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耘久郎
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1 第 35 卷第 3 期 2014 年 9 月 FOREIGN MEDICALSCIENCESECTION OF MEDGEOGRAPHY Vol.35No.3 Sep 基础医学含 mir-497 野生及突变结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 区报告基因载体的构建和鉴定王美晨 3 1,2 1,2 1,2 1,2, 王璇, 蓝茜, 李玥, 刘莉, 1,2 1,2 伊静, 李靖, 宋刘梅 3, 马莎蕊 3 1,2 1,2, 宁启兰, 李冬民 ( 西安交通大学医学部 :1. 遗传学与分子生物学系,2. 环境与疾病相关基因教育部重点实验室, 级临床医学七年制, 西安 ) 摘要 : 目的利用 pmirglo Dual-LuciferasemiRNA TargetExpresionVector( 简称为 pmirglo 报告基因载体 ) 构建并鉴定含 mir-497 野生及突变结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 区报告基因载体 ( pmir-insr-3 UTR 及 pmirmutant-insr-3 UTR) 方法以大鼠肝脏 cdna 为模板,PCR 获取目的片段 ( 即含 mir-497 野生及突变结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 区 ); 用 PmeI XbaI 双酶切 pmirglo 报告基因载体和含 mir-497 野生及突变结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 区, 用 T4DNA 连接酶连接纯化后的酶切产物 ; 连接产物转化 DH5α 大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆, 并通过 PCR 双酶切 DNA 测序鉴定构建的重组质粒结果 PCR 和双酶切证实 pmir-insr-3 UTR 及 pmir-mutant-insr-3 UTR 重组载体中均插入目的片段 ;DNA 测序结果进一步证实 pmir-insr-3 UTR 重组载体中成功插入了胰岛素受体 mrna3 UTR 区, pmir-mutant-insr-3 UTR 重组载体中成功插入了在 mir-497 结合位点含有 3 个突变碱基的胰岛素受体 mrna3 UTR 片段结论成功构建了含 mir-497 野生及突变结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 报告基因载体 pmir-insr-3 UTR 及 pmir-mutant-insr-3 UTR 关键词 : 胰岛素受体 mrna3 UTR 区 ; pmirglo 报告基因载体 ; 目的片段 ; 重组载体中图分类号 :R331 文献标志码 :A 文章编号 : (2014) Constructionandidentificationofthereportergenevectors ofthe3 UTRregionofinsulinreceptormRNAincluding thewildormutantmir-497bindingsite WANG Mei-chen 3,WANG Xuan 1,2,LAN Xi 1,2,LIYue 1,2, LIU Lee 1,2,YIJing 1,2,LIJing 1,2,SONGLiu-mei 3,MAShaṟui 3, NING Qiḻan 1,2,LIDong-min 1,2 (1.DepartmentofGeneticsand MolecularBiology;2.KeyLaboratoryofEnvironmentand GenesRelatedDiseasesofMinistryofEducation;3.ClinicalMasterofGrade2010, HealthScienceCenter,Xi anjiaotonguniversity,xi an710061,china) ABSTRACT:Objective Toconstructandidentifythereportergenevectorsofthe3 UTRregionofinsulinreceptormRNAcontainingthewildormutantmiR-497bindingsite( pmir-insr-3 UTRandpmir-mutant-Insr-3 UTR ) usingpmirglodual-luciferase mirnatargetexpresionvector ( pmirgloreportgenevector ).Methods The targetfragments,whichwerethe3 UTRregionofratinsulinreceptormRNA,includingwildormutantmiR-497 DOI: /j.isn 收稿日期 : 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (No ); 陕西省科技计划资助项目 (No.2013K ); 国家级大学生创新训练资助项目 (No ); 西安交通大学本科生科研训练和实践创新基金资助项目 (No 及 No.2014X15003) 通信作者 : 李冬民, 医学博士, 副教授. 