期王亚楠等半滑舌鳎生长因子 &!(" 的定点改造及原核表达 ""! 入手研究其基因是否存在同样的特殊功能活性对于进一步研究基因具有重要意义本实验室从已经构建的半滑舌鳎 # 文库中筛选获得了 # 全长发现其仅在成鱼的脑中表达并参与胚胎的脑部发育过程为进一步研究半滑舌鳎基因的功能

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连愿史
7 years ago
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1 第卷第期! 年月 " 水 " 产 " 学 " 报!"! 文章编号! # $!%! # # #! $ %!!! &$& 半滑舌鳎生长因子的定点改造及原核表达王亚楠! " 刘旭东! " 穆琳琳! " 刘志鹏! " 李春梅! " 于海洋!! " 张全启! 中国海洋大学海洋生命学院海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室山东青岛 "$$ 青岛市海洋与渔业局山东青岛 "$$! 国家海洋局北海环境监测中心山东青岛 "$$ 摘要为进一步研究半滑舌鳎 &!(" 成熟肽活性与功能对半滑舌鳎生长因子成熟肽进行定点改造及原核表达根据大肠杆菌偏爱密码子的特点实验利用 * % 法对半滑舌鳎成熟肽进行定点突变将改造后的半滑舌鳎成熟肽克隆到载体质粒! 构建原核表达载体! & 并转化至大肠杆菌!# ) 菌株中 # & %, 结果显示与对照组相比经 %, 诱导表达后半滑舌鳎重组蛋白存在于大肠杆菌上清液中产物相对分子质量约为研究表明本实验对半滑舌鳎生长因子 &!(" 成功进行了定点改造原核表达质粒成功构建并在大肠杆菌中高效表达且主要以可溶形式存在关键词半滑舌鳎 &!(" 原核表达融合蛋白中图分类号.! &! """""""" 文献标志码! ""&!(" 是!& 年由!!) 等首先发现的一种新基因是一类新的肝素结合性生长因子与多效营养因子 / " 1 *% 基因结构和氨基酸组成非常类似二者同属于 */ 家族在小鼠和人中在胚胎发育时期广泛表达出生后表达降低而成体组织中仅在肾脏和多种癌细胞中高表达如肿瘤乳腺癌肝癌结肠癌! 胰腺癌等 # 然而在斑马鱼 " 和虹鳟 /" " & ( 中存在两种! 和不同于哺乳动物在胚胎发育早期的广泛表达斑马鱼! 和的表达具有空间特异性二者在胚胎发育时期和成鱼大脑中表达分布均不同显示出哺乳动物与鱼类的在功能上可能存在着差异近年来的研究结果表明具有多种生物学功能它能促进正常细胞生长和分化尤其是神经细胞的发育它可以延长中心神经元的生存期并促进轴突的外生等 & 另外参与肿瘤细胞的增殖存活及转移过程的反义寡脱氧核糖核酸能有效地抑制小鼠结肠癌细胞的生! 长在癌细胞中阻断其受体也可以限制肿瘤的生长和转移这些研究反向证实了具有肿瘤生长因子作用近年来已经成为恶性肿瘤在内的多种疾病治疗中颇具前景的分子靶点可用于恶性肿瘤的临床诊断治疗评价以及抗肿瘤新药的开发基于它的应用前景的蛋白表达及临床研究也因此成为国内外学者关注的焦点!! 之一 #! 鱼类中斑马鱼虹鳟异育银鲫等多个物种的已被克隆并进行了初步的功能研究在斑马鱼胚胎发育过程中! 在体节和神经管中部区域高表达影响体节形成和基板细胞分化而则表达于神经管背! 部区域促进神经嵴细胞生长 #!% 异育银鲫中! 蛋白在胚胎早期广泛分布! 体节时定位于一对巨大的神经元上并且注射过量的! 可导致异育银鲫脑部发育不全这些结果表明鱼类中具有不同于哺乳动物的多种功能和活性!$ 迄今为止鲆鲽鱼类中未见相关的基因克隆和蛋白功能研究因此如能从鲆鲽鱼类收稿日期!&& """ 修回日期!&!& 资助项目国家 * 八六三 + 高技术研究发展计划!!!!! 通信作者张全启 &! 51!*/ *

