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1 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期!" #$ %&%$ '!"! -= 甲型流感病毒 蛋白胞外域单克隆抗体的制备及其生物特性 刘亚辉沃恩康杨新燕徐琦杨灿邓冠聪郭潮潭 -- 杭州 浙江省医学科学院生物工程研究所通信作者 郭潮潭 +",$1+!+-$! %-<$ +)&&-= 论著 摘要 目的 制备甲型流感病毒高度保守的 蛋白胞外域 的单克隆抗体 应用于广谱检测甲型 流感病毒 方法 将编码鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的 (")* 基因与编码甲型流感病毒 的基因进行融合表 达 然后纯化蛋白 利用杂交瘤技术制备 鼠单克隆抗体 结果 成功表达并纯化了融合蛋白 ("+,"" - 制备的 株抗 的单克隆抗体 -.- 和 -. 抗体效价均为 均能与流感病毒株 /0 1& $1 结合 -.- 可以对 % 细胞中甲型流感病毒的 蛋白进行实时定位 结论 成功制备了 单克 隆抗体 初步具备了临床检测甲型流感的应用基础 关键词 流感病毒 型 蛋白胞外域 单克隆抗体 鞭毛蛋白 实时定位 基金项目 国家自然科学基金 国家卫生和计划生育委员会科研基金 浙江省科 技计划 ( 浙江省自然科学基金 2.(234 浙江省医药卫生科技计划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流感病毒依据核蛋白和基质蛋白的不可同分为甲 乙 * 丙 - 种不同型 其中甲型流感 >? 病毒流行最为广泛 造成的后果也最为严重 而依 据病毒颗粒表面血凝素 4 和神经氨酸酶 的不同 又可将甲型流感病毒分为 个 4 亚型和 个 亚型 >? 4 和 发生抗原漂移和抗原转

2 )+ 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期!" #$ %&%$ '!"! 换是甲型流感经常暴发的重要原因 病毒包膜上的另外一种膜蛋白 蛋白由于其保守性高 已成为 ()* 疫苗开发和药物研究的热点 而 蛋白胞外域 在人甲型流感中高度保守 与禽流感及猪流感仅有少数氨基酸不同 蛋白前 + 个氨基酸,--.. 在所有的甲型流感病毒中保守概率超过了 ++/ 这些为通用疫苗及其他研究提供理论基 (* 础 药物的早期使用对于治疗和控制流感的暴发 (* 具有重要作用 单克隆抗体由于其特异性与灵敏度较好经常被用于检测 因此 本研究将沙门菌鞭毛蛋白 0"1"" 和 进行融合表达 以此作为免疫原制备鼠单克隆抗体 以广谱 早期识别流感病毒 为药物的合理使用提供参考 报道如下 材料与方法一 材料和试剂流感病毒! $!+)2 3&+4 2) 3&$3+ 2) $3%56 细胞及, 细胞由本实验室保存 7-7$ 小鼠 杂交 0 小鼠购自浙江省医学科学院动物中心 多肽, %,,% 委托合肥国肽生物公司合成 75 蛋白定量试剂盒 抗 2& 标签鼠单克隆抗体 2 标记山羊抗鼠 9 抗体 0.5 标记山羊抗鼠 9 抗体 感受态细胞 (%27-%)* 购自康为世纪生物有限公司 其他试剂材料包括.7 显色液 碧云天 %,!"1'!. 纯化树脂预装柱 77.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳,%, 9 相关试剂购自康为世纪生物有限公司 二 目的基因合成及表达载体 质粒 的构建目的基因 0"1"") 由苏州金唯智生物科技有限公司合成 并构建于表达载体.1 相应位置 鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因为 971:;++) 三 蛋白表达及纯化鉴定表达时间优化 取重组表达质粒.10"1"" ) 转化 7-%) 感受态细胞 置于内含卡那霉素的 -7 培养液培养 )4 至 为 加入.9 终浓度!"