第 48 卷第 2 期洪流, 等 : 葡萄球菌核酸酶的制备及性质研究 215 中性粒细胞是先天免疫系统的重要组成部分, 属于炎症反应的一线细胞, 在抵抗微生物入侵中发挥着重要作用 [6-7] 活化的中性粒细胞会释放自身线粒体和核内染色质 DNA 到胞外, 包裹各种颗粒蛋白酶形成纤维网样结构, 称为中

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1 214 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 2017,48(2): 葡萄球菌核酸酶的制备及性质研究 洪流, 郎君超, 贺冬梅, 刘坤锋, 吴洁 ( 中国药科大学微基因药学实验室, 南京 ) 摘 要 为获得纯度较高的葡萄球菌核酸酶 (SNase) 以研究其与糖尿病的关系, 构建基因工程表达菌 E colibl21/pet28a His SNase, 诱导其表达可溶性胞外蛋白, 并对纯化的 SNase 进行初步性质研究 采用分子生物学方法设计和构建含有 SNase 基因的表达载体 pet28a His SNase, 再转入 E colibl21(de3) 感受态细胞 经过乳糖诱导表达 超声破碎及镍柱亲和 色谱等纯化步骤后, 以 SDS PAGE 和 Westernblot 鉴定 His SNase, 并对其性质进行了初步研究 结果表明, 乳糖诱导后 His SNase 能高效表达, 亲和色谱后纯度高达 85% 以上, 且其具备较高的核酸酶活性, 作用 ph 范围较广, 有很好的耐热性 本 研究为进一步探究葡萄球菌核酸酶与糖尿病的关系奠定了基础 关键词 糖尿病 ; 葡萄球菌核酸酶 ; 组氨酸标签 ; 分离纯化 中图分类号 Q789 文献标志码 A 文章编号 (2017) doi: /j.isn 引用本文洪流, 郎君超, 贺冬梅, 等 葡萄球菌核酸酶的制备及性质研究 [J]. 中国药科大学学报,2017,48(2): Citethisarticleas:HONGLiu,LANGJunchao,HEDongmei,etal StudiesonpreparationandpropertiesofStaphylococcusnuclease[J].JChina PharmUniv,2017,48(2): StudiesonpreparationandpropertiesofStaphylococcusnuclease HONGLiu 牞 LANGJunchao 牞 HEDongmei 牞 LIUKunfeng 牞 WUJie LaboratoryofMinigenePharmacy 牞 ChinaPharmaceuticalUniversity 牞 Nanjing 牞 China Abstract InordertostudytherelationshipbetweenStaphylococcalnuclease 牗 SNase 牘 anddiabetesmelitus 牞 geneticengineeringbacteriae colibl21/pet28a His SNasewasconstructed 牞 theexpresionofsolubleextracel lularproteinsnasewasinducedandtheapreliminaryresearchwasmadeonit AnexpresionvectorpET28a His SNaseplasmidcontainingtheHis SNasegenewasconstructedandtransformedintoE colibl21 牗 DE3 牘 competentcels TheproteinwasinducedbylactoseandpurifiedbyultrasounddestructionandNi afinitychroma tography 牞 respectively.itwasthenanalyzedbysds PAGEandWesternblot TheenzymaticpropertiesforSNasehas beenpreliminarystudiedaswel ResultsindicatedthatthepurityofthecorectlyexpresedfusionproteinHis SNasewasover85% SNaseshowedgoodactivitywithinawiderangeofpHandgoodheatresistance Thisexperi mentmightbeafoundationworkforthefurtherstudyontherelationshipbetweensnaseandwithdiabetes Keywords diabetesmelitus 牷 Staphylococcalnuclease 牷 His tag 牷 separationandpurification ThisstudywassupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina 