国际肿瘤学杂志 2014 年 8 月第 41 卷第 8 期 JIntOncol,August2014,Vol 41,No edwithpcdna3.1 DCC.Results ThepopulationofcelstransfectedwithpcDNA3.1(+) DCCplasmid

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1 628 ingprotein1asacoreregulatorofmek/erk pathway dependent genesignaturesincolorectalcancercels[j].plosgenet,2010,6 (12):e [12]TsofackSP,GarandC,SeredukC,etal.NONOandRALYproteins are required for YB 1 oxaliplatin induced resistance in colon adenocarcinomacellines[j].molcancer,2011,10:145. [13]ChoSH,ParkYS,Kim HJ,etal.CD44enhancestheepithelial mesenchymaltransitioninasociationwithcoloncancerinvasion[j]. IntJOncol,2012,41(1): [14]ToK,FotovatiA,ReipasKM,etal.Y boxbindingprotein 1 inducestheexpresionofcd44andcd49fleadingtoenhancedself renewal,mammospheregrowth,anddrugresistance[j].cancer Res,2010,70(7): ( 收稿日期 : 修回日期 : ) 论著 DCC 基因对人结直肠癌细胞株 SW1116 生物学行为的影响姜洪伟王举李海军彭际奎高小平陈峰摘要目的研究外源性 DCC 基因稳定转染对人结直肠癌 SW1116 细胞株的作用方法采用反转录聚合酶链反应从人正常结肠组织中扩增 DCC 基因功能区片段, 构建 pcdna3.1(+) DCC 重组质粒并鉴定将重组质粒转染入 DCC 基因缺失的结直肠癌 SW1116 细胞中, 用四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 比色法观察其抑制结直肠癌细胞 SW1116 的作用 ; 用免疫荧光方法研究 pcdna3.1(+) DCC 质粒转染人结直肠癌细胞 SW1116 后对结直肠癌细胞的影响及癌胚抗原 (CEA) 表达结果转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒的 SW1116 细胞在转染后第 3~6 天, 其细胞数显著低于转染 pcdna3.1(+) 质粒的 SW1116 细胞和正常细胞对照 (t=3.645,p<0.05;t=3.132,p<0.05); 转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒的 SW1116 细胞生长增殖速度低于转染 pcdna3.1(+) 质粒的 SW1116 细胞和正常细胞对照 (t=2.134,p<0.05;t=2.736,p<0.05) 转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒的 SW1116 细胞在转染后第 2~6 天, 其总细胞活力显著低于正常细胞对照 (t=3.053,p<0.05); 转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒的 SW1116 细胞在转染后第天, 其总细胞活力显著低于转染空质粒对照 (t=2.816,p<0.05) 转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒的 SW1116 细胞呈黄绿色荧光的细胞数量和荧光强度明显低于转染 pcdna3.1(+) 质粒的 SW1116 细胞和对照组细胞结论转染 DCC 基因能抑制结直肠癌细胞的生长增殖, 降低 CEA 表达, 从而降低结直肠癌细胞浸润转移能力关键词结直肠肿瘤 ; 转染 ;DCC 基因 EfectsofDCCgeneonbiologicalbehaviorsofcolorectalcarcinomacellineSW1116 JiangHongwei, WangJu,LiHaijun,PengJikui,GaoXiaoping,ChenFeng.DepartmentofGastrointestinalSurgery,Inner