蝇 Hsp83 蛋白多克隆抗体的制备及鉴定 Hsp83 抗体的特异性将纯化后的 6 His Hsp83 融合蛋白 ( 抗原蛋白 ) 野生型果蝇 oregon 及转基因果蝇品系 P {hsp83p hsp83 GFPHA} 的卵巢总蛋白电泳转膜, 用制备的抗 Hsp83 血清进行 Westernblot 分析结果如图 3 所示, 第 1 2 泳道都有一条明显的特异性主带, 其大小为 25kDa, 恰好等于 6 His 标签与 Hsp83 蛋白 C 端片段长度的总和, 与预期相符第 3 泳道为野生型果蝇卵巢的总蛋白, 出现了唯一条带, 大小约为 81kDa, 与全长 Hsp83 大小一致, 表明该多抗能很好地识别内源性 Hsp83 蛋白, 且具有很高的特异性第 4~6 泳道为转基因果蝇卵巢总蛋白 ( 上样量不同 ), 都出现了两条带, 其分子量为 81kDa 和 108 kda, 较小的为内源性表达蛋白, 与野生型大小相同 ; 较大的为转基因 Hsp83 GFPHA 融合蛋白, 与预期符合 Western blot 结果从体外水平充分表明制备的多克隆抗体显示了很高的特异性图 3 抗体特异性的 Westernblot 分析 1 和 2,90ng 和 180ng 体外原核表达的纯化后融合蛋白 ;3,50ng 野生型果蝇 oregon 卵巢总蛋白 ;4~6,50ng 100ng 和 200ng 转基因果蝇 P{hsp83P hsp83 GFPHA} 卵巢总蛋白 Fig.3 Westernblotanalysisofantibodyspecificity.1and2,90ngand180ngpurifiedHsp83fusionprotein;3,50ngtotalovarianpro teinfromwild typeoregon;4to6,50ng,100ngand200ngtotalovarianproteinfromtransgenicdrosophilap{hsp83p hsp83 GFPHA} 为进一步验证制备的多克隆抗体的特异性, 我们用抗 Hsp83 血清对果蝇卵巢进行免疫荧光染色分析, 共设计了 3 组实验第 1 组以野生型 oregon 卵巢为材料, 用小鼠免疫前血清为阴性对照结果如图 4A 所示, 野生型卵巢中 Hsp83 蛋白可被 Hsp83 多克隆抗体结合染色, 并定位在果蝇卵巢细胞核 (DA PI 染色 ) 周围的胞质中, 而免疫前血清染色检测不到荧光信号第 2 组以野生型 oregon 与 hsp83 基因突变体 ( 弱突变体 ) 果蝇为材料, 用抗 Hsp83 血清进行免疫染色, 结果显示, 野生型卵巢细胞被强烈着色, hsp 为弱突变体, 卵巢细胞中呈现为相对较弱的荧光染色效果, 符合预期结果 ( 图 4B) 第 3 组以野生型 oregon 和转基因果蝇 P{hsp83P hsp83 GF PHA} 卵巢为实验材料, 转基因品系表达 Hsp83 与 GFPHA 标签的融合蛋白, 用两种抗体 (Hsp83 抗体与 GFP 抗体 ) 进行红绿双重染色如图 4C 所示, 转基因果蝇卵巢中两种抗体的染色模式完全一致, 叠加后为明显的黄色, 符合 Hsp83 GFPHA 融合蛋白染色的预期目标, 而在野生型果蝇 oregon 卵巢中检测不到 GFP 信号, 也符合预期结果免疫荧光染色的结果从体内水平显示了 Hsp83 多克隆抗体的有效性与特异性

458 中国组织化学与细胞化学杂志第 25 卷图 4 抗体特异性的免疫荧光染色分析 A, 内源性 Hsp83 在野生型果蝇 oregon 卵巢中的定位 ;B, 内源性 Hsp83 在野生型果蝇 oregon 和 hsp83 08445 突变体卵巢中的定位 ;C, 转基因果蝇 P{hsp83P hsp83 GFPHA} 卵巢中 Hsp83 与 GFP 蛋白的共定位 ;IgG B, 免疫前血清 ;