- 继续摇荡诱导表达 分别于 3 取菌液 裂解后进行,%,9 分析 表达蛋白的纯化及鉴定 表达蛋白两端存在 2& 标签 按照 77 的说明书进行过镍柱纯化表达蛋白 按照 75 蛋白定量试剂盒的说明书测定纯化蛋白浓度 利用抗 2& 标签鼠单克隆抗体进行表达蛋白的 8& 印迹法鉴定 四 动物免疫及血清效价测定取 周龄雌性 7-7$ 小鼠共 只 其中免疫组 只 对照组 只 免疫组皮下注射纯化融合蛋白 只 对照组注射 7, 共免疫 次 间隔 周 其中第 次腹腔注射加强免疫 只 免疫 ) 次后第 天 免疫小鼠及对照小鼠尾静脉采血 分别以合成的 多肽和纯化表达蛋白作为包被抗原进行间接 -, 法检测血清抗体效价 取效价最高小鼠准备进行下一阶段杂交瘤制备工作 五 杂交瘤细胞制备及筛选杂交瘤制备参考文献 (4* 进行 六 单克隆抗体制备及纯化取杂交 0 小鼠 只 腹腔注射高压灭菌液体石蜡 - 只 一周后腹腔注射杂交瘤细胞 个 只 每只 - 至小鼠腹部明显膨大 处死小鼠 (* 收集腹水 冻存 参考传统辛酸 硫酸铵方法进行腹水纯化,%,9 电泳分析纯化情况 75 法测定纯化抗体浓度 间接 -, 法测单抗效价 以 多肽为包被抗原 七 单克隆抗体鉴定及对 蛋白的定位 %56 细胞生长至对数生长期 分别以血凝滴度为 2 的流感病毒株 3&$3 感染 %56 细胞 3 后收集细胞并裂解 以纯化单克隆抗体作为一抗进行 8& 印迹实验 以 2 流感病毒感染对数生长期 %56 细胞 感染后 ) 3 每隔 小时分别甲醇固定细胞 7, 清洗后纯化单克隆抗体 )9) 稀释 倍 )4 孵育 37, 清洗后 0.5 标记山羊抗鼠 9 抗体 稀释 )4 孵育 % 稀释至 - 染核 7, 清洗后荧光显微镜下观察并拍照

3 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期!" #$ %&%$ '!"! +7/ 结 果 子质量为 / 处出现了单一的特异性条带 因此纯化的蛋白即为设计的融合蛋白 )"(*""+, 一 ()"(*""+, 表达载体的构建如图 - 所示 为了尽可能提高, 的蛋白量 采用 + 个, 序列串联形成 +, 同时为了提高小多肽段, 的抗原性 在 +, 前加接一个鞭毛蛋白基因 基因 合成出 )"(*""+, 的 %- 片段 目的基因 )"(*""+, 被构建于表达载体 ( 相应位置 经内切酶鉴定 图. 和基因测序确定序列正确 三 单克隆抗体制备和纯化结果小鼠免疫后尾静脉采血 以, 为包被抗原 免疫小鼠血清效价如图 + - 所示 取效价最高的 + 号免疫小鼠进行下一步的细胞融合工作 分别以合成的, 多肽和纯化表达蛋白作为包被抗原进行间接 - 法检测血清抗体效价 如图 +. 所示 + 号免疫小鼠针对, 多肽的血清效价为 而针对融合蛋白 )"(*""+, 的血清效价达到 ( )"(*""+, )"(*"",,, 4 柔性肽 - 了 取 + 号免疫小鼠脾脏进行杂交瘤制备 经过 + 轮亚克隆及筛选后获得 株单克隆抗体 分别命名为 ++ 和 + 如图 - 所示 腹水单抗经纯化后纯度得到了很大的提升 ++ 和 + 浓度分别为 * * 如图. 所示 两株单克隆抗体纯化后的效价均为 ' / % 全质粒 双酶切 %. ' / 四 抗, 单克隆抗体的生物特性 结合流感病毒蛋白流感病毒, 蛋白为 如图 所示 株纯化单克隆抗体 ++ 和 + 能与融合蛋白及不同亚型的流感病毒株 23, 0& -$0 感染后的,%45 细胞裂解液结合 但不与未感染,%45 细胞裂解液结合 说明 株单克隆抗体检测流感病毒的特异性 也说明不同流感亚型对于 注 - 目的基因构建示意图. 质粒酶切鉴定核酸电泳,, 蛋白胞外域 )"(*"" 鞭毛蛋白图 目的基因 )"(*""+, 构建及鉴定 单克隆抗体检测没有限制性 株抗体初步具备广谱检测性 二 目的蛋白的表达和鉴定目的蛋白 )"(*""+, 理论大 标记物 诱导时间 0 未诱导 小为 / 如图 所示 与未诱导菌体相比 在为 / 处诱导菌体都出现了浓厚的条带 与预测相符 初步表明诱导菌体表达了融合蛋白 而且随着诱导时间的增加 目的蛋白量也随 + / + 之增加 但诱导 0 后蛋白量无明显改变 因此以诱 导 0 作为最佳诱导时间 取诱导后菌体超声破碎 离心 并取上清过镍柱纯化 浓缩后测得目的蛋白 浓度为 + *1 & 印迹法鉴定 在相对分 图 目的蛋白 )"(*""6+, 表达