2 期王亚楠等半滑舌鳎生长因子 &!(" 的定点改造及原核表达 ""! 入手研究其基因是否存在同样的特殊功能活性对于进一步研究基因具有重要意义本实验室从已经构建的半滑舌鳎 # 文库中筛选获得了 # 全长发现其仅在成鱼的脑中表达并参与胚胎的脑部发育过程为进一步研究半滑舌鳎基因的功能必须获得具有生物学活性的蛋白因此本研究通过 * % 方法改造基因构建原核表达载体! & 并通过诱导表达成功获得可溶性重组蛋白为研究其生物学功能奠定了良好的实验基础!" 材料与方法材料与试剂大肠杆菌 # %!# ) 原核表达载体! 均系本实验室收藏 %( # 聚合酶 # 连接酶限制性内切酶及均购自 /" /*!) 公司异丙 &#& 硫代半乳糖苷 %, 购自 %" /! 公司琼脂粉购自上海生工质粒抽提与 # 凝胶回收试剂盒购自天根公司肽分子量标准蛋白购自北京康为世纪生物科技有限公司其余常用试剂均为国产分析纯表定点改造所用扩增引物 %#& )-. #-+().) #/)!.-,).),. #*-!/ 引物名称 /"*! / 序列 % & " /")/5 /* / &! &! & & & &,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 实验方法引物序列的设计 "" 根据本实验室已获得的基因全长,/*!* 登录号.$!& 利用 *!% )/"6/" 对其进行信号肽预测选用大肠杆菌偏爱的密码子利用 #!" %" /" %"/ /"% 等软件设计合成 $ 个基因片段表! 桑尼公司用于扩增改造后的成熟肽编码序列其中 &! 与 & & 与 & 分别有!& 和!$ 的互补序列符合重叠延伸 % /*/ * /*/) * 6/"! / /*) * 要求基因的 * % 合成 " " 运用 * % 法合成成熟肽序列所有 % 反应均以高保真酶反应体系进行第一轮 % 反应条件以 # 全长质粒为模板分别以 &! 与 &! & 与 & 两对引物扩增基因片段反应条件为 & 变性 % *& )$ ) ) 每循环降低! 循环! 次 & )% ) ) 循环次延伸 % * 目的片段琼脂糖检测并切胶回收后分别命名为! 第二轮 % 反应条件以等量的! 和合成的为模板以引物 &! 与 & 扩增基因片段反应条件为 & 变性 % *& )$% ) ) 循环次延伸 % * 取上述 % 产物! 做模板再次进行 % 反应条件为 & 变性 % *& ) $% ) ) 循环次延伸 % * 电泳检测 % 产物后胶回收 % 产物并克隆至 #! & 载体中测序鉴定序列原核表达质粒的构建 " " 含半滑舌鳎重组的质粒与! 质粒均以和内切酶双酶切 1 后酶切产物回收并以 # 连接酶进行连接过夜转化至 # % 感受态细胞经含有氨苄青霉素抗性的培养基培养后挑单克隆经 % 鉴定测序验证构建的重组表达载体! & 序列工程菌株的筛选及目的蛋白的诱导表达 "" 将含有重组表达载体!& 的阳性克隆提取质粒并转化进宿主菌! # ) 在终浓度为! $ 的氨苄青霉素与 $ 氯霉素的平板中培养并以 &! 与 & 为引物进行 % 反应筛选工程菌株并测序确定以! 空质粒转化子为阴性对照挑取工程菌株单克隆接种于培养液中含! $ 氨苄青霉素与 $ 氯霉素震荡培养过夜将活化菌以! % 接种于!% 的

3 """ 水 " 产 " 学 " 报卷培养液中含! $ 氨苄青霉素与 $ 氯霉素震荡培养当 # $ 约为 $ 时加诱导剂异丙基 &&#& 硫代半乳糖苷 %, 至终浓度! $ 诱导表达 1 期间分别在诱导后 $ 和 1 取! 菌液 $ "$ * 离心 % * 收集细胞经!%- # &%, 电泳分析目的蛋白在不同时间的表达情况诱导 1 后离心并称取湿重按照!! % 的比例加入裂解液 " )& % $ # $!! $ " *&! %- 重悬细胞并超声波破碎细胞! "$ * 离心! * 收集裂解上清液及沉淀经!%- # &%, 电泳分析目的蛋白的表达形式 " 结果 )!* 合成目的基因第一轮 % 结果扩增产物! 和都可见清晰的特异性条带图!&! 切胶回收与预期值相符的目的片段后进行第二轮 % 最终扩增得到一条左右的特异性条带图!& 片段大小与预期值相符因此将该片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化回收后经连接转化后测序经验证该特异性条带即突变后的半滑舌鳎成熟肽核苷酸序列预期位点均实现了定点突变并且未引入其他突变图因此可用于后期的克隆和原核表达载体构建图 )!* 扩增产物的电泳分析结果! 