203,33(6) 张立剑等 : 重组人源性脂联素球状结构的表达纯化与活性检测 69 糖尿病人, 组织总 RNA 提取试剂盒 RT PCR 试剂盒 DNA 回收试剂盒购自上海博亚公司 ; 限制性核酸内切酶 NdeⅠ 和 EcoRI T4DNA 连接酶 DNAMarker 均购自 TaKaRa 公司

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灾夏萧
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,203,33(6):68 73 重组人源性脂联素球状结构的表达纯化与活性检测张立剑孙璐郭云萍李冬冬 2 王增禄刘毅 2 张英起 ( 第四军医大学西京医院西安第四军医大学药学系生物技术中心西安 70032) 陶凌摘要目的 : 利用基因工程方法构建人源性脂联素球状结构 (gad) 基因的高效原核表达体系, 并对重组蛋白进行诱导表达纯化鉴定及活性检测方法 : 从正常人脂肪组织里面提取总 RNA, 反转录合成 cdna, 经 PCR 扩增酶切后连入 pet 22b(+) 载体构建重组质粒 pet 22b(+) gad, 重组质粒转化大肠杆菌 BL2(DE3) 感受态细胞经诱导剂诱导后目的蛋白以包涵体形式产生, 采用强碱促溶包涵体并用丙酮沉淀蛋白的方法进行复性和纯化, 得到高纯度的人源性 gad 运用 SDS PAGE Westernbloting 对重组蛋白进行鉴定, 通过对蛋白激酶 (AMPK) 的磷酸化水平和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用来检测纯化蛋白的生物学活性结果 : 成功构建了原核表达载体 pet 22b(+) gad, 实现了人源性 gad 在原核细胞中的表达, 并对形成的包涵体变性复性和纯化, 纯化出的蛋白经过 SDS PAGE 和 Western 分析证实为 gad; 通过对 AMPK 的磷酸化水平的检测和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用证明纯化出的 gad 具有高生物学活性结论 : 成功构建表达和纯化了无标签高生物学活性的人源性脂联素球状结构 (gad), 为其进一步的理论研究生产开发奠定了基础关键词重组人脂联素球状结构表达纯化心脏保护中图分类号 Q786 脂联素主要是由脂肪细胞分泌的一种细胞因子, 是一种与细胞外基质相互作用的血浆蛋白, 具有调节血糖血脂, 抗炎及改善血管内皮功能等多种作用, 其含量和活性改变与肥胖 2 型糖尿病 (T2DM) 心血管疾病的发生有密切的关系 [ 2] 研究表明, 给予外源性脂联素能够改善糖尿病动物胰岛素抵抗, 降低血糖血脂和减轻体重 [3 4], 同时外源性脂联素还能减轻心脏的心肌缺血再灌注损伤, 起到心脏保护作用 [5] 所以, 脂联素有望成为治疗 2 型糖尿病和心血管疾病的候选药物然而其大量生产仍然是一个难题全长脂联素包含有 4 个结构域 : 氨基端的信号序列区可变区胶原样区及羧基端球状区 [6] (globular 收稿日期 : 修回日期 : 国家重大新药创制 (2009ZX ) 国家自然科学基金 ( ) 新世纪优秀人才支持计划 (20SXJ0) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :lingtao2006@gmail.com [7] domainofadiponectin,gad),fruebis 等首次报道了脂联素球状结构 (gad) 存在于正常人的血液中, 能降低小鼠血浆葡萄糖和游离脂肪酸的水平, 可以使其体重减轻, 且其活性要强于全长型的脂联素本研究通过基因工程技术研究构建不带标签重组人源性 gad 的原核表达体系, 并建立其相关的分离纯化体系, 旨在寻找简便易行经济有效地纯化和生产的技术方案, 为今后的大批量生产奠定切实可行的工艺流程基础材料与方法. 材料.. 菌株与细胞 E.coliBL2(DE3) 菌株,pET 22b (+) 载体均由第四军医大学生物技术中心馈赠 ; HUVECS(CRL 2873) 购自美国 ATCC;C57 小鼠购自第四军医大学实验动物中心..2 主要试剂正常脂肪组织来源于西京医院非