主要研究方向 : 非酒精性脂肪性肝病等代谢综合征的发病机制. lidongm@mail.xjtu.edu.cn 作者简介 : 王美晨 (1992-), 女 ( 汉族 ), 临床医学七年制. 主要研究方向 :microrna 与胰岛素抵抗. jeaniewang92@gmail.com

2 190 第 35 卷 bindingsite,wereobtainedbypcrusingratlivercdnaastemplate.thetargetfragmentsandpmirgloreport genevectorwerecutbypmeiand XbaIrestrictionendonucleasesandthenthepurifiedenzyme-digestedproducts wereligatedtogetherwithat4 DNAligase.Subsequently, theligationproductionswereusedtotransform DH5α competentcels,andthepositivecloneswerepickedupfromtheagaroseplatewithampicilin.finaly, therecombinantplasmidswereidentifiedthroughpcr,double-restrict-enzymedigestionofpmeiandxbaianddnasequence. Results PCRanddouble-restrict-enzymedigestionofPmeIand XbaIconfirmedthattherecombinantvectorsof pmir-insr-3 UTRandpmir-mutant-Insr-3 UTRsuccesfulyinsertedintothetargetfragmentrespectively.TheanalysisofDNAsequencefurtherconfirmedthatpmir-Insr-3 UTRsuccesfulyinsertedthe3 UTRregionofratinsulin receptormrna,andpmir-mutant-insr-3 UTRsuccesfulyinsertedthe3 UTRregionofratinsulinreceptormRNA containingthreebasemutationinmir-497bindingsite.conclusion Wesuccesfulyconstructedpmir-Insr-3 UTR andpmir-mutant-insr-3 UTR,thereportergenevectorsofthe3 UTRregionofinsulinreceptormRNAcontaining wildormutantmir-497bindingsite. KEY WORDS: insulinreceptormrna3 UTRregion ; pmirgloreportgenecarrier ; purposefragment ;reorganizationofthecarrier 胰岛素抵抗 (Insulinresistance), 是指正常数量的胰岛素不足以产生对脂肪细胞肌肉细胞和肝细胞的正常的胰岛素响应的状况, 是严重危害人来健康的 [1-2] 代谢综合征的共同病理基础尽管目前多数学者认为引起胰岛素抵抗的主要原因是超重和运动不足 [3], 但其确切发病机制尚未完全阐明 MiRNA 是一个约 22nt 的非编码 RNA, 与其靶基因 mrna3 UTR 区结合位点完全或部分互补配对结合, 通过 mrna 降解或压抑翻译过程而抑制靶基因的表达 [4-6], 在细胞增殖与分化 [7-8] 细胞凋亡与死亡 [9] 发 [10] [6,11-12] [13-14] [9,13] 育代谢免疫反应肿瘤发生等生物过程中担任了非常重要的作用近几年越来越多的证据表明 microrna(mirna) 与胰岛素抵抗的发生密切相关 [15], 如 leṯ7 [16] mir-126 [12] mir-144 [17] mir-320 [18], 通过抑制胰岛素信号转导通路上的关键信号分子包括胰岛素受体 (InsR) 和胰岛素因子受体 (IGF1R) [16], 胰岛素受体底物 1(IRS1) 和胰岛素受体底物 2(IRS2) [17] 磷脂酰肌醇 -3 激酶 (PI3K) [18] 参与了胰岛素抵抗的发生发展作为胰岛素信号途径的开关分子 - 胰岛素受体是否受 mirna 调节尚没有文献报道生物信息学预测显示大鼠 InsR 可能是 mir-497 的靶基因, 为了阐明此机制, 我们构建并鉴定了含 mir-497 