第一轮 % 扩增产物! % 扩增产物第二轮 % 最终扩增产物 #!"/" # 5)*( / + ) #!#(1 ).. )! +, / &1 )!*!% " *! /! 1/( ") / % " *! / 1/( ") / ( ) * " 1/)/ * / #!"/" # 图经改造后基因和编码的氨基酸序列加粗字体为分别添加的及酶切位点阴影为修改后的碱基箭头示所用引物位置虚线所指序列为合成的 5)*%! ( /), #!,#-)! # ),!. *! #./ )!* -,).) #/)!!* "/)" * ) /)!"/1 1 1/ * 1/* / /) 1!* / * %!"/)1! 8/ 1/) *1/) / )!"/ / */1/ " /")!"/)1 8*!" 8)

4 /期 /// 王亚楠"等!半滑舌鳎生长因子 8( ( 的定点改造及原核表达 % &原核表达质粒的鉴定原核表达载体 M,N/1 8 O 转化 5+7"感受态细胞"质粒提取进行酶切鉴定# 图 / $ "与对照质此后不再明显增加"杂蛋白增多 # 图 7 $ 因此"初步推测重组蛋白成功表达" 且最佳诱导时间为 1 I 粒相比" M,N/1 8 O 质粒双酶切后有 9 RM 左诱导后的全菌体经超声破碎后" 分别取上清右的目的条带将经测序验证的阳性克隆提取质液&沉淀进行 7E *5*8 7&D,检测" 结果显示重粒后"转化大肠杆菌 91 # 5,/ $ M= *菌株后菌组蛋白多存在于上清液中"为可溶性表达# 图 6$ 落 7-$筛选阳性克隆"结果发现阳性率 E"且条带一致# 图 9$ "挑取号克隆进行测序"结果显示为突变后的目的基因并且没有引入其他突变加甘油保存菌种于 5: K"待用图 /&不同诱导时间下重组蛋白!N 表达的 P(P" -*1R分析 1M,N/1 # $ 空质粒转化子未诱导% 1 1M,N/1 # $ 空质粒转化子诱导后 : I% / 1重组菌未诱导% 9 <1重组菌株经 ) 7ND 图 +&CR7+ 5$ T% 和 CR7+5"!N 质粒的双酶切结果 S +&(<8 K IED B = :C5 :F : : :5DCR7+5"!N 诱导后 1 &9 &6 和 : I% 1中分子量蛋白 : P S /&RUC = = ::FF <= :!N () *+ "J:= = 5 P5D F F D< : E 9$$ (R+% C9I= 1<B BJ< J /B / % 11 /B / :M / J BJ< /B R= ) 7ND /: I% /1<B BJ< J :M % 9 51 :M / J BJ< /B R= ) 7ND /1" 9 " 6 BJ : I" M T =% 1 M / B : P 1 图,&菌落 -#.鉴定阳性克隆 < 均含有重组的 M,N/1 8 O% 均为阳性克隆% 15%& : P # 51$ S,&L D F 5 ::F :E8 5C 5= E D8I -#. 5 1 M/ T /B J J R= 7-$% 15%& : P # 51$ 1 % +&重组蛋白的诱导表达和可溶性分析图 V&重组蛋白诱导表达形式的 P(P" -*1R分析将测序验证后的阳性重组表达菌株活化& 培 1M,N/1 # $ 空质粒转化子诱导后 1 I% 1 1重组菌株诱导后养并经 ) 7ND诱导表达"将诱导后 &1&9&6&: I 及 1 I% / 1重组菌株未诱导% 9 1超声裂解上清% 7 1超声裂解沉淀% 空质粒诱导后 &: I 的细菌总蛋白以 7E *5*8 1中分子量蛋白 : P 7&D,检测"结果显示"与阴性对照空载体表达产物及诱导前菌体相比" 重组表达质粒诱导 1 I 后 S V&( E 5 ::F JF <= :!N = : <8 I 1 /B / :M / J ) 7ND BJ< /B /1 I% 11 :M / J ) 7ND BJ< /B /1 I% /1<B BJ< J 即开始在分子量大约 // P< 处有明显的表达条 % 9 1 /B J <M B B % 7 1 /B J M % 1M / B :M 带"蛋白质大小与推测的理论值一致"蛋白表达量 : P 1!" " #!!$$$%& ( )* +, -%.