2 203,33(6) 张立剑等 : 重组人源性脂联素球状结构的表达纯化与活性检测 69 糖尿病人, 组织总 RNA 提取试剂盒 RT PCR 试剂盒 DNA 回收试剂盒购自上海博亚公司 ; 限制性核酸内切酶 NdeⅠ 和 EcoRI T4DNA 连接酶 DNAMarker 均购自 TaKaRa 公司 ;DMEM 培养基胰蛋白酶购自 Gibco 公司 ; 抗 APN 抗体购自美国 Sigma 公司 ; 抗磷酸腺苷激活的蛋白激酶 (AMPK) 抗体抗磷酸化的 AMPK 抗体购自美国 CelSignalingTechnology 公司 ; 凝胶成像系统购自美国 UVP 公司 ;BCA 蛋白定量试剂盒购自碧云天 ; 标准品 gad 购自美国 R&D 公司 ; 其它试剂均为国产分析纯..3 引物合成据已报道的人 gad 基因编码区序列设计引物, 由北京华大基因公司合成 : 上游引物 :5 GGATATCCATATGTATGTATACCGC TC 3 下游引物 :5 CCGGAATTCTCAGTTGGTGTCATG 3.2 方法.2. 重组质粒 pet 22b(+) gad 的构建从人脂肪组织里面提取总 RNA, 反转录成 cdna, 利用 gad 的特异性引物扩增目的片段 gad, 所得 DNA 片段经 NdeI 和 EcoRI 双酶切后连入同样用 NdeI 和 EcoRI 双酶切得到的 pet22b(+) 载体片段, 连接产物用 CaCl 2 法转入 E.coliBL2(DE3) 感受态细胞筛选阳性克隆, 提取质粒进行酶切鉴定测序鉴定.2.2 gad 的诱导表达取阳性克隆涂 LB(Amp + ) 平板, 挑取生长状态良好的单克隆, 接种于 LB(Amp + ) 液体培养基中,37 振荡过夜培养, 次日按 00 比例转接于新鲜 LB(Amp + ) 液体培养基中,37 继续培养, 至细菌密度达到 OD 600 =0.4~0.6, 加入终浓度为 mmol/l 的 IPTG,37 诱导 3h 后收集菌体.2.3 gad 的复性和纯化取上述诱导后的湿菌, 经冰浴超声裂菌后, 离心收集沉淀目的蛋白以包涵体形式产生对包涵体进行变性复性和纯化, 采用如下方法 :() 包涵体的洗涤 : 将包涵体溶解在 20mmol/L Tris HCl(pH8.0),EDTAmmol/LEDTA,2mol/L 尿素中, 搅拌溶解 2h,4 离心 2000r/min,5min, 收集沉淀再将沉淀溶于 20mmol/LTris HCl(pH 8.0), EDTAmmol/LEDTA,8mol/L 尿素中, 搅拌溶解 2h, 4 离心 2000r/min,5min, 收集沉淀 (2) 包涵体的变性复性和纯化 : 将收集沉淀重悬在 20mmol/LTris HCl(pH8.0) 缓冲液中, 用 mol/l 的 NAOH 将其 ph 值由 8 调至 2.5, 使沉淀彻底溶解 4 离心 2000r/min,5min, 收集上清然后将预冷的丙酮缓慢加入到收集的上清中, 静置 30min, 使上清中蛋白沉淀下来,4 离心 2000r/min,5min, 收集沉淀将丙酮沉淀下来的蛋白收集起来, 溶解于 PBS 中,BCA 法测蛋白质含量, 分装后 -80 保存备用.2.4 纯化 gad 的 Westernblot 分析 SDS PAGE 电泳后将胶上蛋白通过湿转电转仪转移至 PVDF 膜上, 5% 脱脂奶粉封闭 h,tbst 洗膜后, 滴加 000 的一抗 4 下孵育过夜, 以 TBST 洗膜 3 次, 5000 的 HRP 偶联的羊抗兔 IgG 室温孵育 h 洗涤, 加 Western 荧光检测试剂后, 用凝胶成像系统照相观察结果.2.5 纯化 gad 的体外生物学活性检测将传至 4~ 6 代的人脐静脉内皮细胞接种至 6 孔培养板中, 加入含 0% 胎牛血清的 DMEM 糖培养基培养待每孔细胞铺至 80% 时, 用无血清的 DEME 低糖培养基培养孵育 6h, 然后于每孔中分别加入含 PBS2 纯化的 gad (3μg/ml) 的 DMEM 培养基,3gAd 标准品 (3μg/ml) 在 37 孵育 5min, 收集细胞, 用 Westernblot 检测磷酸化磷酸腺苷 (AMP) 激活的蛋白激酶 (AMPK) 的水平.2.6 纯化 gad 的体内生物学活性检测采用小鼠缺血 / 再灌注模型, 将小鼠左冠状动脉前降支处打一活结, 缺血 30min, 再灌注 24h 再灌注前 0min 腹腔分别注射 PBS 纯化的 gad(2μg/g) 以及 gad 标准品 (2μg/g) 再灌注 24h 后用 TTC 检测心脏的梗死面积, 超声检测心功能.3 统计学分析采用 SPSS3.0 软件进行统计学分析, 实验数据以 x±s 表示, 以 P<0.05 差异为有统计学意义 2 结果 2. 酶切和序列测定用限制性内切酶 NdeⅠ 和 EcoRI 双酶切 pet 22b (+) gad, 在约 430bp 处可见 gad 特异性条带 ( 图 a), 测序结果为序列正确的人源性 gad( 图 b), 说明重组质粒 pet 22b(+) gad 构建成功 2.2 gad 的表达研究结果显示, 在 37 培养时细菌密度随时间变化, 当培养至 OD 600 =0.4~0.6 时, 重组菌的细胞增殖进入快速分裂增殖期, 此时是加入诱导剂的最佳时间 SDS PAGE 结果表明 ( 图 2),IPTG 诱导 BL2/pET 22b (+) gad 后, 在 5kDa 处有明显的新生条带出现如图 2 所见, 通过 IPTG 诱导脂联素球状结构使其表达增加, 达到 0% 以上