牗 No 牞 牘 andthenaturalscience FoundationofJiangsuProvince 牗 No BK 牘 1 型糖尿病 (type1diabetesmelitus,t1dm) 是一种自身免疫性疾病, 是由于胰腺中分泌胰岛素的胰岛 β 细胞遭到了自身免疫性 T 细胞的靶向性破坏, 导致胰岛素的绝对缺乏而产生 [1-2] 目前临床主要采用注射胰岛素治疗 [3], 但无法从根本上阻 止 1 型糖尿病发生 胰岛移植 干细胞治疗方案虽取得一定效果, 但尚未发展成熟, 还处于摸索阶段, 有待科研人员进一步开发 [4-5] 因此, 寻求更加安全有效 易于临床应用的糖尿病治疗方法是科研人员迫切需要重点解决的重点课题 收稿日期 通信作者 Tel: E mail:wujie@cpu edu cn 基金项目 国家自然科学基金资助项目 (No ,No ); 江苏省基础研究计划资助项目 (No.BK )

2 第 48 卷第 2 期洪流, 等 : 葡萄球菌核酸酶的制备及性质研究 215 中性粒细胞是先天免疫系统的重要组成部分, 属于炎症反应的一线细胞, 在抵抗微生物入侵中发挥着重要作用 [6-7] 活化的中性粒细胞会释放自身线粒体和核内染色质 DNA 到胞外, 包裹各种颗粒蛋白酶形成纤维网样结构, 称为中性粒细胞胞外诱捕网 [8] (neutrophilextracelulartraps,nets) 研究发现,NETs 中 84% 的蛋白质是自身免疫病 肿瘤或者两者共有的自身抗原, 并且 NETs 中的修饰酶也可以对自身和外来的蛋白质进行修饰, 导致两者转变为自身抗原 [9] NETs 过分强盛或清除受阻与自身免疫病的发生发展有很大关系, 如系统性红斑狼疮 (SLE) 类风湿性关节炎 (RA) 自身免疫性小血管炎 糖尿病等 [10-12] 研究发现, 糖尿病患者体内 NETs 标志物的水平显著升高,NOD 小鼠胰腺在 2 周龄时就已经出现了 NETs 升高异常 [13-14], 体外实验也表明 : 高血糖会上调中性粒细胞脱亚胺酶 4(PAD4) 基因的表达,PAD4 催化组蛋白的瓜氨酸化加剧染色质解聚, 最终促进 NETs 的形成 [15-16] 基于以上研究, 本课题组设想降解体内过分强盛的 NETs 有可能对糖尿病的发病进程产生影响 NETs 的主要结构成分是 DNA, 所以破坏 NETs 的 DNA 骨架就能降解 NETs [17] 葡萄球菌核酸酶 (Staphylococcusnuclease,SNase) 是由金黄色葡萄球菌分泌的一种单链蛋白, 具有磷酸二脂酶活性 在 Ca 2+ 的存在下, 对单链或双链 DNA 有较强的降解能力 该酶结构简单, 仅由 1 条单肽链组成, 不含半胱氨酸和二硫键, 能够可逆地去折叠和重折叠 [18-19] 本课题组前期已经发现表达 SNase 的重组乳酸乳球菌口服灌胃 NOD 小鼠能有效降低糖尿病的发病率 ( 数据待发表 ) 为进一步深入研究 SNase 与糖尿病的关系, 本实验成功构建了原核表达质粒 pet28a His SNase, 转化 E ColiBL21(DE3) 中, 建立了纯化 His SNase 的简要工艺, 并且初步研究了 ph 和温度对 SNase 活性的影响 材料 1 1 菌种 质粒及实验动物载体 pet28a Hsp65 6P277 pcyt:snase 质粒以及菌种 E colibl21 均为中国药科大学微基因实验室保存 清洁级 BALB/c 雌性小鼠 (4~6 周龄 ), 购自扬州大学, 合格证号 :SCXK( 苏 ) 试剂各种限制性内切酶 T4 DNA 连接酶 ( 美国赛默飞世尔公司 );NiSepharose6FastFlow( 美国通用医疗公司 ); 质粒小量制备试剂盒 PCR 产物纯化试剂盒 琼脂糖凝胶切胶回收试剂盒 ( 北京天根生物科技有限公司 ); 引物 ( 南京金斯瑞生物科技有限公司 ); DNAMarker 蛋白预染 Marker( 北京全式金生物科技有限公司 ); 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记羊抗小鼠 IgG 抗体和 DAB 显色液 ( 武汉博士德生物工程有限公司 ); 其他试剂均为国产分析纯 方法 2 1 His SNase 融合蛋白表达载体的构建 SNase 基因的获得利用引物设计软件 Oligo 分别设计上游引物 P1 和下游引物 P2,P1:5 CATGCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCA CAGCAGCGGCAATGCATCACAAAC 3 ;P2:5 CCG CTCGAGTTATTGACCTGAATCAGCG 3 上游引物 P1 引入 NcoⅠ 酶切位点以及组氨酸标签基因, 下游引物 P2 引入 XhoⅠ 酶切位点 采用 PCR 技术, 从 pcyt:snase 质粒中克隆获得 SNase 基因序列 扩增条件为 94 预变性 10min;94 变性 30s, 55 退火 30s,68 延伸 1min, 共 30 个循环 ; 68 延伸 10min 重组表达载体的构建与鉴定将 