4 国际流行病学传染病学杂志!"#$ 年 #! 月第 %& 卷第 ' 期 ()*+, -./ ()5+6* 708! ,!:;$!<34=%&!>3=' ;S' 未感染 目的蛋白 ;S% ;S!!%&" ;S" "S$ "S' "S% "S! " % & 血清稀释倍数%!V"#$%& E!S&!%&:!S: E 对照 ;S& %";"@& 对照 未感染 目的蛋白 ;S: :S& : % & ' N $ L ;: ;; 血清稀释倍数%!V&'$%& F 注# E小鼠血清效价 %?!+ &$ F小鼠不同包被抗原血清效价$?!+ #?! 蛋白胞外域 图 %";"@&?Q,R+, 未纯化 纯化 未纯化 纯化 ;$" ;@" ;"" N" && %" F 注 # E@A@ $ F@A% $GH$ # 流 感 病 毒 株 EIGJ+,*3 H063K$K#L@% %M#># &$?+2/D08 # 流 感 病 毒 株 EK?+2/D08K#K#LN; %M@>! &$E06D0 # 流感病毒株 EKE06D0K!K;L'$ %M@>! & 纯化单克隆抗体%@A@ '@A% &O+8*+,) 印迹法鉴定!=检测流感病毒在细胞内表达?! 蛋白 图 ' 可见! 可用于?! 蛋白的 ;& ;" 定位!病毒感染?7BC 细胞 $ D 后!细胞核周围出现 E 少量?! #=& 对照 #=: 膜出现大量?! 蛋白!此时开始了病毒的出芽!与此 同时下一轮的感染过程也在进行中!@! D 后细胞病!"S'NL :=& : 白逐渐增多! 并从核周向细胞膜转移!!" D 后细胞 变严重!细胞萎缩并聚集成团!剩余病毒分布于细胞 "S%"; "S"N% % 膜表面" & ' N 纯化单抗稀释倍数 T;:;U"& F $ L 注 # E纯 化 单 抗 %@A@ '@A% &P7P!GEA. $ F纯 化 单 抗 效 价 $P7P! GEA. #聚丙烯酰胺凝胶电泳 图# 单克隆抗体%@A@ '@A% &纯化及鉴定 讨 论 甲 型 流 感 病 毒?! 蛋 白 尤 其?!+ 的 高 度 保 守 性! 为研究具有广谱检测作用的单克隆抗体提供基

5 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期!" #$ %&%$ '!"! -- ( % 合并 注 ( 采用 /* 标记山羊抗鼠 ( 抗体染色 % 采用 % 染色法染色 图 单克隆抗体 ( 对 )%*+ 细胞内流感病毒 ) 蛋白的定位 倍 础 但 ) 仅由 个氨基酸构成 其免疫原性弱,-. 不能诱导足够的免疫反应 目前常用的方法是将,. 免疫原性弱的蛋白与其他蛋白结合形成融合蛋白 配以合适的佐剂 以增加其免疫原性 鼠伤寒沙门杆菌鞭毛蛋白作为 /!"" 样受体 /01 的配体 能够刺激 %* 和其他 * 进而诱发一系列的免疫,. 应答 因此可以将鞭毛蛋白与 ) 进行融合 发挥鞭毛蛋白的 佐剂 作用 能增加 ) 被捕获的机会 以增强 ) 的免疫原性 目前 ) 蛋白的抗病毒研究主要集中于 通用

6 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期!" #$ %&%$ '!"! 疫苗 () ) ) 及耐药毒株的药物开发 王云龙等制备了 * 型流感病毒 + 单克隆抗体 但并未进行病毒 ) 的结合实验 而孙新城等制备了 ( 株针对甲型流感, - 流感病毒 + 单克隆抗体 建立的双抗体夹心./* 方法检测灵敏度达到了 但其广谱检测性需进一步研究 本研究成功获得了 株抗 + 单克隆抗体 (( 和 ( 均能和不同亚型流感病毒 + &*$+ 蛋白结合 说明其广谱检测性 具备临床应用的基础 但仍需更多不同亚型流感病毒 + 蛋白来进行更广泛地验证 同时需要建立快速检测流感病毒的方法 并评价其灵敏度与特异性 以适应临床诊断的需要 而间接免疫荧光的结果清晰显示了流感病毒感染过程中 + 蛋白整个运动进程 这对于 + 蛋白相关功能和机制研究具有重要意义 参考文献 ) /! 