MongoliaPeople shospital,hohhot010017,china Corespondingauthor:JiangHongwei,E mail:jhww2009@163.com Abstract Objective ToinvestigatetheefectsofexogenouswildDCCgenestablytransfectionon growthofcolorectalcarcinomacellinesw1116invitro.methods DCCgenedomainwasamplifiedfrom humannormalcolontisuebyreversetranscript polymerasechainreaction(rt PCR).Atfirst,arecombinant expresionplasmidpcdna3.1(+) DCCwasconstructed.HumancolorectalcarcinomacellineSW1116with outdccgenewastransfectedwithpcdna3.1 DCC.Celviabilitywastestedbymethylthiazolyltetrazolium (MTT)asay.ImmunofluorescencestainingwasusedtodeterminetheefectsofpcDNA3.1 DCCandexpres sionofcarcino embryonicantigen(cea)inhumancolorectalcarcinomacellinesw1116whichwastransfect DOI: /cma.j.isn X 基金项目 : 内蒙古自治区自然科学基金 (2013MS1151) 作者单位 : 呼和浩特, 内蒙古自治区人民医院胃肠外科通信作者 : 姜洪伟,E mail:jhww2009@163.com

2 国际肿瘤学杂志 2014 年 8 月第 41 卷第 8 期 JIntOncol,August2014,Vol 41,No edwithpcdna3.1 DCC.Results ThepopulationofcelstransfectedwithpcDNA3.1(+) DCCplasmidwas lowerthanthosewithpcdna3.1(+) DCCplasmidandnormalcels(t=3.645,P<0.05;t=3.132,P< 0.05)at3~6daysaftertransfection,andtheproliferationrateofcelstransfectedwithpcDNA3.1(+) DCC plasmidwaslowerthanthosewithpcdna3.1(+)plasmidandnormalcels(t=2.134,p<0.05;t=2.736, P<0.05).CellineSW1116transfectedwithpcDNA3.1(+) DCCplasmidtotalviabilitywaslowerthannor malcels(t=3.053,p<0.05)at2~6daysaftertransfection.cellinesw1116transfectedwithpcdna3.1 (+) DCCplasmidtotalviabilitywaslowerthanthosewithpcDNA3.1(+)plasmid(t=2.816,P<0.05)at 2,4,5,6daysaftertransfection.Thepopulationofflavo greencolourcelstransfectedwithpcdna3.1(+) DCCplasmidandthefluorescentintensityofthesecelswerelowerthanthosewithpcDNA3.1(+)plasmid andnormalcontrolcels.conclusion TransfectedDCCgenecansuppresthecelproliferationandmakeCEA expresionofcellinesw1116downregulationtoweakenitsinfiltrationandmetastasisabilities. Keywords Colorectalneoplasms;Transfection;DCCgene 细胞分化与生长相关的细胞信号转导细胞增殖凋亡和血管生成有关, 这些功能使人们注意到其与肿瘤发生的关系 [1] 基因治疗的关键是克隆基因治疗所需要的目的基因, 并且构建一个可以高水平表达目的基因产物的真核表达载体, 使表达产物具有相应的生物学活性 [2] 