武楠 等 小鼠脾内免疫法制备重组弓形虫 抗原单克隆抗体 弓形虫呈全球性分布 专性寄生于有核细胞 引起人兽共患的弓形虫病 通常弓形虫感染者多无症状 但孕妇感染会造成流产 畸胎以及多种出生缺 陷 弓形虫病对免疫低下人群如骨髓移植 心脏移植 获得性免疫缺陷综合征 8 4"4! 16 患者常有致命威胁 美国

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1 复旦学报 医学版 小鼠脾内免疫法制备重组弓形虫,$5) 抗原单克隆抗体 武 楠 周丹秋 阮 卫 吴丽桂 张慧涨 复旦大学附属金山医院检验科 上海 浙江省疾病预防与控制中心 杭州 摘要 目的 制备小鼠抗重组弓形虫 抗原单克隆抗体 用于早期弓形虫感染的抗原检测 方法 用弓形虫 /- 株重组抗原 进行常规免疫结合小鼠脾内免疫 杂交瘤技术制备单克隆抗体 ' 1 法筛选阳性克隆 经亚克隆建株 诱生腹水法制备抗体 #!% 亲合层析法进行纯化 测定其亚类 效价 + "%!% 法分析其特异性 夹心 ' 1 法检测抗体的敏感性及特异性 检测弓形虫感染小鼠血液循环抗原 同时用 ) / 法检测弓形虫 基因并比较结果 结果 获得 株抗重组弓形虫 抗原单克隆抗体 抗体均为 1$ 轻链均为 链 + "%!% 显示 株单抗均能识别弓形虫天然的和重组的 抗原 敏感度分别为 $ 和 $ 与血吸虫病 钩虫病及疟疾患者血清均无交叉反应 弓形虫早期感染检测 ) / 及 ' 1 法阳性检出率分别为 0 0 结论 成功制备小鼠抗重组弓形虫 抗原单克隆抗体 初步用于早期弓形虫感染诊断 关键词 重组 抗原 脾内免疫 单克隆抗体 夹心 ' 1 小鼠 中图分类号 / / 文献标志码 * 3 *,$5)! * " & %$#$ ' "** / + + $ 2- -&$ +' #$! #"# $$$ ## *$!-$ "*$ $ $ % & *!##!!! %!4 "!"%!!#' 1 %&!! $!""! ) ( #%! $%& % "%$ ' *& 3 4!$!% % "#%! 3%&!% %$ 4 #&! 4% &4 %!%&8 3"##%!##%& % " )!"%! " 3 " "$' 1"! %! "%"& "" % "3"%!#!%& " *& %& " 3 #4#!% &! %!$ #&! *& "#%4! " 3" % 4 + "%!% "3 & ' 1 "%%4! %& " 3" %"$"3 & ' 1! # "!3"!%%3) /"3 & ' 1 %&! *3!#!"%! "3! % "!%&!% 4 %& %!% %$ " *& " "%%4! 3" $$ "#%4 *& 3"!!"" %!%3%& "#!"% "! #% %"3%& " &"%!"! "" 4!"%! ""!4"$) /' 1%& #!"%%! %! )4 3"0 0 "#%4 *&!!" % %$ "& ##" ""4 #4##%! 4"%$ $!""! )4%! "% "#%!!!! %!4"3 & ' 1! "#!$%&! '4&!!!