5 458 中国组织化学与细胞化学杂志第 25 卷图 4 抗体特异性的免疫荧光染色分析 A, 内源性 Hsp83 在野生型果蝇 oregon 卵巢中的定位 ;B, 内源性 Hsp83 在野生型果蝇 oregon 和 hsp 突变体卵巢中的定位 ;C, 转基因果蝇 P{hsp83P hsp83 GFPHA} 卵巢中 Hsp83 与 GFP 蛋白的共定位 ;IgG B, 免疫前血清 ; 比例尺,10μm Fig.4 Analysisofantibodyspecificitybyimmunofluorescentstaining.A,localizationofendogenousHsp83proteinintheovaryofthewild type(ore gon);b,localizationofendogenoushsp83proteinintheovariesofthewild typeandhsp mutantflies;c,colocalizationofhsp83andgfppro teinintheovariesoftransgenicflyp{hsp83p hsp83 GFPHA});IgG B,serumIgGbeforeimmunization;scalebar,10μm

6 第 5 期陈冬生等. 果蝇 Hsp83 蛋白多克隆抗体的制备及鉴定 459 讨论参考文献 Hsp83 蛋白包含两个功能区域, 一个是 ATPase 结构域, 另一个是 HSP90 结构域利用 DNAStar 软件分析 Hsp83 蛋白质的氨基酸序列, 选择 C 端富含亲水性氨基酸的一段区域, 对其相应的基因编码序列进行 PCR 扩增然后, 将该片段插入到 pet28a 原核表达载体 6 His 标签下游, 得到 N 端标签的融合蛋白, 利用 IPTG 诱导蛋白表达, 发现该蛋白主要存在上清中在用 IPTG 诱导蛋白表达时, 为了提高蛋白的表达量, 我们对表达条件进行了优化,IPTG 浓度设置了 5 个梯度 :0.01mmol/L 0.03mmol/L 0.1mmol/L 0.3mmol/L 1mmol/L, 结果发现 IPTG 浓度在 0.1mmol/L 时, 蛋白表达量相对最高在用 Western blot 检测时, 我们先用原核表达纯化的融合蛋白来检测 Hsp83 抗体的最佳使用浓度, 共设置了 3 个浓度梯度 (1:1000 1:5000 和 1: 10000), 结果发现当 Hsp83 抗体稀释 5000 倍时使用效果最佳虽然直接用纯化的蛋白抗原进行检测, 具有很高的特异性, 但不能排除 6 His 标签短肽的影响所以我们使用了野生型果蝇 oregon 卵巢总蛋白进行 Westernblot 检测, 结果检测出唯一条带, 且大小正确, 从而证明了该抗体的特异性同时, 我们还使用了转基因果蝇品系 P{hsp83P hsp83 GFPHA} 的卵巢总蛋白进行 Westernblot 检测, 结果, 出现了两条带, 一条是内源性目标蛋白, 一条是比内源蛋白大的 Hsp83 GFPHA 转基因融合蛋白, 进一步显示了抗体的高效性与特异性在用免疫荧光染色检测时, 我们首先用野生型 oregon 卵巢为实验材料, 设置了一系列浓度梯度 (1: 100 1:500 和 1:1000) 来优化抗体的使用浓度, 发现抗体浓度在 1:500 时染色效果最好接着我们设置了 3 组实验检测抗体的特异性第 1 组用小鼠免疫前血清作为阴性对照, 以排除血清的种源性导致的假阳性 ; 第 2 组用 hsp83 基因的突变体作为阴性对照, 以排除细胞内非 Hsp83 蛋白可能导致的假阳性 ; 第 3 组选用野生型果蝇作为 GFP 染色的阴性对照, 通过融合蛋白 Hsp83 GFPHA 的双染重叠的有无来检测抗体的特异性, 进行进一步的确证总之, 本研究中制备的小鼠 Hsp83 抗体, 在免疫印迹和免疫组织化学染色两个方面都显示出高效价高特异性的优点, 为未来开展更多的体外 ( 如免疫共沉淀等 ) 及体内 ( 免疫电镜等 ) 研究提供了可能, 也为进一步研究 Hsp83 的功能及作用机制提供便利犤 1 犦 PearlLH.TheHSP90molecularchaperone anenigmatic ATPase.Biopolymers 牞 2016 牞 105 牗 8 牘牶犤 2 犦 ZhangXY 牞 ZhangMZ 牞 ZhengCJ 牞 etal.identificationof twohsp90genesfromthemarinecrab 牞 portunustritubercu latus 牞 andtheirspecificexpresionprofilesunderdiferent environmentalconditions.compbiochem PhysC 牞 2009 牞 150 牗 4 牘牶犤 3 犦 ZouBB 牞 ShiQZ 牞 HematologyDO.AdvancesofHSP90in hibitorstreatingacutemyelogenousleukemia.basicclin Med 牞 2014 牞 34 牗 2 牘牶犤 4 犦 SanchezER.Chaperoningsteroidalphysiology 