54 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 道 [14 16] 1~35 位氨基酸多肽 (EBOVNP1~35) 为上海吉尔生化公司合成弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂 50%PEG1450 溶液 HAT 和 HT 选择性培养基均为 Sigma 产品

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邑吉范姜
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2017,37(10):53 59 檪檪技术与方法檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 DOI: /j.cb 抗埃博拉病毒核蛋白抗体的制备与双抗夹心 ELISA 检测方法的建立 1 刘俊伟 1 常瑞恒回鹏董士尚王金凤孙 1 波 (1 天津国际生物医药联合研究院天津南开大学药学院天津 ) 杨诚摘要目的 : 制备抗埃博拉病毒核蛋白 (EBOVNP) 单克隆抗体和多克隆抗体, 建立针对 EBOV NP 的 ELISA 检测方法方法 : 以重组 EBOVNP 免疫动物并制备多克隆抗体和单克隆抗体在此基础上, 通过优化抗体浓度包被液等条件建立检测 EBOVNP 的双抗夹心 ELISA 方法结果 : 制备出了兔多克隆抗体, 筛选出 2 株可分泌单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞株 Westernblot 实验结果表明兔多抗与鼠单抗的结合区域均为 N 端 1~35 氨基酸通过优化, 建立了针对 EBOVNP 的双抗夹心 ELISA 检测方法其线性范围是 31.2~1000ng/ml, 最低检测限为 2.6ng/ml 结论 : 制备出了抗 EBOV 核蛋白的高特异性多克隆抗体和单克隆抗体, 建立了定量检测 EBOV 核蛋白的方法关键词埃博拉病毒核蛋白抗体双抗夹心 ELISA 法中图分类号 Q819 出血热 (Ebolahemorhagicfever) 是由埃博拉病毒 (Ebolavirus,EBOV) 引发的人畜共患急性出血性传染病 [1] 目前已鉴定的 EBOV 有 5 种亚型 : 本迪布焦型埃博拉病毒 (Bundibugyoebolavirus,BDBV), 扎伊尔型埃博拉病毒 (Zaireebolavirus,ZEBOV), 莱斯顿型埃博拉病毒 (Restonebolavirus,RESTV), 苏丹型埃博拉病毒 (Sudanebolavirus,SUDV), 塔伊森林型埃博拉病毒 (Ta Forestebolavirus,TAFV) [2 3] 其中, 扎伊尔型 EBOV 和苏丹型 EBOV 毒力最强 [4] 埃博拉病毒属丝状病毒科, 为不分节段的单股负链 RNA 病毒, 其分子量为 Da [5], 于 1976 年首次分离 [6 7] 整个基因组共编码 7 种蛋白质, 分别为 NP VP35 VP40 GP VP30 VP24 L, 每种蛋白均由一条单独的 mrna 所编码 [8], 其中核蛋白 (nucleoprotein,np) 收稿日期 : 修回日期 : 天津市科技计划项目 (13ZCZDSY04200,13ZCZDSY03800) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :ljwmars@163.com 是核衣壳的主要组成部分埃博拉病毒核蛋白包括一个 N 端寡聚结构域, 中间无序区以及 C 端结构域其中 N 端寡聚结构域 (EBOVNP,1~450 氨基酸 ), 包括参与病毒核蛋白寡聚的两端短臂以及负责与病毒 RNA 结合的中间核心结构域, 在病毒转录复制过程中起着非常重要的作用 [9] 此外,NP 在埃博拉病毒颗粒中高度表达且较为保守, 是可用于疾病诊断和监控的目标分子 [10 12] 1 材料与方法 1.1 材料实验材料扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白 (EBOVNP) 寡聚结构域的 1~450 位氨基酸重组蛋白 (EBOVNP1~450,GenebankNo ) 和 36~450 位氨基酸重组蛋白 (EBOVNP36~450) 已由课题组前期表达制备 [13] 经测定 EBOVNP1~450 可与埃博拉病毒 RNA 结合,EBOVNP36~450 可与埃博拉病毒 VP35 蛋白结合, 因此其生物学活性符合相关文献报