2 武楠 等 小鼠脾内免疫法制备重组弓形虫 抗原单克隆抗体 弓形虫呈全球性分布 专性寄生于有核细胞 引起人兽共患的弓形虫病 通常弓形虫感染者多无症状 但孕妇感染会造成流产 畸胎以及多种出生缺 陷 弓形虫病对免疫低下人群如骨髓移植 心脏移植 获得性免疫缺陷综合征 8 4"4! 16 患者常有致命威胁 美国每年 16 患者感染弓形虫脑炎的有 人左右 而在欧洲 -1( 病毒感染人群中有 0 患弓形 虫脑病 目前国内对弓形虫病的诊断主要是血清学诊断 抗体诊断中 1$ 抗体可在血清中存活 个月 1$ 抗体在正常感染人群中甚至可以终身存在 因此抗体的诊断难以区分既往和近期感染 此外 对于抗体反应受到抑制或者免疫抑制剂的使用者 抗体检测不能很及时地反应感染情况 所以早期抗原诊断对弓形虫感染的防治极为重要 弓形虫感染后其可溶性抗原存在于组织和血液中 可用于早期抗原诊断及监测 弓形虫 /- 株主要表面抗原 是众多弓形虫抗原中一个重要的膜表面抗原 为弓形虫速殖子期特异性蛋白 占虫体总量的 00 能被弓形虫感染期或恢复期血清抗体所识别 因此 抗原在弓形虫感染诊断中具有重要意义 我们运用小鼠脾内注射免疫法制备了重组弓形虫 抗原单克隆抗体 希望能用于弓形虫感染早期诊断 材料和方法 细胞 虫株 重组抗原及抗体 骨髓瘤细胞 中国科学院上海细胞生物研究所 弓形虫 /- 株 重组 抗原 弓形虫病 血吸虫病 钩虫病及疟疾患者阳性血清 浙江省疾病预防与控制中心 兔抗弓形虫多抗自制 动物 只 小鼠和 只昆明鼠 中国科学院上海实验动物中心 试剂 6 '! 公司 胎牛血清 杭州四季青公司 福氏完全佐剂 - *-* 及 ) "% $ 公司 抗体分型试剂盒 /! & 公司 -/) 标记 1$ 鼎国生物技术有限公司 + "%!% 法检测试剂盒 #! 公司 仪器 酶标仪 *&!"4"%" 公司 抗 3,$5) 杂交瘤细胞株的建立 小鼠免疫 取 只 周龄雌性 小鼠 每只用重组抗原 $ $ 体重 加福氏完全佐剂 腹腔免疫 次 周后 0 戊巴比妥钠 $ 腹腔麻醉 打开腹腔并暴露脾脏 把弓形虫 /- 株重组抗原 $ 溶于 ) 中 以弯头镊轻轻提起脾脏边缘系膜 用胰岛素注射器分 点注入脾脏 每次注射后停滞 " 以防回流 放回脾脏并分层缝合 细胞融合 免疫后 将小鼠眼眶放血处死 取脾 制备脾细胞悬液 并与 ) 按 的比例进行融合 融合后第 周用 - * 选择培养基培养 第 周换 -* 培养 周后用含 0 小牛血清的 6 ' 培养 杂交瘤细胞株的筛选和亚克隆 融合后 用间接 ' 1 检测杂交瘤细胞培养上清筛选阳性克隆 以重组 蛋白包板 $ 每孔 取培养上清 常规 ' 1 检测 有限稀释法进行亚克隆 用培养液将细胞悬液稀释成每毫升分别含 和 个细胞的悬液 加入 孔培养板中 每孔 使相应每孔分别含有 和 个细胞 选择效价高 呈单个细胞克隆生长的细胞孔 然后扩大培养 分批冻存 抗 3,$5) ' $ 的制备 腹水抗体制备 小鼠腹腔注射 ) "% 只 周后腹腔注射 个杂交瘤细胞 只 后处死小鼠取腹水 离心 去除脂质和细胞沉淀 上清用 滤膜除菌 : 保存 单克隆抗体的纯化 腹水解冻 离心 去油状物及沉淀 #!% 亲和层析法纯化 用! )#- 平衡 #!% 柱 待纯化的腹水用平衡 ) 稀释 倍 上样! ) 缓冲液充分洗柱 到基线后再平衡 个柱体积 然后用! 甘氨酸 #- 缓冲液洗脱 用! * " - #- 缓冲液中和至 #- ) 透析 && 更新一次透析液 蛋白定量 稀释后按 $ 分装 于 : 保存 抗 3,$5) ' $ 杂交瘤建株 经 次融合后 细胞于 块 孔培养板上培养 细胞融合率为 0 经 次克隆化培养 得到稳定分泌抗重组 单抗两株 命名为 抗 3,$5) ' $ 的鉴定 的 6 )' 分析 纯化后的抗体加等体积的上样缓冲液 腹水稀释 倍后 进行 6)' 分析 的效价测定 以重组 包被 $ 每孔 间接 ' 1 法测定培养上清 腹水和纯化后的抗体效价 杂交瘤细胞株染色体分析 于传代培养 & 的杂交瘤细胞中加入秋水仙胺至终浓度为 $ 离心 去上清 细胞沉淀加入 : 预温的! 溶液 用甲醇 冰乙酸 混合液固定 次 制片 干燥后 " 染色 光镜下计数 个细胞的染色体数 的类别鉴定 按试剂盒操作说明进