牶 Lesons frommousegeneticmodelsofhsp90anditsco chaperones. BBA MolCelRes 牞 2012 牞 1823 牗 3 牘牶犤 5 犦 ManchadoM 牞 Salas LeitonE 牞 InfanteC 牞 etal.molecular characterization 牞 geneexpresionandtranscriptionalregulation ofcytosolichsp90 牞 genesintheflatfishsenegalesesole 牗 Soleasenegalensis 牞 Kaup 牘.Gene 牞 2008 牞 416 牗 1 2 牘牶犤 6 犦 KonstantopoulouI 牞 ScourasZG.Theheat shockgenehsp83 ofdrosophilaauraria 牶 genomicorganization 牞 nucleotidese quence 牞 andlongantiparalelcoupledorfs 牗 LACORFs 牘. JMolEvol 牞 1998 牞 46 牗 3 牘牶犤 7 犦 RutherfordSL 牞 LindquistS.Hsp90asacapacitorformor phologicalevolution.nature 牞 1998 牞 396 牗 6709 牘牶犤 8 犦 MiltonCC 牞 BaterhamP 牞 McKenzieJA 牞 etal.efectofe 牗 sev 牘 andsu 牗 Raf 牘 Hsp83mutantsandtrans heterozygotes onbristletraitmeansandvariationindrosophilamelano gaster.genetics 牞 2005 牞 171 牗 1 牘牶犤 9 犦 BanduraJL 牞 JiangH 牞 NickersonDW 牞 etal.themolecular chaperonehsp90isrequiredforcelcycleexitindrosophi lamelanogaster.plosgenet 牞 2013 牞 9 牗 9 牘牶犤 10 犦 PearlLH 牞 ProdromouC.Structureandmechanism ofthe Hsp90molecularchaperonemachinery.Annu RevBio chem 牞 2006 牞 75 牶犤 11 犦 TrepelJ 牞 MolapourM 牞 GiacconeG 牞 etal.targetingthe dynamichsp90 complex in cancer. NatRev Cancer 牞 2010 牞 10 牗 8 牘牶犤 12 犦 HeinrichsenET 牞 ZhangH 牞 RobinsonJE 牞 etal.metabolic andtranscriptionalresponsetoahigh fatdietindrosophila melanogaster.molmetab 牞 2013 牞 3 牗 1 牘牶犤 13 犦 PisaV 牞 CozolinoM 牞 GargiuloS 牞 etal.themolecular chaperonehsp90isacomponentofthecap bindingcom plexandinteractswiththetranslationalrepresorcupdur ingdrosophilaoogenesis.gene 牞 2009 牞 432 牗 1 牘牶犤 14 犦 PaulaMTD 牞 SilvaMRP 牞 AraujoSM 牞 etal.high Fatdiet inducesoxidativestresandmpk2andhsp83geneexpres sionindrosophilamelanogaster.oxidmedcellongev 牞 2016 牞 2016 牗 6 牘牶 [15] 李哲, 柳宗琳, 金丽华. 果蝇再生蛋白 (rgn) 多克隆抗体的制备及鉴定. 细胞与分子免疫学杂志,2015,31 (10): [16] 朱翔翔, 王双, 王剑, 等. 三种果蝇精巢生殖干细胞半衰期的研究. 激光生物学报,2016,25(2):41 45.

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

第 5 期陈冬生等. 果蝇 Hsp83 蛋白多克隆抗体的制备及鉴定 455 奠定基础 材料和方法 1 材料 E.coliDH5ɑ BL21(DE3) 菌株与 pet28a 载体 野生型果蝇 oregon 转基因果蝇品系 P{hsp83P hsp83 GFPHA} 均由本实验室保存 ; 果蝇 hsp8

第 5 期陈冬生等. 果蝇 Hsp83 蛋白多克隆抗体的制备及鉴定 455 奠定基础材料和方法 1 材料 E.coliDH5ɑ BL21(DE3) 菌株与 pet28a 载体野生型果蝇 oregon 转基因果蝇品系 P{hsp83P hsp83 GFPHA} 均由本实验室保存 ; 果蝇 hsp8