5 """ 水 " 产 " 学 " 报卷 " 讨论肝素结合生长因子具有广泛的生物学活性如神经营养化纤维化血管再生和致癌活性等目前已成为多种疾病治疗中颇具前景的分子靶点人的蛋白含!! 个氨基酸残基富含碱性氨基酸和半胱氨酸是一种! 的分泌性肝素结合生长因子生化研究表明形成二聚体从而结合到受体型酪氨酸激酶 % %$ % %! 同时也能激活 % 和 % 激酶途径可以体外诱导造骨细胞的迁移这一过程需要结合到 % %$% % 激活 % 途径! 半滑舌鳎蛋白也属于分泌型蛋白具有一个对其受体 % % 必不可少的精氨酸残基! 并且具有! 个高度保守的半胱氨酸二者结构的保守性以及在功能上存在的差异需要未来研究人员对功能进一步的研究而有活性的蛋白则是这些研究的基础大肠杆菌作为基因工程开发最早的表达系统由于具有生产成本低生长迅速能大规模发酵外源基因表达水平高下游技术很成熟易于控制等优点仍是目前最常用的外源蛋白表达系统!& 外源基因在大肠杆菌中的表达水平受多种因素影响其中由于原核生物的基因对同义密码子的使用具有非随机性富含大肠杆菌不常用密码子的真核基因可能在大肠杆菌中得不到有效表达鉴于此原因本实验利用 * % 方法对目的基因进行了改造根据大肠杆菌密码子偏好性本实验分别设计合成了两对引物和一段 %& 长的片段三者之间分别有!& 和!$ 的重叠部分同时采用高保真 %( # 聚合酶减少 % 重叠延伸过程中的错误成功对半滑舌鳎成熟肽序列进行了碱基突变获得了密码子偏爱性改造的突变体该方法简单有效耗时短成本低可作为一种常规方法用于同源重组片段的构建! 基因敲除长片段基因的合成等研究为许多基因蛋白方面的研究提供了一种简单可行的实验技术虽然原核表达系统有很多优势但真核基因转入原核细胞中表达同样存在着许多的不利因素例如缺少翻译后加工修饰系统蛋白往往以包涵体形式存在蛋白的复性比较困难等等正确选择合适的载体和宿主菌则有利于提高目的蛋白可溶部分比例及活性人类成熟肽原核表达载体已成功构建并被诱导但主要以包涵体形式存在 #% 需进行包涵体的变性复性等工作不利于后期的基因功能验证以及应用本实验中由于半滑舌鳎蛋白具有! 个高度保守的半胱氨酸并在分子内形成五对二硫键因此我们选用原核表达载体! 该载体带有! )! 和 "! 标签以及凝血酶和肠激酶位点硫氧化还原蛋白 " 和目的蛋白进行融合表达可催化二硫键形成并促进目的蛋白正确折叠改善其溶解性避免包涵体形成 )! 和! 可用于重组蛋白的亲和纯化以及 /)/"*& * 检测凝血酶和肠激酶位点可用于后期切去融合序列通过选择合适的载体本实验中半滑舌鳎重组蛋白最终获得了成功的诱导表达半滑舌鳎成熟肽! 与载体标签蛋白融合表达约为的重组蛋白并主要以可溶形式存在半滑舌鳎重组蛋白表达载体的构建及可溶形式的成功表达为研究半滑舌鳎的结构和功能奠定了基础在本实验的基础上可通过重组蛋白纯化与活性检测抗体制备体外细胞系检测其表达水平以及鱼体注射检测上下游基因的表达变化等多种形式进一步诠释半滑舌鳎生长因子的功能和调控参考文献! "!!) "! "!!) # * *!* )/5 /* * (! */8 /*/ */*)/ / "/))/ * /!" (/"/*! * )! /) (/ " *!!" *! /)!* * & /)! * /" ( )/ / " * /*/) ) 1/!!* 1 )! /)/!" 1 *! *)!&!%!!! #!! "!!)!* %!*! "/ *! "/) *) 6/ /*/ ( * * 1/ /"!!" *!) )/ )/ "/))/ * )!!!* / "! *" /!**/" " * )/ / " /*/) ) 1/ "*! ( /!&&!! $ #$!$ " 1!8! 1 "!!) / *! "/) *) 6/ /*/ " */ 1!) */ " " 1 ( * *) ( )/ ) *! "!* ")!"!* * */ " *) * "/ "*! ( / " ) /* //)/!" 1!&& %% % #% &