70 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.6203 图 gad 的酶切和序列测定 Fig.

(b)sequencinganalysisofrecombinantplasmidpet 22b(+) gad 图 3 gad 包涵体的变性复性及纯化 Fig.

Thesupernatantafter8mol/Lureawashing;5:Peletafter8mol/L ureawashing;6:thepeletafteralkaline shocksolubilizations (b)theacetoneprecipitatedgaddisolvedinpbs 异性结合, 并与理论分子量 (5kDa) 相符的位置显示单一条带图 2 gad

3 gad 的纯化和鉴定超声裂菌后包涵体变性复性纯化步骤 :() 包涵体的洗涤 : 超声裂菌后的沉淀分别经 20mmol/LTris HCl(pH8.0),EDTAmmol/LEDTA,2mol/L 尿素 ;20 mmol/ltris HCl(pH 8.

3 70 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.6203 图 gad 的酶切和序列测定 Fig. TheidentificationofhumangAdbydigestionof restrictionenzymesandsequencinganalysis (a) TheidentificationofhumangAdbydigestionofrestriction enzymes :DNAMakerDL20002:NdeⅠ /EcoRIdoubleenzyme digestion (b)sequencinganalysisofrecombinantplasmidpet 22b(+) gad 图 3 gad 包涵体的变性复性及纯化 Fig.3 ThepurificationofhumangAd (a)sds PAGEanalysisofhumangAdpurification M:Protein maker,:thepeletofbacteriallysate;2:thesupernatantafter 2mol/Lureawashing;3:Thepeletafter2mol/Lureawashing;4: Thesupernatantafter8mol/Lureawashing;5:Peletafter8mol/L ureawashing;6:thepeletafteralkaline shocksolubilizations (b)theacetoneprecipitatedgaddisolvedinpbs 异性结合, 并与理论分子量 (5kDa) 相符的位置显示单一条带图 2 gad 诱导表达的 SDS PAGE 图 Fig.2 TheexpresionofhumangAd :ThepeletbeforeIPTGinduction;M:Proteinmaker;2:Thepelet afteriptginductionforh;3:thepeletafteriptginductionfor 2h;4:ThepeletafterIPTGinductionfor3h 2.3 gad 的纯化和鉴定超声裂菌后包涵体变性复性纯化步骤 :() 包涵体的洗涤 : 超声裂菌后的沉淀分别经 20mmol/LTris HCl(pH8.0),EDTAmmol/LEDTA,2mol/L 尿素 ;20 mmol/ltris HCl(pH 8.0),EDTA mmol/ledta, 8mol/L 尿素进行洗涤, 洗涤后的蛋白进行 5% SDS PAGE 电泳 ( 图 3a)(2) 包涵体的变性复性及纯化 : 洗涤后的包涵体用 mol/l 的 NaOH 使其彻底溶解变性, 然后用预冷的丙酮将其沉淀下来, 再将其溶解于 PBS 中, 完成复性和纯化, 进行 5% SDS PAGE 电泳 ( 图 3a) 复性纯化后的蛋白进行 5%SDS PAGE 电泳, 显示所纯化蛋白呈单一条带 ( 图 3b) 2.4 gad 的 Westernblot 分析纯化出的蛋白进行 Westernblot 分析, 实验结果显示 ( 图 4), 上述制备的人源性 gad 能与脂联素抗体特图 4 gad 的 SDS PAGE 和 Westernblot 鉴定 Fig.4 SDS PAGEandWesternblot analysisofpurifiedprotein 2.5 纯化 gad 的体外生物学活性检测大量动物实验证实,AMPK 是脂联素 ( 脂联素球状结构 ) 发挥调节代谢抗炎心肌保护等作用的关键分子, 因此 AMPK 的磷酸化水平被认为是反应脂联素 ( 脂联素球状结构 ) 生物活性的指标用纯化的 gad 孵育人脐静脉内皮细胞 5min, 采用 Westernblot 检测 P AMPK 的水平 [8] ( 图 5) 结果显示, 纯化出来的脂联素球状结构能够明显激活 AMPK 的磷酸化水平, 与标准品的生物学活性无明显差异 (P>0.05) 2.6 纯化 gad 的体内生物学活性检测动物实验已经证实, 脂联素 ( 脂联素球状结构 ) 可

203,33(6) 张立剑等 : 重组人源性脂联素球状结构的表达纯化与活性检测 7 促进细胞生存, 直接保护急性心肌损伤作用血浆脂联素水平不仅与缺血性心肌病的危险程度呈负相关, 而且与心肌缺血 / 再灌注损伤的严重程度呈负相关 [5] 用纯化的 gad 外源性治疗缺血 / 再灌注模型成功的小鼠,TTC 检测心脏的梗死面积, 超声检测心功能结果显示,

05,VSPBS 图 6 纯化 gad 的体内活性鉴定 Fig.6 Identificationofbiologicalactivityinvivo (a)myocardialinfarctsizeasesedbyevansblue/ttcdoublestaining.representativephotographsofheartsectionsareshown(top).

