中国生物工程杂志 < 陈浩嘉研究员惠赠 蛋白浓度检测试剂 3 *. 购自美国 "&) 公司 其他试剂均为分析纯 购自 5 / 公司 用于目的片段扩增的 *& 引物为自行设计 由上海生工生物工程有限公司合成 方 法 *& 扩增编码 *+%, 锌指结构域的 3 片段 合成一对与编码 *+%, 锌指结构域

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1 中国生物工程杂志! 研究报告 重组 蛋白锌指结构域的表达 提纯和活性分析 李 伟 上海交通大学系统生物医学研究院教育部系统生物医学重点实验室 上海 ' 摘要 *+%,-./ 0 /1.-. 是一种重要的转录抑制因子 它由位于 端的 结构域和 端的锌指结构域构成 鉴于目前对于锌指结构域的立体结构还不是十分清楚 对其进行了高效表达和提纯 为了表达 *+%, 蛋白的锌指结构域 在其编码序列的! 端加上起始密码 后插入到表达载体 *2 " 的多克隆位点 构建好的表达质粒转化到 + 32 大肠杆菌内并用 4* 诱导表达 发现重组蛋白主要以不溶性的包涵体形式在胞内表达 用含有 535 变性剂的缓冲液溶解包涵体后 采用凝胶过滤方法将重组蛋白纯化到纯度达 6 7 以上 对纯化后的蛋白质用反透析的方法进行复性 然后用 3 结合实验进行活性分析 发现复性后的蛋白质具有特异的 3 结合活性 这为进一步研究 *+%, 蛋白锌指结构域的立体结构打下了重要基础 关键词 *+%, 蛋白 锌指结构域 包涵体 凝胶迁移分析中图分类号 8# 急性早幼粒细胞白血病锌指蛋白 -./ 0 /1.-. *+%, 是一种具有特异性 3 序列结合活性的转录抑制因子 *+%, 能够通过下调细胞周期素 的表达从而抑制细胞周期的进程 *+%, 蛋白由 # 个氨基酸组成 包含 " 端的 结构域 '" 中间由二百多个氨基酸组成的中间区和 " 端 6 个 9 :. -- " 类型的锌指结构域 ''"! "' 锌指结构域与 3 序列特异性结合 结构域发挥转录抑制作用!"# *+%, 可以与多种蛋白质相互作用并产生相应的生物学作用 $" *+%, 本身是视黄酸受体. ). -. & & 转录活性的一个负调节因子 在一种罕见的急性早幼粒细胞白血病中发现 *+%, 基因可通过转座与 & & 融合 融合基因表达出的蛋白质产物对视黄酸 ; 型受体产生显性负调节作用! 迄今为止 *+%, 收稿日期 "#" 修回日期 "$" 上海市自然科学基金资助项目 %&' $ 电子信箱 ( ) ( 蛋白 结构域的晶体结构已经得到解析 但其 6 个锌指结构域的三维空间结构还未能确定 本文将 *+%, 蛋白的 6 个锌指结构域 *+%,"6% 以包涵体的形式在大肠杆菌中进行了高效表达 通过凝胶过滤色谱进行了纯化 并用体外折叠的方法获得了具有特异性序列结合活性的锌指结构域 这为进一步研究它的晶体结构打下了基础 材料与方法 材 料 菌株与载体 + 32 和 39! 菌株由本实验室保存 表达载体 *2 " 购自 ) 4 5 试剂 &44 和 ' 3 连接酶购自 2 ) * 9 ",) *& 试盒购自,1 / 3 片段回收试剂盒购自 :& 公司 5 -. ' 购自 2. 蛋白质分子量标准为 4. 的产品 *+%, 3 由美国 49