PCR 产物与 pet28a Hsp65 6P277 载体质粒分别由 Nco Ⅰ XhoⅠ 双酶切, 纯化后加 T4 DNA 连接酶 4 连接过夜, 将过夜产物转化至 E colibl21(de3) 感受态细胞, 抽提质粒,PCR 方法验证, 并将核酸序列送至南京金斯瑞生物科技有限公司测定 2 2 融合蛋白的诱导表达将鉴定成功的重组菌培养 4h 后, 加入乳糖 ( 终浓度 5mmol/L) 进行诱导,37 继续培养, 分别在 0,2,3,4,5,6h 取样, 测 A 600, 离心收取菌体沉淀, 进行 15% SDS PAGE 分析, 观察目的蛋白条带位置和表达量, 确定最佳诱导时间 2 3 融合蛋白的分离纯化大规模培养重组菌, 在融合蛋白表达量达最大值时离心收集菌体, 超声破碎, 低温离心收集上清液, 弃沉淀 取上清液进行 Ni NTA 柱纯化, 分别用 50,75,100,1mol/L 咪唑对融合蛋白 His SNase 进行洗脱, 收集每个峰的洗脱液,15% SDS PAGE

3 216 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2017,48(2): 第 48 卷 分析 最后将样品透析除盐 冻干保存 2 4 抗 SNase 鼠多克隆抗体的制备将 4~6 周龄 BALB/c 小鼠随机分成 2 组 : 蛋白免疫组和空白对照组, 每组 6 只 蛋白免疫组 : 免疫 3 次 首次免疫, 将融合蛋白 His SNase 冻干粉用弗氏完全佐剂配制成 2mg/mL 质量浓度 ( 蛋白定量采用考马斯亮蓝 G 250 法 ), 皮下注射, 每只 0 1mL 2w 和 4w 时, 用弗氏不完全佐剂与蛋白溶液按照同样的方法进行乳化, 皮下注射, 每只 0 1mL, 共免疫 2 次 免疫结束后, 眼眶取血, 离心获得含有抗 SNase 鼠多克隆抗体的血清 空白对照组 :1mL 的生理盐水与等体积的弗氏佐剂以同样的方法进行乳化, 给药方式同上 2 5 融合蛋白的 Westernblot 鉴定用 2 4 中获得的抗 SNase 鼠多克隆抗体作为一抗对融合蛋白 His SNase 进行 Westernblot 鉴定分析 2 6 不同反应 ph 对 SNase 活性的影响分别取不同 ph 的 DNA 酶裂解缓冲液,pH 分别设置如下 :ph (3 mmol/l MgCl 2, 3mmol/L CaCl 2,200 mmol/l NaAC/HAC),pH (3mmol/LMgCl 2,3mmol/L CaCl 2,200mmol/LNa 2 HPO 4 /NaH 2 PO 4 ) 的, 共 7 个梯度 加入质粒 DNA(pET28a:HSP65 6P277, 0 5μg/μL)20μL, 再加入纯化的 SNase 样品 (0 1mg/mL)5μL 于 EP 管中混匀, 总体积控制在 37 5μL 在 37 水浴裂解 10min 后, 加入 0 33mmol/LEDTA(pH8 0) 溶液 12 5μL 终止反应 取所得溶液 5μL 用于琼脂糖凝胶电泳检测 同上操作, 只加入纯化的 SNase 样品 (0 1mg/mL) 2μL, 在 37 水浴中裂解 10min 后进行琼脂糖凝胶电泳 2 7 不同反应温度对 SNase 活性的影响取 DNA 酶裂解缓冲液 (3mmol/LMgCL 2, 3mmol/LCaCl 2,200mmol/LNa 2 HPO 4 /NaH 2 PO 4, ph7 2)10μL, 加入质粒 DNA(pET28a:HSP65 6P277,0 5μg/μL)20μL 再加入纯化的 SNase 样品 (0 1mg/mL)5μL 在 EP 管中混匀 取 5 管, 分别置于 4,25,37,55,100 的水浴中孵育 10min, 加入 0 33mmol/LEDTA(pH8 0) 溶液 12 5μL 终止, 取所得溶液 5μL 加入 6 loadingdye1μl 用于 0 8% 的琼脂糖凝胶电泳, 观察条带荧光强度强弱 结果 3 1 pet28a His SNase 的构建构建 pet28a His SNase 质粒, 如图 1, 得 pet28a His SNase 质粒载体含有质粒的阳性克隆培养于含卡那霉素的 LB 培养基中, 培养 14h, 采用质粒小量制备试剂盒提取质粒琼脂糖凝胶电泳, 紫外光下观察电泳结果, 与预计大小基本一致, 如图 2 将挑选的阳性克隆进行测序验证, 经比对后所有碱基均与设计的相一致, 证实构建的克隆是正确的 即成功的构建了包含重组质粒 pet28a His SNase 的基因工程菌 3 2 His SNase 融合蛋白的诱导表达乳糖诱导表达融合蛋白, 经 15%SDS PAGE 分析, 在 20kD 附近出现目的蛋白条带, 与预测相对分子质量相符 ; 且在诱导 4h 时表达量最高, 通过 Bandscan 软件分析融合蛋白的表达量可达菌体总蛋白量的 48 1%, 如图 融合蛋白的分离纯化经乳糖诱导 4h 后, 收集菌体并超声破碎, 离心后对上清液和沉淀取样,15% SDS PAGE 分析发现目的蛋白存在于菌体裂解液上清液中为可溶性表达 