4 203,33(6) 张立剑等 : 重组人源性脂联素球状结构的表达纯化与活性检测 7 促进细胞生存, 直接保护急性心肌损伤作用血浆脂联素水平不仅与缺血性心肌病的危险程度呈负相关, 而且与心肌缺血 / 再灌注损伤的严重程度呈负相关 [5] 用纯化的 gad 外源性治疗缺血 / 再灌注模型成功的小鼠,TTC 检测心脏的梗死面积, 超声检测心功能结果显示, 纯化出来的脂联素球状结构能够明显减少心脏的梗死面积, 改善心功能, 与标准品的生物学活性无明显差异 (P>0.05)( 图 6) 图 5 纯化 gad 的体外活性鉴定 Fig.5 Identificationofbiologicalactivityinvitro,2:PBS;3,4:Standard;#:P<0.05,VSPBS; 5,6:PurifiedgAd; :P<0.05,VSPBS 图 6 纯化 gad 的体内活性鉴定 Fig.6 Identificationofbiologicalactivityinvivo (a)myocardialinfarctsizeasesedbyevansblue/ttcdoublestaining.representativephotographsofheartsectionsareshown(top).blue stained areasindicatenormalregions;red stainedareasindicateischemic/reperfusedbutviableregions;negativelystainedareasindicateischemic/ reperfusedandinfarctedregions.quantificationofinfarctsizewasexpresedastheratioofinfarctareatototalischemic/reperfusedarea(botom). (b)cardiacfunctionasesedbyechocardiography MI/R:Myocardialischemia/reperfusion;LVEF:Leftventricularejectionfraction; :P<0.05 vs.mi/r;#:p<0.05vs.mi/r;n=6to8hearts/group 3 讨论越来越多的临床数据和实验结果显示低脂联素血症是代谢综合征患者以及冠心病患者的一个独立危险因素 [9 ], 而给予外源性脂联素 ( 脂联素球状结构 ) 能够明显改善胰岛素抵抗和发挥心血管保护作用所以高效大量的脂联素 ( 脂联素球状结构 ) 的表达对于基础研究和临床应用都非常有使用价值人体正常血液中不仅存在全长型脂联素, 同时也存在脂联素球状结构 (gad); 脂联素球状结构在血液中的含量远远小于全长型脂联素, 但其改善高血糖高胰岛素血症, 增加脂肪酸氧化的能力要更强于全场型脂联素 [4] 所以我们选用活性更强用药剂量更少的 gad 作为大规模生产的目标目前脂联素球状结构的生产可在包括原核 ( 大肠杆菌 ) 真核 [2] ( 酵母 ) 以及哺乳动物细胞 [3] (HEK293 T 细胞 ) 等中进行真核 ( 酵母 ) 以及哺乳动物细胞 (HEK293 T 细胞 ) 表达的脂联素球状结构虽然具备完善的翻译后加工系统易使蛋白质形成正确的天然构型的优点, 但是缺点也很明显, 即步骤比较繁琐产量低成本高不稳定, 耗费时间长, 不适合大规模的生产和临床应用而以往采用大肠杆菌对脂联素球状结构进

5 72 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.6203 行的表达纯化, 主要采用的是对包涵体进行的变性复性和纯化 [3 5] 在复性纯化过程中, 往往采用高浓度变性剂 ( 盐酸胍尿素等 ) 进行变性, 然后采用稀释或透析复性, 复性后要运用各种层析柱进行纯化所纯化出的蛋白产量少, 变性复性所需试剂成本也很高, 并 [5] 且在纯化的过程中添加了 His 或者 GST 等融合蛋白的标签, 如果用于临床还要把这些标签用酶切掉, 否则可能对人体有害而本实验利用分子克隆技术构建了原核表达载体 pet 22b(+) gad, 测序结果显示 gad 片段插入位置片段大小正确蛋白表达后采用高浓度的尿素对包涵体进行洗涤, 使用强碱 (mol/lnaoh) 使包涵体溶解, 然后用预冷的丙酮使蛋白沉淀下来, 复溶后即完成复性复性后不需要运用层析柱进行分离纯化, 即得到高纯度的重组蛋白人源性 gad, 并且不带任何标签, 具有高生物学活性, 对人体安全可靠, 免疫源性小, 生物利用度高本研究获得的脂联素球状结构在大肠杆菌中获得高效表达, 并且变性复性纯化相对简单, 合成成本低 ; 同时又具有操作工艺程序化易于放大取材不受限制和活性高等优点, 为今后的大批量生产以及进行外源性 gad 的保护作用的深入研究打下了坚实的基础参考文献 []WeiGu,YangLi.Thetherapeuticpotentialoftheadiponectin pathway.biodrugs,202,26(): 8. [2] Siaso S, TousoulisD, Kolia C, etal. Adiponectin and cardiovascular disease: mechanisms and new therapeutic