2 中国生物工程杂志 < 陈浩嘉研究员惠赠 蛋白浓度检测试剂 3 *. 购自美国 "&) 公司 其他试剂均为分析纯 购自 5 / 公司 用于目的片段扩增的 *& 引物为自行设计 由上海生工生物工程有限公司合成 方 法 *& 扩增编码 *+%, 锌指结构域的 3 片段 合成一对与编码 *+%, 锌指结构域的 3 片段! 端和 端互补的引物! 端引物 %,! " " 端引物 %,! " " 其中! 端引物中填加了起始密码子 其上游带有 ) 4 位点 端引物中带有 &4 位点 其下游带有终止密码子 引物序列中的酶切位点用大写字母表示 以 全长 3 为模版 进行 *& 扩增 *& 反应条件为 6$= / 6$=! =! # = 个循环 # = 延伸 / 重组表达质粒的构建 *& 产物和 -2 " 置 #= 水浴在 号缓冲液中进行 &4 和 ) 4 双酶切过夜后 在低熔点琼脂糖中电泳并进行 3 片段回收 回收的基因与 -2 " 线性化载体用 ' 3 连接酶连接后 转化 39! 大肠杆菌感受态细胞 用酶切和 *& 方法筛选阳性克隆 对筛选出的阳性质粒进行验证性测序 读码框和序列正确的表达质粒命名为 -2 "*+%,"61 工程菌的转化和融合蛋白的诱导表达 用 -2 "*+%,"61 转化 + 32 并涂布在含有 >/ 氨苄青霉素的平板上 #= 培养 挑取阳性克隆接入 + 液体培养基 含 >/ 氨苄青霉素 中过夜活化后 以? > 的比例接入 ++ 培养基 含 >/ 氨苄青霉素 #= 为! 左右时 加入 4* 至终浓度为 // > + 继续培养 ' 小时后离心收集细菌 菌体重悬于含 7. ;" 的 *5 里备用 取 悬浮菌液 用超声破碎仪裂解.>/ 离心 / 分别收集上清和沉淀 取! 上清与等体积 A535" * 2 上样缓冲液混合 沉淀用 A535"* 2 上样缓冲液重悬后 = 煮沸!/.>/ 离心 / 分别取上清 进行 535"* 2 电泳分析 ' 重组蛋白的纯化 在冰上超声破碎菌体 在裂解的菌液中加入 3 酶至终浓度为 / >/ 溶菌酶至终浓度为 / >/ 室温孵育 / 裂解液在 '=.>/ 离心 / 弃上清收集沉淀为包涵体 包涵 体用含 / >+ / >+ 和 / >+ 尿素的! // >+. "9 缓冲液依次洗涤.>/ 离心 / 收集沉淀 获得的沉淀用含 和!// >+3 的! // >+. "9 缓冲液于!= 水浴中溶解 /.>/ 离心 / 收集上清 室温冷却 取!/ 上清 上至用包涵体溶解缓冲液平衡好的 5 -) B " 凝胶色谱柱 /A' / 上 用 : *./ + 系统以 / >/ 的流速进行洗脱 蛋白峰用分步收集器收集 每管!/ 收集完毕后 每管取 用 535"* 2 分析目的蛋白的纯度 合并纯度在 6 7 以上的目的蛋白组分! 目的蛋白的 " 端氨基酸序列分析 将 535" * 2 分离后的目的蛋白电转移到 *<3, 膜上 经考马斯亮蓝染色!7 甲醇脱色后 送上海中科新生命生物科技有限公司进行 端氨基酸序列分析 锌指蛋白的体外复性 将凝胶过滤色谱纯化后的蛋白质装入透析袋中 置于含 7535 // >+ 3 / >+% 的! // >+. "9 缓冲液中 '= 过夜透析复性 透析液每隔 ' 更换一次 复性后的蛋白质超滤浓缩后 用含 7 甘油的透析缓冲液将浓度调整至 / >/ " = 保存 # 凝胶电泳迁移阻滞实验 为了分析复性后 *+%, 锌指结构的生物学活性 根据已知的 *+%, 特异 性 3 结合序列设计了两个彼此互补的寡核苷酸单链探针! " "! " " 通过退火使两者结合成双链探针 探针在 ' 多核苷酸激酶的催化下将 " * * 分子上的放射性磷酸基团转移到探针的! 核苷酸上 蛋白质 "3 结合反应在结合缓冲液 // >+. " 9-9 #! // >+!// >+ // >+3 中进行 为了保证结合反应的特异性 在所有反应中均加入了多聚 ) ") 不带放射性标记的探针作为放射性探针的竞争性底物 结合反应中使用 复性后的 *+%, 锌指结构域和带有 * 标记的放射性探针 剂量为 ' -/> 蛋白质和探针混合后在冰浴中保温 / 在竞争性结合实验中 蛋白质先和相当于放射性探针 倍剂量 的未标记探针在冰浴中结合 / 然后再加入放射性探针 结合反应的产物上到浓度为 7 的聚丙烯酰胺凝胶上于 '= 冷室中在! A 2'! // >+. '! // >+. ) // >+23-9$ 中进行电泳分离 最后干胶并进行放射性自显影

