- 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期!" #$% & 流感病毒为 & 病毒 目前已有 余种亚 ( 型 且持续变异 对流感的防控带来巨大挑战 根据核蛋白 ) 和基质蛋白 * 抗原性的不同 流感病毒可分为甲乙丙三型 其中甲型流感病毒引起的 ( 病症最严重 ) 在不同亚型的甲型流感病毒中高度保

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1 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期!" #$% & 论著 甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体制备及其初步应用 张儒轩沃恩康丁建祖方迪陈帅帅杨新燕郭潮潭 (--( 杭州 浙江省医学科学院生物工程研究所通信作者 郭潮潭 ) 1"9))(" #<-(-+")$$(---- 摘要 目的制备甲型流感病毒核蛋白 单克隆抗体 为甲型流感病毒诊断试剂盒以及相关研究提供材料 方法大肠埃希菌 #( 表达 作为免疫原 免疫 ) *+" 小鼠后取脾脏细胞与 +- 细胞融合 筛选获得阳性细胞株 注射小鼠腹腔得到单克隆抗体 纯化后进行 $ 印迹法 & 法 细胞免疫染色和荧光法 双抗夹心 & 法确定 抗体的生物学特性 探索应用范围 结果从 $ 印迹法 & 和细胞免疫染色法的结果可得知 抗 单克隆抗体可以与免疫原特异性结合 也可以与 //( 亚型流感病毒的 特异性结合 具备检测流感病毒的能力 双抗夹心 & 法进一步提升了抗体对抗原的检测灵敏度至 0 1 同时 通过细胞免疫荧光法观察到抗体可在细胞内显示 从细胞核扩散到细胞质的过程 结论制备的抗体成功检测 //( 两种亚型的流感病毒 可作为用于流感防治的流感病毒诊断试剂盒的材料 关键词 流感病毒 & 型 核蛋白 单克隆抗体基金项目 国家自然科学基金 (-0(0-00 国家卫生和计划生育委员会科研项目 0 国家中医药管理局科研项目 # 浙江省科技计划 2(2 浙江省医药卫生科技计划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

2 - 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期!" #$% & 流感病毒为 & 病毒 目前已有 余种亚 ( 型 且持续变异 对流感的防控带来巨大挑战 根据核蛋白 ) 和基质蛋白 * 抗原性的不同 流感病毒可分为甲乙丙三型 其中甲型流感病毒引起的 ( 病症最严重 ) 在不同亚型的甲型流感病毒中高度保守 差异性不超过 + ( 是流感病毒的重要结构蛋白 由第五片段基因编码 - 个氨基酸 约占病毒颗粒的 + ( 常与病毒基因组及少量 ) 以 /) 的形式存在于病毒颗粒中 主要影响病毒复制与增殖 因此 ) 常作为流感病毒诊断及分型的 0( 重要依据和流感病毒的治疗靶点 本研究利用流感病毒 ) 原核表达质粒在大肠埃希菌中诱导表达获得抗 ) 单克隆抗体 并进一步探索其在流感预防中的应用价值 材料与方法一 材料与主要试剂质粒 1-) 和 "#&)& 由本实验室构建 2" 小鼠 03- 周龄 雄性 和杂交 代小鼠 03- 周龄 雄性 由浙江省实验动物中心提供 批号 4567 沪 0( 种流感病毒毒株 &2)8 "2-29)- 和 &2*:$22 9*:$ 由本实验室保存 # 辣根过氧化物酶 9) 羊抗鼠 ; 购自康为世纪公司 & 8 -- 标记山羊抗小鼠 ; 购自碧云天公司 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自 4; 公司 #** 为 9" 公司 非必需氨基酸 91 原液 9&1 原液 购于 /; 公司 胎牛血清为杭州四季青公司产品 聚乙二醇 ) 购自 ": 公司 二 流感病毒 ) 表达和纯化将 1-) 重组质粒以热激法转化至大肠埃希菌 # 中 阳性表达菌体接种于卡那霉素 中 振荡培养至 0 介于 0- 之间 加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷 )1 至终浓度 2 振荡培养 : 离心收集菌体 超声破碎菌体 康为世纪 &;$ 9$ 标签蛋白纯化试剂盒 包涵体蛋白 按说明书纯化 ) 三 动物免疫及抗体纯化常规免疫法将纯化后的 ) 作为抗原免疫 2" 小鼠 将对数生长期的骨髓瘤细胞 4)2 与抗体效价最高的小鼠脾细胞进行融合 择阳性克隆以有限稀释法获得能够产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株 将杂交瘤细胞以 3 0 个 2 只的量注入 小鼠腹腔内 后收集腹水 并通过辛酸 硫酸盐盐析法纯化获得抗体 取一部分标记 9) 四 $ 印迹法鉴定单克隆抗体 + 的 4#4)& 分离 ))-*:$ 病毒 转印至 )# 膜 + 脱脂奶粉封闭后与杂交瘤上清室温孵育 : 洗膜后 与 9) 标记羊抗小鼠 ; 孵育 : 洗涤后用四氯萘酚法显色 五 间接 4& 测定 用于抗体效价 ) 以 ;2 孔包被过夜 抗体以 稀释度起始 倍梯度稀释所得单克隆抗体 与封闭后的抗原孵育 二抗为 9) 标记的山羊抗小鼠抗体 1* 显色 终止 测 用于测量流感病毒热灭活的 )-*:$ 以 ;2 孔起始 倍比稀释至 3 ;2 孔包被过夜 以 ) 单克隆抗体 为一抗进行孵育 酶标二抗孵育后 1* 显色 检测吸光度 阴性组以包被液代替病毒液 六 双抗夹心法 4& 检测流感病毒双抗夹心 4& 法以抗 *:$ 抗体作为包被抗体 包被过夜 夹心抗原为以 ;2 孔起始的热灭活 *:$ 病毒 倍比稀释至 ;2 孔 检测抗体为 9) 标记的 ) 单克隆抗体 孵育 : 1* 显色 测定 值 直接包被抗原组以 ;2 孔起始的热灭活 *:$ 病毒 倍比稀释至 ;2 孔包被过夜 另外 以 ;2 孔起始 倍稀释 *:$ 病毒至 - ; 作为夹心抗原 其他方法同上述双抗夹心 4& 所得 值用于检测双抗夹心 4& 法 ( 检测抗原的灵敏度