本研究选择了在结直肠癌中高度失活的抑癌基因 DCC 作为克隆和研究的目的基因, 以寻求基因治疗结直肠癌的新途径和方法通过从人正常结肠组织中钓取扩增 DCC 基因功能区片段, 构建了 pcdna3.1(+) DCC 重组质粒, 用反转录聚合酶链反应 (RT PCR) 法四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 法免疫荧光方法研究 DCC 基因在人结直肠癌细胞株 SW1116 中的表达及意义 1 材料与方法 1 1 标本来源和主要试剂人结直肠癌细胞株 SW1116 购自中科院上海生物研究所质粒与菌株采用 pmd18 T 质粒大肠杆菌 JM109 感受态细胞 (E.colicompetentcels JM109),pcDNA3.1(+) 质粒购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 1 2 主要实验方法根据美国国立医学图书馆网站公布的 DCC 基因 mrna 序列和参考文献 [3] 设计并合成扩增 DCC 功能区的引物, 由宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司合成 DCC 上游引物 : 5 AAGCTTCCGCCACCATGA CAGTCTTGGTTCCGCCATG 3 DCC 下游引物 :5 CTCTCTCTCGAGCTAACTGGAGCTTGGGATAGCAGGC 3 其中 AAGCTT 为限制性内切酶 HindⅢ 酶切位点,CTCGAG 为限制性内切酶 XhoⅠ 酶切位点, CCGCCACCATG 为 Kozak 序列,ATG 和 CTA 为起始密码子和终止密码子 1 3 提取正常结肠组织总 RNA 采用宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 RNAisoPlus 试剂从正常结肠组织中提取总 RNA 标本来自内蒙古自治区医院胃肠外科 2010 年 4 月 2014 年 6 月经病理诊断明确的结直肠腺瘤, 距肿物 10cm 取新鲜标本, 立即放入 -80 冰箱, 然后转移至液氮中保存 1 4 RT PCR 采用宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 PrimeScript OneStepRT PCRKitVer.2 进行 RT PCR 1 5 DCC 基因功能区片段的获得 DCC 基因功能区片段的钓取和扩增 : 采用 RT PCR 的方法从人正常结肠组织中扩增 DCC 基因功能区片段 DCC 基因功能区片段与 pmd18 T 载体的连接和 DNA 序列测定 : 从琼脂糖凝胶中回收 DCC 基因功能区片段 PCR 产物, 与 pmd18 T 载体连接, 转化 JM109 感受态细胞, 挑取单克隆菌落, 酶切鉴定含阳性重组质粒的菌落对质粒插入片段进行 DNA 序列测定, 将测序结果与美国国立医学图书馆网站公布的 DCC 基因 mrna 序列 (NM_ ) 比对, 结果完全正确 1 6 构建 pmd18 T DCC 重组载体筛选阳性重组菌 : 回收 DCC 基因片段, 将该片段与 pmd18 T 载体连接, 进行转化, 提取质粒 DNA, 行 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性重组质粒将插入了 DCC 基因片段的阳性重组质粒进行 DNA 序列测定构建 pcdna3.1(+) DCC 重组质粒 : 获得 DCC 基因 HindⅢ XhoⅠ 双酶切片段获得 pcdna3.1(+) 质粒载体 HindⅢ XhoⅠ 双酶切片段, 行 1% 琼脂糖凝胶电泳对 pcdna3.1(+) 质粒载体双酶切片段浓度进行定量采用宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 T4 DNA 连接酶进行 DCC 基因片段和 pcdna3.1(+) 载体片段连接反应将上述连接反应液 15μl 转化至大肠杆菌 JM109 感受态细胞, 筛选