2 54 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 道 [14 16] 1~35 位氨基酸多肽 (EBOVNP1~35) 为上海吉尔生化公司合成弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂 50%PEG1450 溶液 HAT 和 HT 选择性培养基均为 Sigma 产品 ;96 孔酶标板购于丹麦 Nunc 公司 ; 牛血清白蛋白 (BSA) 为上海生工公司产品 ; 蛋白 A Sepharose4B 和蛋白 G Sepharose4B 亲和层析柱, 购自 GE 公司 ; 单抗亚型鉴定试剂盒, 购自 BDBiosciences 公司 ;HRP 偶联试剂盒购自北京博奥森公司其它试剂均为国产分析纯试剂仪器酶标仪, 美国 Thermo;CO 2 培养箱, 日本三洋 ; 倒置显微镜, 日本 OLYMPUS; 生物安全柜, 海尔公司 ;PCR 仪, 塞维斯科技 ( 北京 ) 有限公司 ; 高压细胞破碎仪, 广州聚能生物科技有限公司 ;FPLC 蛋白自动纯化系统,GEHealthcare 公司实验动物 Balb/c 小白鼠, 雌性,6~8 周龄 ; 大耳白兔, 雄性,3 个月龄, 均购于天津实验动物中心 1.2 方法动物免疫 (1) 将弗氏佐剂与 EBOVNP1~450 混合后免疫大耳白兔, 取血清并采用间接 ELISA 测定效价超过后, 取全血离心后获得抗血清 (2) 将弗氏佐剂与 EBOV NP1~450 混合免疫 Balb/c 小鼠待血清效价达到以上时, 用常规剂量的抗原生理盐水稀释, 尾静脉免疫小鼠,3 天后取脾脏细胞备用细胞融合及杂交瘤细胞筛选将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 (NS 1) 融合, 再分别使用 HAT 和 HT 培养基进行培养初筛, 并用有限稀释法筛选出 2 株可分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞亚型鉴定结果表明分泌出的单克隆抗体亚型均为 IgG1,κ 抗体纯化对小鼠进行体内接种杂交瘤细胞, 1 周后收集腹水, 用蛋白 G Sepharose4B 亲和层析柱纯化得到单克隆抗体将兔子抗血清用蛋白 A Sepharose 4B 亲和层析柱纯化得到多克隆抗体, 并对抗体浓度进行了测定抗体结合区域鉴定通过与不同长度片段的 EBOVNP(1~450 位氨基酸 ;1~35 位氨基酸 ;36~450 位氨基酸 ) 作对照实验, 利用 Westernblot 与 ELISA 方法联合使用对兔多抗鼠单抗的结合区域进行分析间接 ELISA 方法简述如下 :(1) 包被 EBOVNP 于酶标板上,4 冰箱过夜 ;(2) 用 PBST 洗板后, 加入 1% BSA 进行封闭 ;(3) 将抗体梯度稀释后加入到酶标板中 ;(4) 洗板后加入酶标二抗, 室温孵育 ;(5) 洗板后加入 TMB 底物液, 显色 30min;(6) 加入终止液双抗体夹心 ELISA 方法的优化与建立 (1) 兔多抗与单抗配对优选 : 根据 ELISA 方法步骤, 将 5μg/ml 兔多抗包被到酶标板上, 封闭后加入 5 μg/mlebovnp1~450, 并加入 0.25μg/ml 单克隆抗体及羊抗鼠 HRP 后显色测定, 根据 A 450 值的高低选择可与多抗配对的单克隆抗体 (2) 双抗夹心 ELISA 法操作流程 : 兔多抗包被聚苯乙烯酶标板 ( 包被抗体 ),4 过夜, 封闭液封闭, 室温孵育 1h 后加入抗原 EBOVNP, 室温温育 1h 后加入偶联 HRP 鼠单抗 ( 酶标抗体 ), 室温温育 30min 后加入 TMB 底物溶液显色, 室温孵育 20min 后用 2mo1/LH 2 SO 4 终止反应, 最后用酶标仪测定 450nm 吸光度值 (3) 包被抗体与酶标抗体最佳反应浓度的确定 : 本实验利用 HRP 偶联试剂盒将 HRP 偶联到鼠单抗上制备出酶标抗体, 并利用方阵法对包被抗体和酶标抗体的反应浓度进行优化包被抗体用 PBS 分别稀释为 20μg/ml 10μg/ml 5μg/ml 和 2.5μg/ml; 封闭后每个包被浓度分别加入阳性溶液和阴性溶液, 其中阳性溶液为 0.25μg/mlEBOV NP; 阴性溶液为 PBS 缓冲液溶液酶标抗体用 PBS 梯度稀释和 8000 倍显色后读数, 根据阳性孔 A 450 值 (Positive,P) 在 l.0 左右 (A 450 吸光值为 1.0 左右时灵敏度最高 ), 且阳性值与阴性值的比值较大所对应的抗体浓度为最佳反应浓度 (4) 包被液的选择 : 分别以 0.01mo1/LPBS 0.05 mol/lna 2 CO 3 NaHCO 3 (NBS) 和生理盐水作包被液, 按双抗夹心 ELISA 步骤进行反应, 比较不同包被液对结果的影响 (5) 封闭液的选择 : 分别以 1% 的 BSA PBS,3% 的 BSA PBS,3% 的脱脂奶粉 PBS 及酶标板稳定剂 ( 湖州英创生物科技有限公司 ) 为封闭液进行条件优化 (6)TMB 底物作用时间的选择 : 加入底物后, 室温下分别作用 min, 最后根据 A 450 值选择出最佳底物作用时间 2 结果与分析 2.1 抗体纯化通过免疫, 本实验获得了针对 EBOV NP 的抗血清, 经亲和层析纯化得到兔源多克隆抗体, 浓度为 10