approaches.curentmedicinalchemistry,202,9, [3]BergA H,CombsTP,SchererPE,etal.Theadipocyte secretedproteinacrp30enhanceshepaticinsulinaction.nature Medicine,200,7: [4]YamauchiT,KamonJ,WakiH,etal.Thefat derivedhormone adiponectin reverses insulin resistance asociated with both lipoatrophyandobesity.naturemedicine,200,7: [5]LingT,ErheG,XiangYJ,etal.Adiponectincardioprotection aftermyocardialischemia/reperfusioninvolvesthereductionof oxidative/nitrativestres.circulation,2007,5: [6]SchererPE,WiliamsS,FoglianoM,etal.Anovelserumprotein similartoclqproducedexclusivelyinadipocytes.journalof BiologicalChemistry,995,270(45): [7] FruebisJ,TsaoTS,JavorschiS,etal.Proteolyticcleavage productof30 kdaadipocytecomplement relatedproteinincreases fatyacidoxidationinmuscleandcausesweightlosinmice. ProceedingsofTheNationalAcademyofSciencesofTheUnited StatesofAmerica,200,98(4): [8] YamauchiT, Kamon J, MinokoshiY, etal. Adiponectin stimulatesglucoseutilizationandfaty acidoxidationbyactivating AMP activatedproteinkinase.naturemedicine,2002,8(): [9]AritaY,KiharaS,OuchiN,etal.Paradoxicaldecreaseofan adipose specificprotein,adiponectin,inobesity.biochemical andbiophysicalresearchcommunications,999,257: [0]HotaKFunahashit,BodkinNL.Circulatingconcentrationsofthe adipocyteprotein adiponectin are decreased in paralelwith reduced insulin sensitivity during the progresion to type2 diabetesinrhesusmonkeys.diabetes,200,50: [] KadowakiT, YamauchiT, Kubota N.Adiponectin and adiponectinreceptorsininsulinresistance,diabetes,andthe metabolicsyndrome.journalofclinicalinvestigation,2006,6: [2]LiuDG,LiuHL,SongTJ,etal.Functionalexpresionofthe globular domain ofhuman adiponectin in Pichia pastoris. BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2007, 363: [3] 王云龙, 李永超, 昌静峰, 等. 人脂联素原核表达纯化及活性检测. 动物医学进展,20l,32(0): WangYL,LiYC,ChangJF,etal.Prokaryoticexpresionand purificationofhumanadiponetinanditsimmunologicalactivity detection.progresinveterinarymedicine,20,32(0): [4]HongFG,YuM X,BryanL,etal.Generationofnovellong acting globularadiponectin molecules. JournalofMolecular Biology,200,399:3 9. [5]HeikerJT,Kl tingn,blüherm,etal.accestogram scale amountsoffunctionalglobularadiponectinfrome.coliinclusion bodies by alkaline shock solubilization. Biochemical and BiophysicalResearchCommunications,200,398:32 37.