23 4 $ 4!# 00, 4,5 464 #"74 6&&) && - %8 ((-96- ) :;.!&. 2 0& % /4 %* "4; '!& $! 4 #"74 6& 400" 4 4 4&) +!" /$ 5 5 %8 ((-9 &5 ()!" * /$& : & 4"3 +'4& #"74 64$$& $ 464$& 4 $"$4"!4")3 6 4$$& 5 ((3 % ) +!!; /!! " +! $4"!4! &0 40 #! 4#"74 0 &$!6; ) (3 ). < +2. < 4"3 +$4& &!# $!&&!$! '; #"74 6& +'4& 64$$&)3 (3 % (3 ),&&4 + 4"6,%,4 < 4"3 %0 &&4$ #"74 * 6&!"!0; )3 #$ %0 && 5 (3 %8 359%3/5(3 5) 杨辉 吴小鹏 王海龙 等 3 * 型流感病毒 / 蛋白单克隆抗体的制备及其亚细胞定位分析 )3 中国兽医科学 -(-3 %8 393&&35(-333(3 <40, = 40,. 4"3 44!!#!!$"!4" 4'!& 404& /!!# #"74 * 6& 4 44";&&!# & &'$"""4 "!$4"74!)3 2 4; /$ -(-3 %8 393&&35(-333(3 ) +$; ++ 4>&! *3 * & "!$! 4!04$!$! #;!0"!'"& #! & 4 4&$& #" )3!" +!& ),40, <4 =< 4"3 244$74!!# ; $ '; +!# #"74 6& )3 4$$ 5 5(3 % $$ ) /!>!, 44 4 : 4 * 4"3 4$$4! 4 4&!# + 4$"""4! 4 #&!.& 44 4!,/5!$& $ 404& #"74 * 6& $4""0 )3 & & 3 % &&333(3 ) 46!";4!6 < +44!64 / 4"3 "4!$ $! '4 #"74 64$$ '4&! 6&">,:$ 4$"& $4;0 4 4$"""4! 4!# +! )3 :!$ &; +!&$55 ((3 %8 3(9/-5-=3 ) +44!64 /!";4!6 < 4!6 4"3 4 0 ;" &&!!# 4 $44 #"74 64$$ '4&! $!! 4!# +! ">! #"40"" "4& &0 64" 6$!&)3 :+2 :!$!" 3 %8 39 &-3 () +2. < < 4"3!0$; 4 ##$4$;!# "$4!$! $! '4 #"74 6& $4;0 " $ + 4$"""4! 4& 4 $ $ 400" $!04)3 *64" & 5 (3 % "35333 ) $!0&& &00 '!& &&4 +!! $4"& #! #"74 * 6&&)3 :!!"; & -(-3 %8 39 '3(3 ) 王云龙 路晓娅 李智涛 等 3 * 型流感病毒 + 单克隆抗体的研制及鉴定 )3 实用预防医学 - ( 3 %8 3(--93&&3(3-3( <.. =<.? 4"3 44! 4 $44$74!!#!!$"!4" 4'!& $!070 /..// %//%!!# #"74 * 6& +!)3 4$ ( 3 %8 3(--93&&3(3-3(3-3 ) 孙新城 王云龙 李玉林 等 3 甲型流感,- 流感病毒 + 单克隆抗体的制备及双抗体夹心./* 检测方法的建立 )3 中国病原生物学杂志 3%8 3((93$'353 / =2 40 <.. <. 4"3 44!!#!!$"!4" 4'!& 4 &4'"& 4 6"!!#!&! $ +!# #"74 *, #"74 6&-)3!4"!# 4!0 :!"!0; 3 %8 3((93 $'353 收稿日期

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