3 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期!" #$% & 七 间接免疫染色法检测侵染细胞的流感病毒将 (&) 和 *+$ (&) 两种病毒分别接种于 - 孔板中的 *#/0 单层细胞 经完全培养基培养 + 后 以甲醇固定 一抗和二抗分别为 单克隆抗体和 ( 标记的山羊抗鼠 1 孵育 + 四氯萘酚显色 八 间接免疫荧光法进行 亚细胞定位 病毒 (&) 接种于 - 孔板中的 *#/0 单层细胞 完全培养基分别培养 和 + 甲醇固定 洗涤 一抗为 单克隆抗体二抗 & 2 3 标记山羊抗小鼠 1 #& 染核 荧光显微镜观察 结 一 纯化重组 的获得质粒 4 用热激法转化至大肠埃希菌 5# 中 经 4 诱导表达 镍柱纯化后获得了重组 经 #& 分析 从图 & 可见未诱导菌体 诱导后的菌体在相对分子质量约 处可见较深的条带 显示生成大量蛋白 具有 - 个氨基酸 分子量大小与诱导条带相似 利用镍柱纯化提取目的蛋白 获得高纯度 纯化后的目的蛋白与抗 ($ 抗体进行 6$ 印迹法鉴定 图 在相对分子质量 处出现目的条带确认所得蛋白即为 相对分子质量 果 相对分子质量 注 核蛋白 为 纯化产物 #& 鉴定 其中 为 5 #4 未经诱导 为 5 #4 诱导 为纯化后 为 纯化产物 6$ 印迹法鉴定 其中 为纯化后 箭头所指为目标条带 图 重组 纯化产物 #& 及 6$ 印迹法鉴定 相对分子质量 注 核蛋白 &7 单克隆抗体 :9 抗 &7:9 箭头所指为目标条带 图 #& 分析抗 单克隆抗体 二 高效纯化的抗 单克隆抗体的获得用纯化的 重组蛋白对 78" 小鼠免疫 通过杂交瘤技术获得杂交瘤细胞 经细胞培养 多次筛选 获得了效价较高的 9 株可以产生抗 单克隆抗体的杂交瘤细胞 将杂交瘤细胞注射 2 小鼠腹腔后 获取 9 株单克隆抗体腹水 纯化后共获得 9 株纯化的抗 单克隆抗体 记为 单克隆抗体 :9 经 #& 分析 单克隆抗体重链相对分子质量为 9 左右 图 轻链相对分子质量为 左右 占总蛋白量的 -; 以上 纯化效果良好 三 抗 抗体的结合特性 单克隆抗体的结合特异性为了明确所得单克隆抗体的生物特性 采用 6$ 印迹法检测抗体的结合特异性 如图 所示 9 株 单克隆抗体不仅与重组 有结合能力 而且对 *+$ 病毒蛋白出现单一的结合带 结果提示它们单克隆抗体具有较高的结合特异性 单克隆抗体的结合能力为了解所得单克隆抗体的结合能力 采用间接 5& 方法检测 9 株单克隆抗体 倍梯度稀释后与抗原结合 显色后检测 9 以阴性对照组 值的 倍为阳性判定值 得 9 株抗体的效价分别为 和 说明 9 株抗体能够特异性结合 且效价较高 四 抗 抗体的应用 9 流感病毒的测定用间接 5& 法 测得抗 抗体与梯度稀释 9