野生及突变结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 区的报告基因载体 1 材料与方法 1.1 实验动物主要试剂及仪器本实验选用 4 周龄近交系雄性 E3 大鼠 2 只, 来自西安交通大学医学部遗传学与分子生物学系的 SPF 级实验动物室主要试剂有 :pmirgloduaḻluciferasemirnatarget Expression Vector( 简记为 pmirglo 载体 )(Promega),TRIzol 试剂及 Lipofactamine2000(Iṉ vitrogen), 反转录试剂盒 RevertaidTM FirstStrand cdna Synthesis 及 PmeI 和 XbaI 限制性酶切酶 (Fermentas),T4 DNA 连接酶 (TaKaRa),E.Z.N. A. FastfilterEndo-freePlasmid MiniKit(OME- GA),DNA 琼脂糖凝胶纯化试剂盒 ( 博大泰克 ) 其余试剂均按照分子克隆实验指南 ( 第三版 ) 的实验方法配制 [19] 主要仪器有水平电泳槽低温水浴槽凝胶成像系统 (SYNGENE) 及恒温培养箱 1.2 引物的设计在 GeneBank 里查找 Ratusnoṟ vegicusinsulin receptor mrna ( 序列号 :NM _ ) 利用 PrimerPremier5.0 软件设计胰岛素受体 mrna3 UTR 区全长的报告基因载体引物, 上游引物带有限制性内切酶 PmeI 酶切位点序列为 : 5 -GGGTTTAAACCAGCGCCTGCTCG-3, 下游引物带有限制性内切酶 XbaI 酶切位点序列为 :5 -TC- CTCTAGAGAGCGAGTTCTGACGTGAC-3,PCR 扩增产物长 915bp 仍利用上述软件设计含 mir- 497 突变结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 区报告基因载体的引物, 上游引物带有限制性内切酶 PmeI 的酶切位点序列为 :5 -GGGTTTAAAC- CAGCGCCTGCTCG-3, 下游引物带限制性内切酶 XbaI 酶切位点并在与 mir-497 种子序列结合的位点引入 3 个突变碱基 (C A C) 故下游引物序列为 : 5 -CCTCTAGATATGAAAGGATCGGCTATTG- GTC-3 ( 带下划线的碱基为引入的突变碱基 ) 利用基因克隆技术分别构建含 mir-497 野生结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 区报告基因载体 ( 简记为 pmiṟinsṟ3 UTR) 以及含 mir-497 突变结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 区报告基因载体 ( 简记为 :pmiṟmutanṯinsṟ3 UTR)

3 第 35 卷王美晨, 等. 含 mir-497 野生及突变结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 区报告基因载体的构建和鉴定 pmir-insr-3 UTR 及 pmir-mutant-insr-3 UTR 报告基因载体的构建首先取 E3 大鼠肝组织 50~ 60mgRIzol 试剂说明书提取肝总 RNA 并定量, RT-PCR 获取含 mir-497 野生及突变结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 的目的片段复苏并扩增 pmirglo 载体菌种, 提取质粒并定量用限制性内切酶 PmeI 和 XbaI 对目的片段 PCR 产物和 pmiṟ GLO 载体进行双酶切, 酶切产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳后, 在紫外透射下切下目的条带和 pmirglo 载体, 用 DNA 琼脂糖凝胶纯化试剂盒分别回收并定量用 T4DNA 连接酶连接双酶切纯化后的 pmiṟ GLO 载体和目的片段 ( 载体 DNA: 目的片段 DNA 摩尔数之比为 1 3), 选用 10μL 连接体系,12 连接过夜取连接产物 5μL 加入 100μLDH5α 感受态细胞, 分别设置加 PBS 的阴性对照和加 pmirglo 载体阳性对照具体操作遵照分子克隆指南 1.4 用 PCR PmeI 和 XbaI 双酶切以及 DNA 测序鉴定重组载体 pmir-insr-3 UTR 及 pmir-mutant-insr-3 用限制性内切酶 PmeI 和 XbaI 双酶切 pmiṟiṉ sṟ3 UTR 重组质粒,1% 琼脂糖凝胶电泳图上可见 2 条清晰条带, 其中 1 个位于 DNAmarker 所示的 7000bp~8000bp 之间, 另一个位于 750bp~1000 bp 之间, 这分别与 pmirglo 质粒 (7350bp) 及目的片段 (915 bp) 的大小相一致 ( 图 1-Lane3); 然而 pmirglo 质粒用限制性内切酶 PmeI 和 XbaI 双酶切后, 在 1% 琼脂糖凝胶电泳图上只有 1 个条带位于 DNAmarker 