3 李 伟 重组 *+%, 蛋白锌指结构域的表达 提纯和活性分析 结 果 重组 锌指结构域的表达 提纯和鉴定通过对诱导后细菌可溶性蛋白组分和不溶性蛋白组分的 535"* 2 分析发现目的蛋白主要出现在不溶性组分中 以包涵体的形式存在 分子量在 03 左右 与预测分子量相符 表达的重组蛋白占细菌总蛋白的!7 左右 占不溶性蛋白组分的 7 左右 包涵体经含 7 C 7535 的缓冲液分步洗涤后 目的蛋白的纯度达 $7 左右 通过 5 -) B " 进一步提纯 洗脱峰组分中间 > 的馏分纯度达 6 7 以上 图 " 端氨基酸序列分析得到的氨基酸顺序为 :,<38 与锌指结构域 " 端序列一致 上述数据表明 *+%, 锌指结构域得到了成功表达和提纯 图 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质 + 结合的凝胶阻滞实验! ') $,$ ) ' $*! )" #, %) #" - $% $) + * *" ).,. -. *+%, 1.)/ D-. /-. '! *+%,1.)/ D-. ) /-. / 讨 论 *+%, 是一种具有重要生理功能的蛋白质 在哺乳 动物早期发育过程中发挥重要作用 "' 还参与视黄 图 重组 锌指结构域表达和提纯步骤蛋白纯度的 分析!"# #$%& '% $ # $ ( % ') $*" *. / * '*. ) -. 重组 锌指结构域的体外复性和 + 结合活性分析在利用反透析方法对 *+%, 锌指结构域进行体外 % D 掺入复性的基础上 利用已知的细胞内 *+%, 特异性 3 结合序列作探针 通过凝胶迁移阻滞的方法对重组 *+%, 锌指结构域的生物学活性进行了分析 结果表明 只有在不加入未标记竞争抑制性探针时 重组 *+%, 锌指结构域才与同位素标记的探针结合 图 泳道 C 而过量未标记竞争抑制性探针能够消除 *+%, 锌指结构域与同位素标记探针的结合 图 泳道 ' C! 说明复性的重组 *+%, 锌指结构域具有正确的生物学活性 酸诱导的粒细胞分化! *+%, 基因可通过转座与 & & 融合从而竞争性地抑制 & & 的生理作用被证明是诱发全反式维甲酸抗性急性早幼粒细胞白血病的分子成因! *+%, 在细胞内能特异性结合细胞周期素 的启动子从而抑制细胞周期素 基因的表达 进而抑制细胞周期的进行 *+%, 蛋白质有两个重要的功能结构域 位于 " 端的 6 个锌指结构与 3 序列特异性结合 位于 " 端的 结构域发挥转录抑制作用 尽管目前 结构域的晶体结构已经得到解析 但位于 " 端的 6 个锌指的晶体结构至尽尚未解析 其中一个重要原因是 难以获得足够数量的天然活性蛋白质用以进行蛋白质结晶 大肠杆菌表达系统具有操作简单 成本低 蛋白产量高等特点 因此 被作为大量生产重组蛋白质的首选方法 该系统的问题是 有些真核蛋白不能以活性形式产生需要进行复性 研究在大肠杆菌中以包涵体的形式高效表达了非活性 *+%, 锌指结构域 通过凝胶过滤层析获得了纯度在 6 7 以上的目的蛋白 利用反透析 % D 掺入原理进行了蛋白质复性 得到了具有特异性 3 结合活性的蛋白质 这项前期工作 为探索 *+%, 锌指结构域的结晶方法并进而解析其晶体结构打下了良好基础

4 ' 中国生物工程杂志 < 参考文献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

5 李 伟 重组 *+%, 蛋白锌指结构域的表达 提纯和活性分析! ) ) 4* (. / -. ) B-. ) ) ( ) 1 ). 535 ). ) ) /. 6 7 /..( -. ) -.. ). ) ). ) ).. ) (. ) ) ) 3.-. / 2 5 ) ) ( /-. ) ).... ")/.. ) 1.)/ *+%,( 1 " $ # *+%,-. %.)/4 ) 2 5 致 谢 近期为本刊审稿的专家 按姓氏笔划排列 孔德领 王佑春 王金星 王健伟 王静云 叶志强 田建卿 刘天庆 刘志敏 刘佳佳刘建国 刘维一 江 宁 许文涛 宋思扬 宋锡瑾 张兆山 张余洋 张春义 张艳丽李京华 李桂源 杜 伟 杜志强 杨汉春 陈昭烈 陈靠山 范学工 姜 韬 钞亚鹏徐香玲 钱世钧 顾 军 崔 磊 梁前进 黄国亮 蒲小平 解 军 糜 军

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