6 期王亚楠等半滑舌鳎生长因子 &!(" 的定点改造及原核表达 "" % "!*. "!!)!!) # ) * / "/)) * ( */!* / " 1 * * 1/) *! "!*! /*! )) /) " * /!" )/ /6/ /* #/6/ /*," 81!* # (/"/*! *!! #!!& % ",!6/"! ( " "# # * )&//" */!* / " 1 * / "/)) * * * "!!*! *!*"/!) )) /!* /"!&& %!% #!%& $ " 赵秋马松林王渝等 */ 在胰腺癌组织中的表达及临床意义胰腺病学 $ $ $ # & " * )1!! "!!!! * 1 ) 1/!!*! ) ) ( *// "/)) * * 1!* " )!/!" *! *!&&&% % #% " */" 1!(/" # ) 1 * *! 6/" /* / (8 /"!( )1 */ " 81 (! ") ( 8 * ( )1&) / ( /*/! *,/* / /)/" 1! $! $ #!! & "!!) "!!) */!* / " 1 * * */ "! /6/ /*!*!* /"!* /"//")! #!! "!/ 7!!)!) * )/*)/ / * / /!" // */!1/!" * * * " 81 (! " ) "/))/) " /* ( )/"/!!" *! /)!* /"/)/!" 1!$! $ # &!!!" 李克马百坤张春妮等 */ 基因的克隆及在大肠杆菌中的表达肿瘤防治杂志 & $ #!!" 钱海华康晓燕殷正丰等重组人中期因子的原核表达纯化及生物学活性鉴定第二军医大学学报 % & # &! " 王跃华张青云细胞因子 &!(" 基因的克隆及其转化甲醇酵母 % 山西医科大学学报 % $$ $ #$!" */" * /"!( )1! * 6/ )/ "// */!"!/) * )/" " */ " /*/) ) #/6/ /*!!&!! #!!!%" 1!(/" / "! /! ( "!/ ( "! * * /"!( )1 *) )) (8 1!)/)!* "/5 "/)" *& /" 6/ */&!,/*/) #/6/ /* %!& & #&!$"7 * :! # : #/6/ /*! / "/)) * (!( " * /!" / " /*/) ) 1/ */"*! *! "*! ( #/6/ /*! %! $! #$&!"!/! 1 1!"!&!*!! "! "/ / "& / " / *& " ) */ 1 ) 1!!)/ % %$ % % * )! 1/!" *& * * " 81 (! " */ 1/ "*! (! 1/ )"!&&&! #!&! ".!)!/!!! "! * * / */ *6 6/ /* ( " / *& " ) */ 1 ) 1!!)/ /*&! 6!/ " / * *!)/!* 1 ) 1! * ) & *!)/ 1/ "*! (! 1/ )"!$!% $ #!% %!&" 李元陈松森王渭池基因工程药物北京化学出版社 ",!*!,!( /, *"!*! * ( *! ") * %" // * ) ( 1/! *!! / ( /* / (1/* /!/ ( /"!!& & $! $&& #!" 李敏杨谦一种高效构建同源重组 # 片段的方法, 融合 % 中国生物工程杂志 % #% " 8!!!!"! " % & /!/ /*/"! * (! /*/ )" * *)" 8 1 1/ )/ (#!)/!*!) 6/ ") /)/)/!" 1 / ": * 7!. %/* ) / "! 1 1&( /!* )&/(/ 6/ % &!)/ 8 &)/ # ) *1/) ) /1 ( " * /*/ )/5 /* /) / )/)/!" 1! /& " 薛永涛黄文晋石斌等表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达生物化学与生物物理进展!&& %! %$ #$ %" 张青云杨敏王雅明等细胞因子 */ 融合蛋白的表达及其单克隆抗体的制备与应用细胞与分子免疫学杂志 %!% $ % #$

7 """ $ 水 " 产 " 学 " 报卷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

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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