6 203,33(6) 张立剑等 : 重组人源性脂联素球状结构的表达纯化与活性检测 73 Expresion,PurificationofHumangAdinE.coli andidentificationofitsbiologicalactivity ZHANGLi jian SUNLu GUOYun ping LIDong dong WANGZeng lu 2 LIUYi ZHANGYing qi 2 TAOLing (DepartmentofCardiology,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi an 70032,China) (2BiotechnologyCenter,SchoolofPharmacy,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi an 70032,China) Abstract Objective:ToconstructtheprokaryoticexpresionvectorofhumangAdgeneandobtaintheno taggedrecombinanthumangadprotein.methods:totalrnawasextractedfromhumanadiposetisue.thegad cdnawasobtainedwithrt PCRtechniqueandsubclonedintoaprokaryoticexprsionvectorpET 22b(+)to generatepet 22b(+) gad.theexpresionofno taggedrecombinanthumangadproteinwasinducedbyiptg ine.colibl2(de3).thegadproteinproducedasinclusionbodiesatanelevatedlevel.theinclusionbodies weresolubilizedbyalkalineshock,andthenrefoldedandpurifiedafteracetoneprecipitation.sds PAGEand WesternblotwereusedforidentificationofthepurifiedgAd.TheabilitiesofgAdtoinducethephosphorylationof AMPKinHUVECsandtoprotectheartsaftermyocardialischemia/reperfusioninmicewereusedforitsbiological activityasay.results:thehumangadcodingsequencewascorectlyclonedintopet 22b(+)vector.After expresionandpurification,therecombinanthumangadsignificantlyinducedthephosphorylationofampkin HUVECsand protected heartsfrom myocardialischemia/reperfusion injury. Conclusion: The no tagged recombinanthumangadwassuccesfulyexpresedandpurifiedinprokaryoticexpresionsystem withhigh biologicalactivity. Keywords HumangAd Expresionandpurification Cardioprotection

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

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