3 630 阳性重组菌检测转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒的 SW1116 细胞活性和癌胚抗原 (CEA) 表达 : 制备 pcdna3.1(+) DCC 质粒和 pcdna3.1(+) 质粒检测转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒的 SW1116 细胞的生长情况, 消化对数生长期 SW1116 细胞, 分别于转染后的第和 6 天,0.25% 胰酶消化细胞, 计数, 绘制细胞生长曲线用 MTT 比色法检测细胞活力检测转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒的 SW1116 细胞 CEA 的表达 : 采用免疫荧光方法检测 CEA 的表达, 分别于细胞转染后和 96h, 荧光显微镜观察照相 1 7 pcdna3.1(+) DCC 重组质粒的构建和扩增将测序正确的 pmd18 T DCC 质粒进行 XhoⅠ 和 HindⅢ 双酶切, 琼脂糖凝胶电泳, 回收 DCC 基因片段 ; 将本室保存的 pcdna3.1(+) 质粒进行同样的双酶切, 琼脂糖凝胶电泳, 回收载体片段 ; 将 DCC 基因片段和 pcdna3.1(+) 载体片段进行连接, 转化入 JM109 感受态细胞, 挑取单克隆菌落, 酶切鉴定含阳性重组质粒的菌落共挑取 2 个单克隆菌落进行鉴定, 结果质粒用 XhoⅠ 和 HindⅢ 双酶切后均在 250bp 与 500bp 之间出现了目的条带 (335bp), 说明这 2 个菌落均含有 pcdna3.1(+) DCC 重组质粒扩大培养 pcdna3.1(+) DCC JM109 菌种和 pcdna3.1 (+)JM109 菌种, 多量制备质粒 DNA, 用于转染细胞得到了高浓度的 pcdna3.1(+) DCC 质粒 (1.55μg/μl) 和 pcdna3.1(+) 质粒 (1.12μg/μl) 1 8 统计学方法采用 SPSS15.0 软件, 用 t 检验对数据进行统计学分析,P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2 1 转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒抑制结直肠癌细胞 SW1116 的增殖用 pcdna3.1(+) DCC 质粒和 pcdna3.1(+) 质粒转染 SW1116 细胞, 于转染后天消化细胞, 计数, 绘制细胞生长曲线 ( 图 1) 结果转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒的 SW1116 细胞在转染后第 3~6 天, 其细胞数显著低于转染 pcdna3.1(+) 质粒的 SW1116 细胞和正常细胞对照 (t=3.645,p< 0.05;t=3.132,P<0.05), 见表 1 转染 pcdna3.1 (+) DCC 质粒的 SW1116 细胞生长增殖速度低于转染 pcdna3.1(+) 质粒的 SW1116 细胞和正常细胞对照 (t=2.134,p<0.05;t=2.736,p<0.05,) 用 MTT 比色法于转染后天检测细胞活力, 结果表明转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒的 SW1116 细胞在转染后第 2~6 天, 其总细胞活力显著低于正常细胞对照 (t=3.053,p<0.05); 转染 pcdna3.1 (+) DCC 质粒的 SW1116 细胞在转染后第天, 其总细胞活力显著低于转染空质粒对照 (t= 2.816,P<0.05), 见表 2 说明转染 DCC 基因可抑制结直肠癌细胞 SW1116 的增殖图 1 转染 DCC 基因人结直肠癌 SW1116 细胞生长曲线 2 2 转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒抑制结直肠癌细胞 SW1116 表达 CEA 分别用 pcdna3.1(+) DCC 质粒和 pcdna3.1 (+) 质粒转染 SW1116 细胞, 于转染后第 96h 固定细胞, 免疫荧光染色检测 CEA 表达结果如图 2 所示,CEA 经免疫荧光染色后在紫外灯下呈黄绿色荧光, 转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒的 SW1116 细胞表 1 SW1116 细胞转染 DCC 基因不同时间细胞计数 ( 10 4,x±s) 组别 1d 2d 3d 4d 5d 6d 细胞对照 1.30± ± ± ± ± ±1.43 转染空质粒 1.37± ± ± ± ± ±1.25 转染 DCC 1.37± ± ± ± ± ±1.45 与细胞对照比较 P 值与质粒对照比较 P 值

国际肿瘤学杂志 2014 年 8 月第 41 卷第 8 期 JIntOncol,August2014,Vol 41,No 8 631 表 2 SW1116 细胞转染 DCC 基因不同时间 MTT 比色法检测细胞活力 (A 490nm,x±s) 组别 1d 2d 3d 4d 5d 6d 细胞对照 0.34±0.03 0.43±0.03 0.53±0.02 0.73±0.03 0.85±0.04 0.

