2 中国生物工程杂志 5 8 方法重组质粒的构建及蛋白的表达纯化和检测 () 基因序列来源于 81 数据库在其 8 端添加个 +, 的标签和 05 蛋白酶切位点由生工生物工程有限公司上海全基因合成总长度 0 " < 质粒为表达载体构建 0 " "+," () 表达载体. 合成不含

Size: px

Start display at page:

Download "2 中国生物工程杂志 5 8 方法重组质粒的构建及蛋白的表达纯化和检测 () 基因序列来源于 81 数据库在其 8 端添加个 +, 的标签和 05 蛋白酶切位点由生工生物工程有限公司上海全基因合成总长度 0 " < 质粒为表达载体构建 0 " "+," () 表达载体. 合成不含"

联滇车
7 years ago
Views:

1 中国生物工程杂志! 蛋白单克隆抗体的制备及其表征李孜包欣晨高向东陆小冬徐晨中国药科大学生命科学与技术学院南京北京三元基因工程有限公司北京摘要目的用 () 蛋白免疫小鼠获得 () 特异性单克隆抗体为 () 的含量测定提供基础方法通过全基因合成的方法获得目的基因序列转化大肠杆菌 * 细胞诱导 +," () 及 () 蛋白表达纯化后用作抗原免疫小鼠取脾融合筛选稳定分泌抗体的阳性细胞株制备并纯化单抗通过 )-)".(/00*1)(, ' 等方法进行检测结果体外高效表达 () 蛋白并成功制备特异性单克隆抗体效价在 # * 以上亲和常数为! 2 * 结论获得高亲和力 () 单克隆抗体为其含量的检测奠定了基础关键词 () 细胞融合单克隆抗体中图分类号 32 乙型肝炎病毒,4'%,+5 感染是全球性的重大疾病问题每年有 # 6 万人死于 +5 感染引起的慢性肝炎肝硬化和肝癌等 178" 具有抗病毒及免疫调节双重作用是目前 +5 感染的一线治疗药物慢性肝炎作为一种慢性疾病在治疗上一般疗程较长费用较高然而临床上只有 #9 6#9 的慢性肝炎患者使用 178 治疗有效如何在早期预测治疗疗效确定干扰素治疗的适宜对象正确指导临床用药就显得十分关键 # 寡腺苷酸合成酶 # " :,, () 是 ; ' 等在干扰素 ' '178 处理过的细胞提取液中发现的酶干扰素处理人细胞主要诱导产生 () - ()! - 和 () - 种类型 () 蛋白 " 在 178 和细胞膜上的受体作用下细胞合成大量无活性的 () 当有双链 8( 或者具有微二级结构的单链 8( 存在时 () 被激活而具有催化活性它以 (. 为底物催化合成 "# 寡腺苷酸 "#( # "#( 特异性结合并激活核酸内切酶 8(, * 降解病毒的 8( 及细胞的 8( 从而发挥抗病毒的作用临床研究表明通过在用药前后检测 () 活性在一定程度上可以预测患者使用 178 治疗的疗效从而指导临床合理用药! 收稿日期 "#" 修回日期 "!" 通讯作者电子信箱 $% &' ' 目前 () 的活性检测多采用放射免疫的方法存在检测方法繁琐费时花费高的缺点在临床上普遍应用有一定的困难采用 0*1)( 的方法通过检测 () 含量水平而推测其活性从而指导临床用药可能为解决这一困难提供便利本研究通过原核表达快速制备免疫抗原采用经典的杂交瘤技术制备 () 特异性单克隆抗体为 () 的含量检测提供研究基础材料与方法材料. 引物上游引物 # "/( ( //( / /(((//((" 下划线部分为 1 酶切位点下游引物 # "//(( ( / / /( / //(//" 下划线部分为 1 酶切位点表达质粒 0 " < 由北京三元基因工程有限公司保存 * -0 *,) 感受态细胞 -8( 凝胶回收试剂盒羊抗鼠 1 /"+. 可溶型单组份 = 底物溶液增强型 +."-( 底物显色试剂盒购自天根生化科技北京有限公司 -8( 连接酶限制性核酸内切酶购自 ; 公司 =%, () 购自 ( 公司 1) " =%, = ( : 1,, 购自 ) 公司清洁级 (* 雌性小鼠小鼠骨髓瘤细胞 ). "( 细胞购自中国药品生物制品检定所