3 复旦学报 医学版 年 月 行 的 + "%!% 分析 重组 裂解弓形虫速殖体经 6)' 电泳后以 恒流转膜 & 一抗为纯化 以 稀释 以 稀释 二抗羊抗鼠 -/) 标记 1$ 以 稀释 其他步骤按常规操作 相对亲和力测定 即取抗原 $ 包被 板 每孔 依次加入系列稀释的已知浓度的 间接 ' 1 法测定 值 以被检的不同浓度为横坐标 以其相应的 值为纵坐标 绘制曲线 以各曲线上部趋于平坦段的值为 00 值处相对应的 浓度 即抗体的 相对亲和力 的敏感性检测 以兔抗弓形虫多抗包被 孔板 $ 每孔 分别以 作为检测抗体 建立夹心 ' 1 法 检测重组抗原 抗原倍比稀释 起始浓度为 $ 常规 ' 1 操作 样本与阴性对照比值 判定为阳性 不同时间检测 次 取均值 作抗原浓度与 值曲线 的特异性检测 建立夹心 ' 1 法 检测确诊血吸虫病 钩虫病及疟疾患者血清 用 ) 稀释血清样本 每孔 设置重组抗原对照 阳性血清对照 阴性对照 检测方法同上 法和夹心 +4,$ 法对样本的检测 弓形虫急性感染小鼠模型的建立 /- 株弓形虫速殖子 感染昆明鼠后 后取血 提取有核细胞 6 按试剂盒操作进行 并保留血浆 夹心 ' 1 法的建立及检测血液样本 以兔抗弓形虫多抗包被 孔板 $ 每孔 用辣根过氧化物酶标记的 为一抗建立夹心 ' 1 法 常规 ' 1 操作 ) / 法检测弓形虫 基 因 参照文献设计引物如下 引物 ; * * ** *; 引物 ; * *** ** ** ;) / 反应条件为预变性 : 变性 : : : " 个循环 延伸 : 检测血有核细胞 6 阳性对照为弓形虫速殖子 结 果 杂交瘤细胞染色体分析 倒置荧光显微镜下计数 个中期分裂相 细胞的染色体数平均在 条以上 符合杂交瘤细胞的特征 小鼠脾细胞 ) 细胞为 图 抗 3,$5) 腹水抗体纯化及单克隆抗体,7,3 $5 分析 小鼠腹水抗体形成率在 0 以上 腹水收获量平均为 只 经透析后定量分装 $6)' 电泳鉴定 成像扫描系统扫描 纯度为 0 非还原电泳在约 处有单一条带 还原电泳显示两条带 重链相对分子质量约为 轻链约为 图 图 ) 小鼠 3,$5) ' $ 杂交瘤细胞染色体分析 ; 88!)** "3,$5) ' $ "**; 88 图 # 3,$5) ' $ 的,7,3 $5 分析!#,7,3 $5"3,$5) ' $ )!% 5! % " 抗 3,$5) ' $ 的类别鉴定 抗体均为 1$ 轻链均为 链 抗 3,$5) ' $ 的效价 间接 '1 法检测效价 表 表 ) 间接 4+,$ 法检测抗体效价 ( )(* * 3,$5) ' $" +4,$! %"#%% % " ) 3,$5) ' $ 的 - 分析 + "%!% 结果显示 均能识别相对分子质量 大小的天然抗原和重组抗原 图 ' $ 相对亲和力测定 相对亲和力分别为 和 图 ' $ 的敏感性和特异性检测 夹心 ' 1 法检测的灵敏度分别是 $ 和 $ 即 $ 和 $ 图 经检测 两株抗体与血吸虫病 钩虫病及疟疾患

4 武楠 等 小鼠脾内免疫法制备重组弓形虫 抗原单克隆抗体 者血清均无交叉反应 讨 论 图 3,$5) ' $ 的 - 分析! -"3,$5) ' $ % % 4"#%4 % % 4 "#%4 图 3,5$) ' $ 的相对亲和力测定! 7 * "3,$5) ' $ 图 3,5$) ' $ 的敏感性测定! 7 * 3,$5) ' $ 夹心 +4,$ 法的建立及检测血液样本 夹心 ' 1 法及 ) / 法用于早期弓形虫感染检测的比较 图 表 ) / 扩增 基因目的片段为 # 图 法检测早期弓形虫感! (! &'! 表 # 夹心 +4,$ 法及 法检测早期弓形虫感染的结果比较 ( # * " 3+4,$ %&! )!"% " )!"