3 2017,37(10) 刘俊伟等 : 抗埃博拉病毒核蛋白抗体的制备与双抗夹心 ELISA 检测方法的建立 55 mg/ml( 图 1) 利用细胞融合技术, 本实验制备出 2 株可分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 分别命名为 1C3 和 4G3 经纯化小鼠腹水得到单克隆抗体 1C3 的浓度为 3.4 mg/ml,4g3 的浓度为 2.1mg/ml( 图 2) 图 1 多克隆抗体纯化 Fig.1 Purificationofpolyclonalantibody 图 2 单克隆抗体 1C3 的纯化 Fig.2 Purificationofmonoclonalantibody1C3 为验证抗体纯化效果, 本研究对单克隆抗体 1C3 进行了 SDS PAGE 电泳实验, 结果表明 ( 图 3) 样品在 25~35kDa 和 45~66kDa 中间都出现了蛋白条带, 其分子量大小与鼠源单克隆抗体轻链和重链的理论值 ( 轻链 26kDa 重链 56kDa) 基本一致, 电泳条带没有拖尾现象及其他杂带, 表明抗体纯度较好另外, 本实验根据公式 Kaf=(n 1)/{2(n[Ab ] t [Ab] t )}, 计算出抗体的亲和力常数 Kaf 值 [17], 其中兔多抗的 Kaf 值为 L/mol;4G3 为 L/mol,1C3 为 L/mol 2.2 抗原结合区域鉴定 Westernblot 实验结果表明 ( 图 4), 在 EBOVNP1 ~450( 泳道 1) 有发光条带, 而 36~450( 泳道 2) 没有发

56 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No.102017 图 3 单抗 1C3 的 SDS PAGE Fig.

4 56 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 图 3 单抗 1C3 的 SDS PAGE Fig.3 TheSDS PAGEresultofmonoclonal1C3 光条带, 由此推测与抗体结合的抗原区域为 EBOVNP 1~35 为进一步验证与抗体结合的抗原区域, 本研究采用间接 ELISA 方法将多抗和单抗 1C3 分别与 EBOV NP1~35 和 36~450 抗原进行结合实验如图 5 结果显示, 以 EBOVNP1~35 作为包被原进行 ELISA 实验, 吸光值随着抗体浓度的增大而增大, 说明 1~35 与抗体有特异性结合 ; 而以 36~450 作包被原,ELISA 的吸光值很低且基本不变单抗 4G3 经 Westernblot 和 ELISA 实验测定, 其结果与 1C3 相似说明本实验得到的两种单抗均与 EBOVNP1~35 结合 2.3 双抗体夹心 ELISA 法的建立兔多抗与单抗配对的优选抗体配对实验结果表明, 本实验获得的两株单抗均可以与兔多抗配对进行双抗夹心 ELISA 检测, 其中单抗 1C3 的 A 450 平均值为 1.395(n=5), 单抗 4G3 的 A 450 平均值为 1.105(n =5) 本实验选择了吸光值较高的单抗 1C3 与 HRP 偶联, 制备酶标抗体图 4 EBOVNPWesternblot 结果 Fig.4 WesternblotofEBOVNP left:madebymonoclonalantibody1c3,right:madebypolyclonalantibodies 包被抗体与酶标抗体最佳反应浓度的确定本研究采用方阵法同时对 ELISA 反应中的包被抗体与酶标抗体浓度进行优化 ( 表 1) 选择 P 值在 1.0 左右且 P/N 值较大的包被抗体与酶标抗体的浓度最终确定最佳包被抗体浓度为 5μg/ml, 最佳酶标抗体稀释倍数为 8000 倍包被液的选择利用 3 种包被液对实验进行测定, 如图 6 显示其效果差别不大, 说明包被液对该检测方法的影响较小因此选择了常用的磷酸盐缓冲液 PBS 作为包被液图 5 ELISA 方法测定抗原结合区域 Fig.5 Determinationofantigenbinding regionbyelisa