2 2 中国生物工程杂志 5 8 方法重组质粒的构建及蛋白的表达纯化和检测 () 基因序列来源于 81 数据库在其 8 端添加个 +, 的标签和 05 蛋白酶切位点由生工生物工程有限公司上海全基因合成总长度 0 " < 质粒为表达载体构建 0 " "+," () 表达载体. 合成不含 +, 标签的 () 基因片段构建 0 " " () 表达载体转化入大肠杆菌复合自动 2 诱导培养基诱导表达 +," () 蛋白使用金属螯合层析结合切胶纯化方法制备用于动物免疫 () 蛋白使用强阳离子交换 ). 层析纯化用于阳性细胞株的筛选 +, 单抗对 +," () 及 () 蛋白进行, ' 鉴定动物免疫及细胞融合共免疫只 (* 雌性小鼠按照 # 只的剂量背部皮下注射进行初次免疫其后间隔 6 周按照 # 6# 只的剂量加强免疫初次免疫周后小鼠尾静脉取血用 0*1)( 方法检测血清效价取未免疫鼠血清作为阳性筛选阴性对照血清取腹腔巨噬细胞为饲养细胞免疫鼠血清用于阳性筛选阳性对照血清加强免疫天后断颈处死取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 ). "( 融合融合后细胞置!>#9 培养箱内培养阳性细胞株筛选抗体的制备与纯化阳性细胞株的筛选每天观察孔板细胞记录和标记有细胞群落出现的孔筛选并标记阳性孔以有限稀释的方式将强阳性的杂交瘤细胞进行亚克隆化直至得到稳定的强阳性的单克隆细胞株扩大培养后制备小鼠腹水及冻存小鼠腹水制备及抗体纯化将对数生长期状态圆亮饱满的杂交瘤细胞轻柔吹打收集致敏小鼠下腹部腹腔注射制备腹水! 6 天后小鼠腹部明显膨大后收集腹水采用辛酸硫酸铵法纯化腹水用紫外分光光度法测定纯化后的单克隆抗体的蛋白浓度纯化出的单抗分装后于 2> 保存备用抗体的性质及表征抗体的亚型鉴定应用 1) " =%, = ( : 1,, 检测单克隆抗体的亚型单克隆抗体的, ' 鉴定取 +," () 及 () 蛋白进行 )-)".(/0 按? # 稀释单抗加入羊抗鼠 1 /"+. 应用增强型 +."-( 底物显色试剂盒显色抗体的纯度及分子质量检测通过 )-)".(/0 法测定单克隆抗体的效价检测间接 0*1)( 法检测单克隆抗体的效价对比检测纯化 "# 抗体及购买的鼠源单抗 # 抗体与固定化抗原的亲和常数按照等提供的方法确定结果及蛋白的表达及纯化重组质粒经测序正确后转化入大肠杆菌经诱导表达主要以包涵体的形式表达 +," () 分子量大约为 - () 分子量大约为 - 包涵体中目的蛋白含量占 9 以上如图 +," () 的表达量约为 * () 的表达量约为 # * 纯化后经软件分析纯度均达到 9 以上如图, ' 结果表明 +," () 能特异性与 +, 单抗结合而 () 不能结合如图图蛋白表达纯化及检测! "# $%&' "#'#!!# " "% )-)".(/0,, $ ', +," () : () ' * : ' * -0 ', : 0 " "+," :% ' * -0 ', : 0 " "+," :% ' * -0 ', : 0 " " # ' * -0 ', : 0 " " :% 1 %, : +," ()! 1 %, : () )-)".(/0,, %' : +," () : (), ',, +," () : () 杂交瘤细胞制备及融合率和阳性率取纯化后的 +," () 按照计划进行免疫免疫后 (* 雌鼠脾细胞和 ). 小鼠骨髓瘤细胞融合后块孔板! 孔出现融合细胞融合率为 9 以上经 0*1)( 方法初步筛选阳性孔有个阳性率为