4 国际肿瘤学杂志 2014 年 8 月第 41 卷第 8 期 JIntOncol,August2014,Vol 41,No 表 2 SW1116 细胞转染 DCC 基因不同时间 MTT 比色法检测细胞活力 (A 490nm,x±s) 组别 1d 2d 3d 4d 5d 6d 细胞对照 0.34± ± ± ± ± ±0.01 转染空质粒 0.34± ± ± ± ± ±0.03 转染 DCC 0.33± ± ± ± ± ±0.07 与细胞对照比较 P 值与质粒对照比较 P 值注 :MTT 为四甲基偶氮唑蓝 a: 细胞对照 ;b: 转染 pcdna3.1(+) 质粒细胞 ;c: 转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒细胞 ;CEA: 癌胚抗原图 2 3 组 SW1116 细胞表达 CEA 的免疫荧光照片 ( 100) 呈黄绿色荧光的细胞数量和荧光强度, 明显低于转染 pcdna3.1(+) 质粒的 SW1116 细胞和对照细胞结果说明, 转染 DCC 基因能下调 SW1116 细胞表达 CEA 3 讨论 DCC 基因敲除小鼠可以支持 HT 29 人结肠细胞在神经轴突的迁移, 起到对于黏膜分泌腺细胞的分化和肿瘤的抑制作用,DCC 转染的 HT 29 人大肠细胞株显示了细胞之间的黏附作用增强, 减少了细胞同基质间的联系, 从而导致微粒体的不稳定 [4] β Catenin 是连接的主要成分, 在细胞和细胞连接之间必不可少 Wht 信号正常时 β Catenin 不被降解, 转移到细胞核中, 与淋巴细胞增强因子结合使细胞增殖的基因转录, 细胞间黏连的减少增强了 Whn 信号, 激活了细胞的转移过程, 近期研究表明 β Catenin 表达的减少和 Whn 的异常导致了遇有侵袭性的肿瘤和不良的结果结直肠癌缺失基因敲除小鼠证实了黏着斑激酶基因在肿瘤转移方面的一个很重要的角色, 结直肠癌缺失基因转染 HT 29 人结肠细胞表现出不分散现象, 在细胞膜表面增加了钙黏蛋白 [5] 细胞和细胞之间以及细胞和基质之间的黏附结构在不同组织之间细胞正常结构的保持和发展有关的迁移中起着重要作用, 连接着细胞外基质的配体和邻近细胞, 为骨架提供细胞表面的化学信号传导提供分子支持 [6] 实际上, 细胞膜受体, 例如整合蛋白钙黏素选择蛋白和细胞黏附分子, 都成簇地排列在特定的位置在人体中, 细胞外骨架蛋白细胞外基质和邻近细胞连接起来, 特别是在信号传导中 [7] 免疫球蛋白超家族在结直肠癌中缺失的功能, 认为与细胞黏连分化细胞凋亡和轴索引导有关, 在 DCC 中, 酪氨酸激酶和黏着斑激酶也被磷酸化, 是产生轴索排斥所必须的 [8] 本研究首先进行 DCC 基因功能区片段的钓取和扩增采用 RT PCR 从人正常结肠组织中扩增 DCC 基因功能区片段, 扩增产物进行了 DCC 基因功能区片段与 pmd18 T 载体的连接和 DNA 序列测定, 将测序结果与美国国立医学图书馆网站公布的 DCC 基因 mrna 序列 (NM_ ) 比对, 结果完全正确将测序正确的 pmd18 T DCC 质粒进行 XhoⅠ 和 HindⅢ 双酶切, 琼脂糖凝胶电泳, 回收 DCC 基因片段 ; 将 pcdna3.1(+) 质粒进行同样的双酶切, 琼脂糖凝胶电泳, 回收载体片段 ; 将 DCC 基因片段和 pcdna3.1 (+) 载体片段进行连接, 转化入 JM109 感受态细胞, 挑取单克隆菌落, 酶切鉴定含阳性重组质粒的菌落完成 pcdna3.1(+) DCC 重组质粒的构建和扩增转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒的 SW1116 细胞在转染后第 3~6 天, 其细胞数显著低于转染 pcdna3.1

5 632 (+) 质粒的 SW1116 细胞和正常细胞对照 ( 均 P< 0.05), 转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒的 SW1116 细胞生长增殖速度低于转染 pcdna3.1(+) 质粒的 SW1116 细胞和正常细胞对照采用 MTT 比色法于转染后天检测细胞活力本实验 MTT 结果表明转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒的 SW1116 细胞在转染后第 2~6 天, 其总细胞活力显著低于正常细胞对照 ; 转染 pcdna3.1(+) DCC 质粒的 SW1116 细胞在转染后第天, 其总细胞活力显著低于转染空质粒对照说明转染 DCC 基因可抑制结直肠癌细胞 SW1116 的增殖转染 pcdna3.1 (+) DCC 质粒抑制结直肠癌细胞 SW1116 