4 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期!" #$% & 相对分子质量 抗 & 抗 & 抗 & 抗 & 抗 &* #& * ** 注 核蛋白 & 单克隆抗体 分别为以分泌抗 &* 的杂交瘤细胞上清为抗体的 $ 印迹法鉴定 为样品的 #& 鉴定 各图的 分别为 病毒 ()$ 病毒和 箭头所指为目标条带图 * 株杂交瘤细胞上清的 $ 印迹法鉴定 的 ()$ 病毒结合情况 图 结果显示 * 值跟随抗原浓度的下降而下降 说明抗体具有特异性检测 ()$ 毒株的能力 以阴性 * 值的 倍为阳性判定值 和 ()$ 的阴性对照值分别为 * 和 结果显示抗体对 的检测灵敏度为 + 对 ()$ 的检测灵敏度为 * + ()$ * + * + 稀释倍数 图 抗 抗体特异性检测 和 ()$ 病毒 -& 双抗夹心法检测流感病毒以双抗夹心 -& 法 与病毒直接包被的直接 -& 法进行比较 直接包被病毒组在 /* 已经达到最小检测浓度 图 * & 对双抗夹心 -& 法能够检测 ()$ 病毒的最小浓度进行探究 将饱和浓度的 ()$ 抗体包被后 以 0 孔起始 * 倍稀释抗原 结果显示 双抗夹心 -& 法对于 ()$ 的灵敏度可以达到 灵敏度明显高于直接 -& 法 图 * 1 间接免疫染色法检测细胞内的流感病毒 和 ()$ 两种毒株侵染细胞后固定 抗 单克隆抗体孵育显色后与阴性对照进行比较 图 + 和 ()$ 侵染组的一些细胞在四氯萘酚染色后 呈现明显的蓝色 而阴性对照组未显蓝色 根据实验结果推断 抗 单克隆抗体可以结 %$# * *! "* " # $ * * + 稀释倍数 ()$ 病毒包被 + + * + 稀释倍数 1 ()$ 抗体包被 双抗夹心 注 & 为直接包被 ()$ 病毒的间接 -& 法 1 为包被 ()$ 抗体的双抗夹心 -& 法 箭头所指为最小检测剂量 图 双抗夹心 -& 检测 ()$ 病毒

5 ?E ( 国 际 流 行 病 学 传 染 病 学 杂 志!"#$ 年 % 月 第 %% 卷 第! 期 &()* + -/)012 &3)4( *2!"9$! :12; %%!<1;! # 8 $ 注$ <= $核蛋白# 8 为流感病毒 8I=J)*(1 >41I?I#KE% %L#<# &M #为流感病毒 8I@)0-A6I#I#K$# %LE<! &M $为阴性对照#箭头所指为阳性 图" 抗 <= 单克隆抗体检测细胞内的流感病毒%四氯萘酚!!%HH & 合侵染细胞的=>? 病毒" 通过显微镜观 后! 自? A 开始可以自细胞内观察到荧光! 结合 察细胞! 确认抗 <= 单克隆抗体对侵染细胞的不同 58=& 核染情况! 确认绿色荧光即为 <= 所在部位" 亚型流感病毒具有检测作用" 在? A 时!一部分细胞仅细胞核产生荧光!核质均发 %; <= 的亚细胞定位 光的细胞中细胞核明显更加明亮#9D A 时! 大部分 图 $ 显示!观察流感病毒侵染细胞后不同时间 细胞 核 质 均 发 光!胞 核 明 亮!少 部 分 细 胞 仅 细 胞 核 下 <= 在细胞中的定位" =>? 细胞 产生荧光#E! A 时!细胞核与细胞质均产生荧光!亮 <= 08F "A?A 9D A E! A 注$ <= $核蛋白# 08F $单克隆抗体#<= 08F $以 抗 <= 08F 为 抗 体 孵 育 #58=& $以 58=& 为 染 料 进 行 核 染 #@)*G) $将 同 一 时 间 同 一 视 野 的 的 <= 08F 与 58=& 叠加#箭头所指为阳性 图! =>? 侵染细胞不同时间下 <= 的亚细胞定位%!%H" &