3 李孜等 () 蛋白单克隆抗体的制备及其表征 2 9 之后经过次亚克隆筛选出株能够稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株其中阳性最强的一株命名为 "# 抗体的亚型鉴定取细胞培养上清倍稀释后经 1) " =%, = ( : 1,, 检测单克隆抗体的亚型结果见表吸光度数据显示 " 为 1 / 亚型其他 # 株均为 1 / 亚型表 ( 株单克隆抗体细胞株亚型测定 )'! $ *!!# %&' "#"% +!(,"#"& "#' '# " * 克隆编号亚型 ( "# ( "!" " " "# 1 /! #!2!# 1 / # 2 1 /! 1 / #! 1 ( #! #2 1 = 2 # - 抗体的纯化及纯度和分子量检测取对数生长期状态圆亮饱满的 "# 杂交瘤细胞制备小鼠腹水采用辛酸硫酸铵方法纯化紫外分光光度法测定蛋白浓度为!.) 调整抗体浓度为 )-)".(/0 对纯化的抗体蛋白进行纯度和分子量分析电泳结果显示抗体蛋白经还原电泳呈现清晰的两条带其中重链约 # - 轻链约为 - 非还原电泳抗体分子大小约为 # - 经图像软件分析其纯度可达 9 以上结果见图可以满足免疫分析的需要图.- / 纯化抗体的 0 1 分析 0 1 '#' * "%$%!.- / '# " * :% : "# 8"' :% : "# / 抗体的!!# " 鉴定 +," () 和 () 蛋白经 )-)".(/0 转膜一抗孵育二抗孵育后显色显示如图所示其中为结果为凝胶对照 +," () 和 () 蛋白均可以和单抗 "# 特异性结合图单克隆抗体!!# " 检测!!# " '#' * "%,"#"& "#' '# " *, ',, +," ()+ : () )-)".(/0,, +," ()+ : () ( 抗体效价测定纯化后的 "# 抗体及购买的 ( 鼠源单抗初始浓度均为系列稀释后测定吸光度值得稀释曲线图以吸光度值较阴性对照高为阳性标准计算 "# 抗体效价为 # # * 购买 ( 抗体效价为 * 图 -.- / 抗体及 &', 抗体稀释曲线 -0 $ "#&$! "% &.- / '# & &', 抗体亲和常数测定按照的方法得出抗体稀释曲线图 # 计算亲和常数为! 2 * 表明抗原抗体的结合力为中等以上强度抗原 " 抗体结合物可以较稳定地存在该抗体可以应用于免疫分析测定中讨论目前我国有乙肝患者万对慢性 +5 感染病毒复制指标持续阳性者抗病毒治疗是一项重要措施干扰素具有抗病毒及免疫调节双重作用是目前 +5 感染的一线治疗药物然而使用 178" 治疗病毒性肝炎是一个长期用药的过程不同患者对 178" 治疗的反应个体差异很大临床上只有 #9 6#9 的慢