所示的 7000bp~8000bp 之间, 这只与 pmirglo 质粒 (7350 bp) 大小相一致 ( 图 1- Lane2) 这些说明 pmiṟinsṟ3 UTR 重组质粒经 PmeI 和 XbaI 双酶切后可以释放出目的片段 UTR 从 pmiṟinsṟ3 UTR 及 pmiṟmutanṯinsṟ3 UTRLB 平板上随机挑取 3~5 个阳性克隆, 加入 5 ml 含有 100μg/mL 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中, 在恒温振荡器,37 剧烈震荡培养 16h 在超净工作台内, 取 1 ml 菌液 4 保存, 用于测序剩余菌液, 按照质粒小提试剂盒提取重组质粒 pmiṟinsṟ 3 UTR 及 pmiṟmutanṯinsṟ3 UTR 以提取的 pmirglo 质粒和重组质粒 pmiṟinsṟ3 UTR 及 pmiṟmutanṯinsṟ3 UTR 为模版,PCR 扩增含 mir-497 野生及突变结合位点的胰岛素受体 mrna 3 UTR 的目的片段 ; 按照 20μL 双酶切体系, 用限制性内切酶 PmeI 和 XbaI 双酶切鉴定重组质粒 pmiṟ Insṟ3 UTR 及 pmiṟmutanṯinsṟ3 UTR 后 ;1% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 及双酶切产物并照像并将重组质粒 pmiṟinsṟ3 UTR 及 pmiṟmutanṯinsṟ 3 UTR 菌液送公司测序 2 实验结果 2.1 pmir-insr-3 UTR 重组载体的鉴定在含氨苄青霉素的 LB 平板上挑选重组质粒的阳性克隆, 液体 LB 培养基扩增后提取质粒并定量以提取的 pmiṟ Insṟ3 UTR 重组质粒分别为模板, 用构建 pmiṟinsṟ 3 UTR 载体所用引物分别进行 PCR 扩增,1% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物, 结果显示在 1000bp 和 750bp 之间 ( 图 1-Lane1) 有一条明显的条带, 它们与目的片段大小一致, 说明 pmiṟinsṟ3 UTR 重组质粒中均包含有目的片段 LaneM1 M2 分别为 1kb 和 250bp 的 DNA marḵ er,lane1 为 pmiṟinsṟ3 UTR 重组载体 PCR 产物 ; Lane2 3 分别为 pmirglo 空载体及 pmiṟinsṟ3 UTR 重组载体 PmeI 和 XbaI 双酶切产物图 1 pmir-insr-3 UTR 重组载体的鉴定对构建的 pmiṟinsṟ3 UTR 重组质粒进行测序, 并用 DNAssist2.2 软件将测序结果与从 GenBank 中拷贝的胰岛素受体 mrna3 UTR 序列进行比对, pmiṟinsṟ3 UTR 重组质粒中的插入片段与 Geṉ Bank 中胰岛素受体 mrna3 UTR 区序列完全相同 ( 图略 ) 2.2 pmir-mutant-insr-3 UTR 重组载体的鉴定在含氨苄青霉素的 LB 平板上挑选重组质粒的阳性克隆, 液体 LB 培养基扩增后提取质粒并定量以提取的 pmiṟmutanṯinsṟ3 UTR 重组质粒分别为模板, 用构建 pmiṟmutanṯinsṟ3 UTR 载体所用引物分别进行 PCR 扩增,1% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物, 结果显示在 500bp 和 750bp 之间 ( 图 2-Lane1) 有一条明显的条带, 与 642bp 目的片段的大小相一致, 说明 pmiṟmutanṯinsṟ3 UTR 重组质粒中包含有目的片段用限制性内切酶 PmeI 和 XbaI 双酶切 pmiṟ mutanṯinsṟ3 UTR 重组质粒,1% 琼脂糖凝胶电泳图上可见 2 条清晰条带, 其中 1 个位于 DNAmarker

192 第 35 卷所示的 7000bp~8000bp 之间, 另一个位于 750bp 变位点 ~1000bp 之间, 这分别与 pmirglo 质粒 (7350 bp) 及目的片段 (642 bp) 的大小相一致 ( 图 1- Lane3); 然而 pmirglo 质粒用限制性内切酶 PmeI 和 XbaI 双酶切后, 在 1% 琼脂糖凝胶电泳图上只有 1 个条带位于 DNAmarker

2 软件将测序结果与从 GenBank 中拷贝的胰岛素受体 mrna3 UTR 区序列进行比对,pmiṟmutanṯInsṟ3 UTR 重组质粒中插入片段与 GenBank 中胰岛素受体 mrna3 UTR 序列有 3 个碱基不同 ( 图 3), 这恰好是我们设计的突 LaneM1 M2 分别为 1kb 和 250bp 的 DNA marker, Lane1 为 pmiṟmutanṯinsṟ3