镍柱亲和色谱结果表明融合蛋白在咪唑浓度为 75mmol/L 时被洗脱, 如图 4 和图 Westernblot 鉴定融合蛋白融合蛋白 His SNase 经过镍柱纯化后, 使用抗 SNase 鼠多克隆抗体对其进行 Westernblot 鉴定分析, 如图 6 经乳糖诱导后的转化菌产生能与抗 SNase 鼠多克隆抗体特异识别的蛋白, 约 20kD; 而未转化的 E colibl21 工程菌未出现特异反应的条带 3 5 不同反应 ph 对 SNase 活性的影响控制酶浓度 反应温度和反应时间相同的条件下, 比较 ph 对 SNase 活性的影响 图 7(A) 琼脂糖电泳结果显示从 ph4 8 至 ph9 2 之间, 体系中的质粒 DNA 被完全降解,pH3 6 时显示大部分降解, 因此其作用 ph 范围较广, 酸性 中性及碱性环境都可以发挥酶解作用 当减少加入 SNase 的量时, 结果如 7(B) 显示, 碱性条件下 SNase 的活性较中性及酸性条件更高

4 第 48 卷第 2 期洪流, 等 : 葡萄球菌核酸酶的制备及性质研究 217 Figure1 SchematicdiagramoftheplasmidofpET28a His SNase Figure2 0 8% agarosegelelectrophoresisresultsofrecombinantplas midpet28a His SNase M:DNA molecularweightstandards;lane1:recombinantplasmid pet28a His SNasefromtheclone Figure4 15% SDS PAGEanalysisoftheexpresionofrecombinant protainhis SNaseandpurificationwithdiferentconcentrationofimid azole M:Proteinmarker;Lane1:TotalproteinofE colibl21(de3)trans formedwithpet28a His SNasewithoutlactoseinduction;Lane2:Total proteinofe colibl21(de3) transformedwithpet28a His SNase inducedwithlactosefor4h;lane3:precipitateofthelysateofe coli BL21(DE3)transformedwithpET28a His SNase;Lane4:Supernatant ofthelysateofe colibl21(de3) transformedwithpet28a His SNase;Lane5:ProtainsflowthroughfromNiSepharose;Lane6 9:Gra dientelutionwith50,75,100,1mol/lofimidazole Figure3 15% SDS PAGEanalysisoftheexpresionlevelsoffusion proteinhis SNaseinducedbylactosefordiferenttime M:Proteinmarker;Lane1:TotalproteinofE colibl21(de3)trans formedwithpet28a His SNasewithoutlactoseinduction;Lane2 6: TotalproteinofE colibl21(de3) transformedwithpet28a His SNaseinducedwithlactosefor2,3,4,5,6h,respectively Figure5 AfinitychromatographywithNiSepharose Peak1:Proteinsflow through;peak2 5:Elutionwith50,75,100, 1mol/Lofimidazole

5 28 学报 J u Ch Ph m u U v 2 0 7 4 8 2 2 4 2 9 ) 讨 第4 8卷 论 关 于 中 性 粒 细 胞 胞 外 诱 捕 网 u ph x u p NET 与 自 身 免 疫 性 疾 病 的 关 F gu 6 W b pu d u p H SN m k L T p E BL2 L 2 M P Pu dh S N 系在近几年才获得人们的重视 NET内含有的 多种蛋白质是自身免疫疾病 肿瘤或两者共同的 自身抗原 目前已有研究表明 系统性红斑狼疮 SLE 患者体内 NET的含量过高 同时在 型糖 尿病患者和 2周龄 NOD小鼠体内异常增多的弹 因此推测 通过早 性蛋白酶也主要来源于 NET 期干预降解 NET或许能延缓甚至阻止 型糖尿 具有磷酸二脂酶活性 对单 病的发生 而 SN 链或双链 DNA有较强的降解能力 本课题组早 期研究也证明了肠道黏膜给药 SN 能在一定程 度上减轻 NOD小鼠糖尿病的发病率 因此 本研 究尝 试 通 过 原 核 表 达 的 方 式 获 得 纯 度 较 高 的 SN 为进一步深入探讨其与糖尿病的关系奠定 