4 中国生物工程杂志 5 8 图 / 不同抗原包被浓度时单克隆抗体的稀释曲线 / & $ "#&$! ' %!!# &"'! '#!#&"#&!# ' "# 性肝炎患者使用 178" 治疗有效而且其疗效也和 178" 的剂量和疗程以及患者的自身情况有关因而如何在用药早期确定 178 治疗的适宜对象治疗用最佳剂量及疗程实为正确指导临床用药的重要手段! 之一安萍等研究了例慢性乙型肝炎患者临床应用 178 后观察用药前后 () 活性变化结果提示我们通过在用药前后检测 () 活性可以预测患者使用 178 治疗的疗效从而指导临床合理用药吴诗品等通过对 # 例慢性乙肝患者的研究发现 () 基础活性较高的患者对 178 反应性较弱若治疗时 () 活性没有明显升高则说明该患者对外源 178 反应低下不适宜使用 178 治疗若患者治疗前 () 活性较低治疗后活性明显升高说明患者使用 178 治疗可能会获得较好疗效如果能在干扰素治疗的早期就可以预期疗效不仅可以更快地为患者制定有效的治疗方案以免延误病情而且减轻了可能经过长期用药无效的患者身体和经济上的负担关于抗原的选择 +," () 与 () 相比增加了 +, 标签在纯化上有较大的优势表达量也比不含标签的蛋白高很多并且 +, 标签的免疫原性很低基本不影响蛋白的免疫且动物免疫需要较长的时间在实验早期采用 +," () 作为免疫原方便了抗原的制备后期采用 () 蛋白来进行筛选规避了筛选出的抗原可能为针对 +, 标签的缺点同时采用不同的免疫抗原和筛选抗原进行交叉筛选在一定程度上增加了抗体的特异性采用经典的单克隆抗体制备技术利用抗原免疫动物经过细胞融合阳性克隆筛选细胞株扩大培养动物体内诱生腹水等过程最后获得了 () 的单克隆抗体使用 "# 细胞株制备腹水制得的抗体效价达到 # # * 比购买的抗体效价高 # 倍以上同时亲和力检测显示具有较高的亲和力最终确定株阳性细胞其中有一株 " 亚型为 1 / 与其他 # 株 1 / 亚型不同揭示了可能找到一对识别不同的抗原结合位点的单克隆抗体为制备双抗夹心法检测 () 含量试剂盒提供了条件和基础下一步计划将抗体酶标后筛选配对抗体摸索 0*1)( 检测条件成功制备 () 检测试剂盒后考察含量检测与活性之间的联系为乙肝治疗的临床检测提供快速有效的手段参考文献 ' 8, = 1 %,4'%, :,4'%, 8 41 % # # #" /, / % ' ' : %%' :', ',4' *4 '-, # # "# # A. +4, ( 7%': ' ', ' '":% : # " (,, : : % %, A 2! 2 2# "2#! +4, (/ )4 A ='B1 ' 'C " : " - ', "#(",, ' ' '"' : %, A 22 #" # +4, (/ 1 ' '":% : : :% ",': : 8(" 4 : C,, ', : # " :,,, A1 ' ', " # ) 4 ' + 5' % ',@ # " :,, : 8, *:%' ' ' 4' ',, A 5'! 2! "!! 安萍秦绍明杨开宇等慢性乙型肝炎病人注射 " 干扰素后 "#() 活性动态变化及其临床意义天津医药 #!" (.3 ) =D ;D E = : A%' #!" 2 )%: '7.' ':% %":% :,, % %',.' 0$ '.%' #!" A - / 5, / =,%' : " 4 C %, A1 % = :, 2! "! "! 3 7 +%+ (",4'%, 4

5 李孜等 () 蛋白单克隆抗体的制备及其表征 :,, ' %, '% % " ' '" " %, ' :.' 2 " 吴诗品苏冬娜 + 患者.= 中 "#() 基础活性对 178 信号分子改变的影响中华微生物学和免疫学杂志 " % ). )% - 8, A%' = ' : 1 % " 1" $& "#'#.+' '&! ' "#"%# "#"& "#' # " * *1 ( " /( ": * ": * ) :.' % 4 ', 8E E '".' / 0 ' 1 ' ' : E '& ( : (), ' ' : % %, = :, ' %C +," () $ ', : *, = : = ' ' : ': 1: %' : ' ',,, : = ( %' : %,% : 4 ' ' 4 % )-)".(/0 0*1)(, ' : ' :,@ ' %, :,%, + $ ', () ' = ( : : :, :, "# ' "#"= ' * :, "#"= * %, ' ' "#"= (,4 ' ' %' ' '4 : ()!* 2" () %,= : 广告索引广州艾贝泰制药设备科技有限公司封面默克化工技术上海有限公司封二爱普拜斯应用生物系统贸易上海有限公司彩上海日泰医药设备工程有限公司彩上海森松制药设备工程有限公司彩镇江东方生物工程设备公司彩 # 宝生物工程大连有限公司彩彩! 安倍医疗器械贸易上海有限公司彩 2 ', 中彩艾本德中国有限公司中插上海国强生化装备工程有限公司中插 # 高科技与产业化中彩伯乐生命医学产品上海有限公司封三基因有限公司封底

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