5 2017,37(10) 刘俊伟等 : 抗埃博拉病毒核蛋白抗体的制备与双抗夹心 ELISA 检测方法的建立 57 表 1 包被抗体与酶标抗体最佳反应浓度的确定 Table1 OptimizationofthecoatedantibodyandHRPlabeledantibody 酶标抗体包被抗体 20μg/ml 10μg/ml 5μg/ml 2.5μg/ml (P) (N) P/N (P) (N) P/N (P) (N) P/N (P) (N) P/N 图 6 包被液的优化 Fig.6 Optimizationofcoatingbufer 封闭液的选择以封闭液为单一变量进行优化, 选择了产品化的酶标板稳定剂 3% 脱脂奶粉 1% BSA 和 3%BSA 分别对酶标板进行封闭结果显示四种封闭液的封闭效果相近, 由于 1%BSA 的 P/N 值略高于其他溶液, 因此确定其作为最佳封闭液 ( 图 7) TMB 底物作用时间的选择显色时间长短可能会对检测方法的灵敏度产生影响, 因此本研究对底物作用时间进行了优化根据 P/N 值的高低, 选择了底物作用 20min 为最优条件 ( 图 8) 双抗夹心 ELISA 法标准曲线的建立根据以上优化结果, 本研究建立了双抗夹心 ELISA 检测方法并绘制了标准曲线 ( 图 9) 该检测方法在 31.2 ~ 图 7 封闭液的优化 Fig.7 Optimizationofblockingbufer 1000ng/ml 之间线性范围较好 (R 2 =0.9934) 本研究测定出了该方法的最低检测限, 即用 PBS 溶液作为空白样本进行检测, 重复测定 20 次, 计算 A 450 的均数 M 和标准差 SD, 并将 M +2SD 值带入标准曲线, 计算出对应的浓度值经计算, 最低检测限为 2.6 ng/ml 3 讨论 2014 年在西非多个国家爆发的埃博拉病毒疫情曾经触动了全世界的神经虽然近两年人感染埃博拉病例鲜有报道, 但对该病毒的防控工作仍不能松懈在实验室检测方面, 该病毒的核酸检测和免疫学检测方

6 58 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 结论本实验制备出了抗埃博拉核蛋白的单克隆和多克隆抗体, 并对其结合区域进行了鉴定在此基础上, 通过对包被抗体与酶标抗体的浓度包被液封闭液以及 TMB 底物作用时间等条件的优化, 建立了双抗夹心 ELISA 方法该方法的最低检测限为 2.6ng/ml, 可用于 EBOVNP 的定量检测参考文献图 8 显色时间的优化 Fig.8 Optimizationofcolordevelopingtime 图 9 双抗夹心 ELISA 法标准曲线 (n=5) Fig.9 Standardcurveofsandwich ELISAasay(n=5) 法可以在生物安全 P3 级实验室中进行, 并且目前应用较为广泛 [18] PCR 检测容易造成假阳性, 恢复期患者在检测时也会有假阴性结果 [19] 但由于该病疫情易爆发于非洲等不发达地区, 因此非常有必要开发出操作简便设备简单能在现场快速检测 EBOV 的方法和试剂盒氨基酸序列高度保守的核蛋白是比较理想的检测目标物, 而本实验选择的 EBOVNP 在不同亚型的埃博拉病毒之间较为保守因此本研究以 EBOVNP 为检测目标物, 瞄准对埃博拉病毒进行快速定量检测这一目标, 建立了针对 EBOVNP 的双抗夹心 ELISA 检测方法本研究课题可作为我国防控埃博拉病毒的战略性技术储备, 为今后开发出快速检测试剂盒及试纸条奠定了基础, 并为埃博拉病毒病患者的治疗效果及预后监测提供工具 [1] 林祥梅, 韩雪清, 王景林. 外来动物免疫. 北京 : 科学出版社, LinXM,HanXQ,WangJL.ExoticAnimalDisease.Beijing: SciencePres, [2] PourutX,KumulunguiB,WitmannT,etal.Thenatural historyofebolavirusinafrica.microbesandinfection/institut Pasteur,2005,7(7 8): [3] LiY H, ChenSP. EvolutionaryhistoryofEbolavirus. EpidemiologyandInfection,2014,142(6): [4]MorikawaS,SaijoM,KuraneI.Curentknowledgeonlower virulenceofreston Ebola virus(in French: Connaisances actuelessurlamoindrevirulencedu virusebolareston). ComparativeImmunology,MicrobiologyandInfectiousDiseases, 2007,30(5 6): [5] 程颖, 刘军, 李昱, 等. 埃博拉病毒病 : 病原学致病机制治疗与疫苗研究进展. 