基础 在蛋白纯化工艺中 利用基因工程手段将经 过改造优化的标签与目的蛋白融合表达 通过简 F gu 7 08 Ag ph h d ph m L DNAM k L 2 P m d L 3 p H3 6 4 8 6 0 6 8 7 2 7 6 8 0 8 6 9 2 A S N 0 5μg DNA 0μg B S N 0 2μg DNA 0μg 36 不同反应温度对 SN 活性的影响 控制酶浓度 反应 p H和反应时间相同的条件 下 比较不同温度下酶活情况 图 8琼脂糖电泳结 单快速的亲 和 色 谱 获 得 高 纯 度 的 重 组 融 合 蛋 白 已被广泛运 用 于 蛋 白 质 结 构 和 功 能 的 探 讨 及 重 组蛋白分 离 纯 化 工 艺 中 20 2 研 究 表 明 选 用 H 标签一般不会对目的蛋白的理化性质造成影 响 也不会 改 变 目 的 蛋 白 的 可 溶 性 并 使 操 作 步 骤方便高效 22 本实验通过基因工程的方法 以质粒 pcyt 果显示 从 2 5 00 之间 体 系 中 的 质 粒 DNA SN 中的 SN 基因序列为模板 同时在 SN 0 5μg 也有一 μl 被完全降解 且 4 时 SN 的基因 序 列 N端 添 加 组 氨 酸 标 签 H T g 基 定的活性 因此 SN 具有较宽的作用温度和很 因 采用 PCR方法 将获得基因序列定向克隆到 高的耐热活性 pet 28原核表达载体中 再转入 E BL2感 H 受态细 胞 筛 选 获 得 含 有 重 组 质 粒 pet28 SN 的工程菌 该重组菌经乳糖诱导后表达较 高 由于添加 H 标签 通过一步镍柱亲和色谱 能获得 纯 度 85 的 目 的 蛋 白 并 经 W b 验证了其特异性 最后评估了不同反应 ph和温 度对 SN 活 性 的 影 响 证 明 其 作 用 ph范 围 很 广 且有很好的耐热性 00 仍然有较高活性 F gu 8 0 8 A g ph h d m p u m L DNAM k L 2 P m d L 3 7 4 C 2 5 C 37 C 5 5 C 00 C 而 DN 在高温和酸性条件下容易失活 23 因 SN 具 有 更 高 的 稳 定 性 和 耐 此相 比 DN 热性

6 第 48 卷第 2 期洪流, 等 : 葡萄球菌核酸酶的制备及性质研究 219 参考文献 [1] HaskinsK,PortasM,BergmanB,etal.Pancreaticislet specific T celclonesfromnonobesediabeticmice[j].procnatacadsci USA,1989,86(20): [2] Panina BordignonP,LangR,vanEndertPM,etal.CytotoxicT celsspecificforglutamicacid decarboxylaseinautoimmune diabetes[j].jexpmed,1995,181(5): [3] BekrisLM,KavanaghTJ,LernmarkA.Targetingtype1diabetes beforeandattheclinicalonsetofdisease[j].endocrmetab ImmuneDisordDrugTargets,2006,6(1): [4] WhiteSA,ShawJA,SutherlandDER.Pancreastransplantation [J].Lancet,2009,373(9677): [5] WenY,ChenB,IldsradST.Stem cel basedstrategiesforthe treatmentoftype1diabetesmelitus[j].expertopinbiolther, 2011,11(1):41-53 [6] MócsaiA.Diversenovelfunctionsofneutrophilsinimmunity, inflammation,andbeyond[j].jexpmed,2013,210(7): [7] SegalAW.Howneutrophilskilmicrobes[J].AnnurevImmunol, 2005,23: [8] BrinkmannV,ReichardU,GoosmannC,etal.Neutrophilextra celulartrapskilbacteria[j].science,2004,303(5663): [9] DarahE,AndradeF.NETs:themisinglinkbetweenceldeath andsystemicautoimmunediseases[j].jfrontimmunol,2012, 3:428 [10] VilanuevaE,YalavarthiS,BerthierCC,etal.Netingneutrophils induceendothelialdamage,infiltratetisues,andexposeimmu nostimulatorymoleculesinsystemiclupuserythematosus[j].j