%% ) / 0 3 & ' 1 0 弓形虫分布广泛 估计全世界 的人被感染 因此早期诊断有利于弓形虫病的预防和治疗 常用的实验诊断方法有病原学诊断 血清学诊断和核酸诊断 弓形虫病原体的检测是最可靠的方法 不过这种方法费时 昂贵 敏感性差 1$ 抗体亲和力的 检测单独难以区分急性感染和过往感染 ) / 方法常以 基因和 基因为靶基因 具有灵敏 性和特异性好的特点 感染后 & 以后即可检出 但是不适合于弓形虫感染的动态观察以及大规模的筛查 弓形虫进入机体 均经局部淋巴结或直接进入血液循环而造成虫血症 然后播散至其他组织器官 弓形虫循环抗原是弓形虫在宿主体内增殖过程中的代谢和裂解产物 出现于体液和血清中 $ 是病原体存在的重要标志 目前血清学诊断主要是抗体诊断结合早期感染的抗原诊断 能及时有效反应弓形虫感染情况 对弓形虫感染的数量和活力进行较为精确的评估 尤其对免疫缺陷或低下患者的诊疗有重要意义 因此我们制备了抗 抗原的 实验中采用了小鼠脾内免疫法联合常规免疫 仅用传统免疫方案 的时间 此外本方法所需抗原少 抗原可直接接触免疫细胞 使致敏的细胞增多并明显提高融合率 而且免疫效果好 获得了亚类为 1$ 的抗体 经 次融合 融合率为 0 亚克隆后获得稳定两株分泌抗重组 单抗细胞株 制备的抗体特异性好 均能识别天然和重组的 抗原 并具较好的亲和力 为弓形虫感染早期诊断奠定了基础 基于 ' 1 方法的循环抗原或者抗原的检测 一直是研究者常用的方法 年 & 等用多抗 多抗夹心 ' 1 检测了弓形虫感染兔血样本 份学血清 份脑脊液 此法能检出浓度为 $ 的 $ 在兔感染样本中结果显示感染后 能够检出 $ 水平最高 随后下降 后仍能检出 显示了循环抗原检测的实用价值 本实验中小鼠急性感染模型与相关文献吻合 $ 即可在血清中检出 我们尝试了多抗 单抗的模式 即用兔源多抗来结合 $ 用标记的抗 单抗进行检测的夹心 ' 1 法 并与 ) / 方法做了初步比较 检测率分别为 0 和 0 虽然检测中敏感度没有 ) / 方法高 仍然说明此法具有较好的诊断价值 结合以往学者的研

5 复旦学报 医学版 年 月 究结果 如果使用 $ 中多个抗原的单抗组合用于检测会取得更好的结果 参 考 文 献 * %-5!%& /+ "" ) ( #! " %! & " # -##" & -" - -1( ""! % %!,!# "!""3%!"#%4""!#% %" 0 - $ % &!%69!."%"! %& % %4!"%% "! %!! %$%!4! #, " 4 45!"! % ""4 "&$# -! )/ -# "!! ) / #% ' 1!!%$!%%!! ) ( # %& & '!%!4 - - /$%! ' %!! %&!$! %4 % "%! $!""! %!,!# " 4 #&!#%&4& ' " (6 /! $6 %%!! %$%$ "%& $!""!% %!,!# "!"" ) &! - * & $ // - 6 %%!! %$%$ "! ) ( # &%! ) &! & /! 6 ' %!!# ' 1 %&8!%%!! %$%$ "! ) ( # & ' " 收稿日期 编辑 王蔚 上接第 ). 页 李笑天 乐小妮 何晓明 等 出生缺陷产前诊断的临床模式研究 中华小儿外科杂志 )!" 7 " / 6$!""! %! % " *&35""!!1. % %! 严英榴 杨秀雄 沈理 产前超声诊断学 北京 人民卫生出版社 4 $6!% ( ' "%3"" 1"! % "!!$ #& 5"!%%!! % 6!3"4! %& "!% "%! #$ 4 # " &! 4 ' &## *6 *& $% "!!$%&!!"5"" ""%! 6!3"4! %& "!% "% # " & 1" - 6! / " %"! "4"%% "$!!$ "! %#" %%! "% #!# %!'#.!% 4- &" * % %!*& "$! % &!$!3'#. "!! &'%!!$4!%!! % &!$!3 * 4"!,# )$ %& &$! 6 *& "!% "% $% "!!$ &. &.!! *!%&25 '%!!$4#% $!"% "!%!!%!$ 4 " " )$ &!$ 2!$ 4!% "% &!!#," 4"%" % "! 4. '# /4' %& # %!! % &!$%! " % $% $ % % "% % "!, %!%!"#%3,& $' $ 收稿日期 编辑 张秀峰

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