4 192 第 35 卷所示的 7000bp~8000bp 之间, 另一个位于 750bp 变位点 ~1000bp 之间, 这分别与 pmirglo 质粒 (7350 bp) 及目的片段 (642 bp) 的大小相一致 ( 图 1- Lane3); 然而 pmirglo 质粒用限制性内切酶 PmeI 和 XbaI 双酶切后, 在 1% 琼脂糖凝胶电泳图上只有 1 个条带位于 DNAmarker 所示的 7000bp~8000 bp 之间, 这只与 pmirglo 质粒 (7350bp) 的大小相一致 ( 图 1-Lane2) 这些说明 pmiṟmutanṯinsṟ3 UTR 重组质粒经过 PmeI 和 XbaI 双酶切后可以释放出目的片段对构建的 pmiṟmutanṯinsṟ3 UTR 重组质粒进行测序, 并用 DNAssist2.2 软件将测序结果与从 GenBank 中拷贝的胰岛素受体 mrna3 UTR 区序列进行比对,pmiṟmutanṯInsṟ3 UTR 重组质粒中插入片段与 GenBank 中胰岛素受体 mrna3 UTR 序列有 3 个碱基不同 ( 图 3), 这恰好是我们设计的突 LaneM1 M2 分别为 1kb 和 250bp 的 DNA marker, Lane1 为 pmiṟmutanṯinsṟ3 UTR 重组质粒 PCR 产物 ;Lane2 3 分别为 pmirglo 空载体及 pmiṟmutanṯ Insṟ3 UTR 重组质粒 PmeI 和 XbaI 双酶切产物图 2 pmir-mutant-insr-3 UTR 重组质粒的 PCR 及双酶切鉴定 Sequence0 为 NCBIGenbank 数据库中大鼠胰岛素受体 mrna3 UTR 区的部分 cdna 序列 ;Sequence 1 为 pmiṟmutanṯinsṟ3 UTR 重组质粒的 DNA 部分测序结果图 3 pmir-mutant-insr-3 UTR 重组载体 DNA 测序的部分比对结果 3 讨论和 750bp 之间条带与 915bp 目的片段的大小相一致, 这说明 pmiṟinsṟ3 UTR 重组质粒中插入了胰岛以提取的 pmiṟinsṟ3 UTR 重组质粒为模板, 用构建 pmiṟinsṟ3 UTR 载体所用引物进行 PCR 扩增后,1% 琼脂糖凝胶电泳检测结果显示位于 1000bp 素受体 mrna3 UTR 区 ; 该质粒用限制性内切酶 PmeI 和 XbaI 双酶切后,1% 琼脂糖凝胶电泳图上可见 2 条清晰条带, 一条与载体大小一致, 而位于 750

5 第 35 卷王美晨, 等. 含 mir-497 野生及突变结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 区报告基因载体的构建和鉴定 193 tions[j].cel,2009,136(2): [5]GuS,KayMA.HowdomiRNAsmediatetranslationalrepression[J].Silence,2010,1(1): [6]DavalosA,GoedekeL,SmibertP,etal.miR-33a/bcontribute totheregulationoffatyacid metabolismandinsulinsignaling [J].ProcNatlAcadSciUSA,2011,108(22): [7]AmbrosV.ThefunctionsofanimalmicroRNAs[J].Nature, 2004,431(7006): [8]HeJF,LuoYM,WanXH,etal.BiogenesisofMiRNA-195and itsroleinbiogenesis,thecelcycle,andapoptosis[j].jbiochem MolToxicol,2011,25(6): [9]Zhu W,ZhuD,LuS,etal.miR-497 modulatesmultidrugresistanceofhumancancercellinesbytargetingbcl2[j].med Oncol,2012,29(1): [10]Zhong N,SunJ,Min Z,etal.MicroRNA-337isasociated with chondrogenesisthrough regulating TGFBR2 expresion [J].OsteoarthritisCartilage,2012,20(6): [11]FrostRJ,OlsonEN.Controlofglucosehomeostasisandinsulin sensitivitybythelet-7familyof micrornas[j].proc Natl AcadSciUSA,2011,108(52): [12]Ryu HS,ParkSY,MaD,etal.TheinductionofmicroRNA targetingirs-1isinvolvedinthedevelopmentofinsulinresistanceunderconditionsofmitochondrialdysfunctioninhepatocytes[j].plosone,2011,6(3):e [13]DuddaJC,SalaunB,JiY,etal.MicroRNA-155IsRequired foreffectorcd8(+)tcelresponsestovirusinfectionand Cancer[J].Immunity, 