Immunol,2011,187(1): [11] KesenbrockK,KrumbholzM,SchonermarckU,etal.Neting neutrophilsinautoimmunesmal veselvasculitis[j].natmed, 2009,15(6): [12] KhandpurR,Carmona RiveraC,Vivekanandan GiriA,etal. NETsareasourceofcitrulinatedautoantigensandstimulate inflammatoryresponsesinrheumatoidarthritis[j].scitransl Med,2013,5(178):178ra40 [13] WangY,XiaoY,ZhongL,etal.Increasedneutrophilelastase andproteinase3andaugmentednetosisarecloselyasociated withβ celautoimmunityinpatientswithtype1diabetes[j]. Diabetes,2014,63(12): [14] DianaJ,SimoniY,FurioL,etal.Crostalkbetweenneutrophils, B 1acelsandplasmacytoiddendriticcelsinitiatesautoimmune diabetes[j].natmed,2013,19(1):65-73 [15]DwivediN,UpadhyayJ,NeeliI,etal.Felty ssyndromeautoanti bodiesbindtodeiminatedhistonesandneutrophilextracelular chromatintraps[j].arthritisrheum,2012,64(4): [16] NakashimaK,HagiwaraT,YamadaM.Nuclearlocalizationof peptidylargininedeiminasevandhistonedeiminationingranulo cytes[j].jbiolchem,2002,277(51): [17] SimonD,SimonHU,YousefiS.ExtracelularDNAtrapsinaler gic,infectious,andautoimmunediseases[j].alergy,2013,68: [18]TaniuchiH,AnfinsenCB.Simultaneousformationoftwoalterna tiveenzymologyactivestructuresbycomplementationoftwoover lappingfragmentsofstaphylococcalnuclease[j].jbiolchem, 1971,246(7): [19] ShortleD,MeekerAK.Residualstructureinlargefragmentsof staphylococcalnuclease:efectsofaminoacidsubstitutions[j]. Biochemistry,1989,28(3): [20] SinghPK,ChanPF,HibbsMJ,etal.High yieldproductionand characterization of biologicaly active GST tagged human topoisomeraseiαproteinininsectcelsforthedevelopmentofa high throughputasay[j].proteinexprpurif,2011,76(2): [21] VorackovaI,SuchanovaS,UlbrichP,etal.Purificationofpro teinscontainingzincfingerdomainsusingimmobilizedmetalion afinitychromatography[j].proteinexprpurif,2011,79(1):88-95 [22] ZakalskiyAE,ZakalskaOM,RzhepetskyyYA,etal.Overexpres sionof(his)6taggedhumanarginaseiinsaccharomycescere visiaeandenzymepurificationusingmetalafinitychromatogra phy[j].proteinexprpurif,2012,81(1):63-68 [23] ShiokawaD,TanumaS.CharacterationofhumanDNase1family endonucleasesandactivationofdnasegammaduringapoptosis [J].Bioehemistry,2001,40:143-52

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