表达 CEA 用 pcdna3.1(+) DCC 质粒和 pcdna3.1 (+) 质粒转染 SW1116 细胞, 于转染后第 96h 固定细胞, 免疫荧光染色检测 CEA 表达 CEA 经免疫荧光染色后在紫外灯下呈黄绿色荧光, 转染 pcdna3.1 (+) DCC 质粒的 SW1116 细胞呈黄绿色荧光的细胞数量和荧光强度, 明显低于转染 pcdna3.1(+) 质粒的 SW1116 细胞和对照细胞, 说明转染 DCC 基因能下调 SW1116 细胞表达 CEA 本研究结果说明, 转染 DCC 基因能抑制结直肠癌细胞的生长增殖, 降低 CEA 表达体外转染真核细胞 SW1116 细胞后,DCC 基因可以在转染细胞中稳定表达, 从而为研究抑癌基因 DCC 的功能及肿瘤的基因治疗提供了有效的工具因此 DCC 基因有可能是基因治疗的一个有效靶点参考文献 [1]DefacqueH,EgebergM,HabermannA,etal.Involvementofezrin/ moesinindenovoactinasemblyonphagosomalmembranes[j]. EMBOJ,2000,19(2): [2]DardN,LouvetS,Santa MariaA,etal.Invivofunctionalanalysisof ezrinduringmouseblastocystformation[j].devbiol,2001,233 (1): [3] 李佩玲, 胡春杰, 李长民, 等. 脂质体介导的 DCC 基因对卵巢上皮性癌细胞生长的抑制作用 [J]. 中华妇产科杂志,2006,41 (3): [4]MartinM,Simon AsmannP,KedingerM,etal.DCCregulatescel adhesioninhumancoloncancerderivedht 29celsandasociates withezrin[j].eurjcelbiol,2010,85(8): [5]DicksonTC,MintzCD,BensonDL,etal.Functionalbindinginterac tionidentifiedbetweentheaxonalcam L1andmembersoftheERM family[j].jcelbiol,2002,157(7): [6]EliotBE,MeensJA,SenGuptaSK,etal.Themembranecytoskele talcroslinkerezrinisrequiredformetastasisofbreastcarcinomacels [J].BreastCancerRes,2005,7(3):R [7]ForcetC,SteinE,PaysL,etal.Netrin 1 mediatedaxonoutgrowth requiresdeletedincolorectalcancer dependentmapkactivation[j]. Nature,2002,41(7): [8]GautreauA,LouvardD,ArpinM.ERMproteinsandNF2tumorsup presor:theyinandyangofcorticalactinorganizationandcelgrowth signaling[j].curopincelbiol,2002,14(1): ( 收稿日期 : 修回日期 : ) 会议动态第四届国际肿瘤表观遗传学会议通知由扬州大学和中国人民解放军总医院联合主办的第四届国际肿瘤表观遗传学会议将于 2014 年 10 月日在扬州隆重举行本届大会关注肿瘤表观遗传学领域的最新进展, 包括 DNA 甲基化基因印迹组蛋白修饰及非编码 RNAs lncrna 及肿瘤表观遗传学诊断和治疗及基础研究等最新研究进展也将成为本届会议关注点本次会议特邀肿瘤表观遗传学研究领域的知名科学家 JamesG.Herman 教授和 TimHuang 教授担任大会名誉主席, 还邀请了来自美国英国比利时荷兰西班牙瑞典日本韩国香港等国家和地区的国际知名肿瘤表观遗传学专家参会并进行专题讲座和学术交流会议将征集肿瘤表观遗传学的最新研究论文进行大会发言和交流本届会议将成为肿瘤表观遗传学领域的一次盛会, 也将为各位参会专家和学者提供一个互相学习交流, 分享最新研究成果的平台! 会议还邀请著名学术期刊 Nature Genetics 和 Epigenomics 等杂志的编辑在会议期间与参会专家和学者进行交流, 探讨相关期刊的最新关注热点联系人 : 宋成义高波电话 : E mail:epigenetics2014@yzu.edu.cn

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