2013,38(4): [14]NahidMA,YaoB,Dominguez-GutierrezPR,etal.Regulation of TLR2-mediated tolerance and cros-tolerancethrough I- RAK4 modulation by mir-132 and mir-212[j].immunol, 2013,190(3): [15]WiliamsMD,MitchelGM.MicroRNAsininsulinresistance andobesity [ J].ExpDiabetesRes,2012: [16]Zhu H,Shyh-ChangN,SegreAV,etal.TheLin28/let-7axis regulatesglucosemetabolism[j].cel,2011,147(1): [17]Karolina DS,Armugam A,TavintharanS,etal.MicroRNA 144impairsinsulinsignalingbyinhibitingtheexpresionofinsulinreceptorsubstrate1intype2diabetesmelitus[J].PLoS One,2011,6(8):e [18]LingHY,Ou HS,FengSD,etal.CHANGESIN microrna (mir) profileandeffectsofmir-320ininsulin-resistant3t3- L1adipocytes[J].ClinExpPharmacolPhysiol,2009,36(9): e [19]J. 萨姆布鲁克,D.W 拉塞尔著. 黄培堂等译. 分子克隆实验指南 ( 第三版 )[M]. 科学出版社,2002. bp 和 1000bp 之间的条带与目的片段胰岛素受体 mrna3 UTR(915bp)PCR 产物的大小完全一致, 这进一步提示构建的 pmiṟinsṟ3 UTR 重组质粒中有目的片段的插入 ;DNA 测序结果表明 pmiṟinsṟ 3 UTR 重组质粒中插入片段与 GenBank 胰岛素受体 mrna3 UTR 序列完全相同, 进一步说明我们成功构建了含 mir-497 野生结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 区报告基因载体 pmiṟinsṟ3 UTR 以提取的 pmiṟmutanṯinsṟ3 UTR 重组质粒为模板, 用构建 pmiṟmutanṯinsṟ3 UTR 载体所用引物进行 PCR 扩增后,1% 琼脂糖凝胶电泳检测结果显示位于 500bp 和 750bp 之间条带与 642bp 目的片段大小相一致, 这说明 pmiṟmutanṯinsṟ3 UTR 重组质粒中插入了目的片段该质粒 PmeI 和 XbaI 双酶切后,1% 琼脂糖凝胶电泳图上可见 2 条清晰条带, 一条与载体大小一致, 而位于 500bp 和 750bp 之间的条带与目的片段突变的胰岛素受体 mrna 3 UTR(642bp) PCR 产物的大小完全一致, 这进一步提示构建的 pmiṟinsṟ3 UTR 重组质粒中有目的片段插入 DNA 测序结果表明 pmiṟmutanṯinsṟ3 UTR 重组质粒中插入片段除了 3 个碱基不同其余均与 GenBank 胰岛素受体 mrna 3 UTR 序列相同, 这进一步说明成功构建了含 mir-497 突变结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 区报告基因载体 pmiṟmutant Insṟ3 UTR 以上实验结果表明, 我们成功构建了包含 mir- 497 野生和突变结合位点的胰岛素受体 mrna3 UTR 区报告基因载体, 这为我们今后研究 mir-497 对大鼠胰岛素受体调节的分子机制打下坚实的基础参考文献 : [1]GuinhouyaBC,SamoudaH,ZitouniD,etal.Evidenceofthe influenceofphysicalactivityonthemetabolicsyndromeand/or oninsulinresistanceinpediatricpopulations:asystematicreview[j].intjpediatrobes,2011,6(5-6): [2]ChangYH,ChangDM,LinKC,et,al.Visfatininoverweight/ obesity, type2diabetesmelitus,insulinresistance,metabolic syndromeandcardiovasculardiseases:ameta-analysisandsystemicreview[j].diabetesmetab ResRev,2011,27(6): [3]YeJ.Mechanismsofinsulinresistanceinobesity [ J].Front Med,2013,7(1): [4]BartelDP.MicroRNAs:targetrecognitionandregulatoryfunc-

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