6 1 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期!" #$% & 度差异不明显 说明 在病毒侵染前期主要分布于细胞核 而后在细胞核与细胞质中均有分布 夹心 -& 亚型鉴定试剂盒 用于初步分型和亚型鉴定 便于后续治疗 讨 论 参考文献 本实验以原核体系表达流感病毒 作为免疫原 免疫 ()" 小鼠后取脾细胞与骨髓瘤细胞融合 经筛选获得 * 株能够稳定分泌抗 单克隆抗体的杂交瘤细胞 注射 + 小鼠腹腔后得到 * 株抗 单克隆抗体 通过 $ 印迹法和 -& 法鉴定 确认 * 株单克隆抗体均对 具有较强的特异性结合能力 在抗体与病毒实验发现 $ 印迹法出现特异性条带 -& 结果的呈阳性 细胞免疫染色法中被病毒侵染的细胞显色 证明抗体对 / 亚型病毒 01 和 / 亚型病毒 $ 病毒具有结合能力 相对于直接检测病毒 双抗夹心 -& 法的检测灵敏度更高 检测时间缩短 为流感病毒的鉴别和诊断提供便利 由于 01 和 $ 两毒株为非基因获取株 根据结论推测 抗 单克隆抗体是否具有检测甲型流感病毒的广谱性 还需进一步验证 比如将抗体进一步与更多亚型流感病毒进行结合性实验 或者对 进行 细胞抗原表位分析 找到抗 抗体针对的抗原表位 从理论上支撑抗 抗体作为诊断和鉴别流感病毒试剂盒材料的可行性 利用抗 抗体对被侵染后的 # 细胞进行 亚细胞定位 结果呈现了 从细胞核到细胞质的迁移路径 病毒侵染细胞入核后在 0& 依赖的 0& 合成酶的作用下进行基因组的转录与复制 在细胞核大量聚集 所以在 1 可以观察到多数细胞的细胞核 而后 通过 0 依赖通路以 0 的形式出核 所以在 2 和 细胞核与细胞质中均可以检测到大量的 345 抗 抗体能够追踪 的位置 显示 在病毒入侵细胞后的路径 表明该抗体在科学研究中具有应用价值 综上所述 本研究获得的甲型流感病毒抗 抗体可以作为用于流感病毒鉴别诊断试剂盒的研发 例如甲型流感病毒鉴定试剂盒 流感病毒双抗 /$$"!" $8$"!" 9: :"$! 9! 9; & 9$$ & $:$" #6 4) & $9 /-9 /9 0& "! (8! 9; & 9$ 9" 35 8: #6 442) 陈帅帅 丁建祖 尤金彪 等 流感病毒 单克隆抗体的制备及其生物特性 35 国际流行病学传染病学杂志 4*1 #6424)"$$ #8 9 ( 8" ""$"$!! 9; 9$ < " (:35!" #$4* 1 #6 424)"$$ & 8"!! 9; 9$ 9" $$" : "!$! * #6 412) =* 3*5 " >; #! 9; 9" $8 8! ": 3 5 & 4 #6 41*)* 325 ( 7 $?9" "$ $( "9 9 $! 9; 9$ 9" $ 9 $ 988( 835!" > 4*444 #6 442)84* #! " " -&! "!!" ($ " (:! $44 #6 412) : / 9"! " ($ -&! ( "35 :" 8: ***2 #6 444)+44** 35 / -/$ 9! " ($ 8$ 98"! 9; 9$ $35 9 $41 *4 #6 442) >9 =- 08 = & " 9" "(9$! 9; & 9$ " (: "8 :$ 35 8:422*4 #6 442) " #9 # - 0"( 9" :$$35 $ 41*1 #6 444)12 A 收稿日期 444*

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