科学通报,2014,59(30): ChengY,LiuJ,LiY,etal.Ebolavirusdisease:virology, pathogenesis,therapy,andvaccines.chinesesciencebuletin, 2014,59(30): [6] KnipeD M, HowleyP M. FieldsVirology. Philadelphia: LippincotWiliams&Wilkins,2006. [7]FauquetC,MayoM A,ManilofJ.VirusTaxonomy.London: Elsevier/AcademicPres,2004. [8]FelomannH,KlenkHD.MarburgandEbolavirus.Advancein VirusResearch,1996,47(2):1 52. [9]ShiW,HuangY,Suton SmithM,etal.A filovirus unique regionofebolavirusnucleoproteinconfersaberantmigrationand mediatesitsincorporationintovirions.journalofvirology,2008, 82(13): [10]WatanabeS,WatanabeT,NodaT,etal.Productionofnovel Ebolavirus likeparticlesfrom cdnas:analternativetoebola virusgenerationbyreversegenetics.journalofvirology,2004, 78(2): [11]WatanabeS,NodaT,KawaokaY.Functionalmappingofthe nucleoproteinofebolavirus.journalofvirology,2006,80(8):

7 2017,37(10) 刘俊伟等 : 抗埃博拉病毒核蛋白抗体的制备与双抗夹心 ELISA 检测方法的建立 [12]SulivanN,YangZY,NabelG J.Ebolaviruspathogenesis: implicationsforvaccinesand therapies. JournalofVirology, 2003,77(18): [13] DongS,YangP,LiG,etal.InsightintotheEbolavirus nucleocapsidasemblymechanism:crystalstructureofebolavirus nucleoproteincoredomainat1.8? resolution.protein& Cel, 2015,6(5): [14]KirchdoerferR,AbelsonD,LiS,etal.AsemblyoftheEbola virusnucleoprotein from a chaperoned VP35 complex. Cel Reports,2015,12(1): [15]DziubańskaPJ,DerewendaU,ElenaJF,etal.Thestructureof thec terminaldomainofthezaireebolavirusnucleoprotein.acta Crystalographica,2011,70(Pt9):2420. [16]LeungDW,BorekD,LuthraP,etal.Anintrinsicalydisordered peptidefrom EbolavirusVP35controlsviralRNA synthesisby modulatingnucleoprotein RNAinteractions.CelReports,2015, 11(3): [17]BeatyJD,BeatyBG,VlahosW G.Measurementofmonoclonal antibodyafinity by non competitive enzyme immunoasay. J ImmunolMethods,1987,l00(1?2):173?179. [18] 乔晋娟, 罗俊, 危宏平. 埃博拉病毒感染的实验室诊断方法研究进展. 科技导报,2015,33(1): QiaoJJ,LuoJ,WeiH P.Researchprogresonlaboratory diagnosisofebola virus infection. Science and Technology Review,2015,33(1): [19]TownerJS,RolinPE,BauschDG,etal.Rapiddiagnosisof Ebolahemorhagic feverby reverse transcription PCR in an outbreaksetingandasesmentofpatientviralloadasapredictor ofoutcome.journalofvirology,2004,78(8): PreparationofAnti ebolanucleoproteinantibodies andestablishmentofsandwichelisaasay LIUJun wei 1 CHANGRui heng 1 HUIPeng DONGShi shang WANGJin feng SUNBo 1 YANGCheng (1TianjinInternationalJointAcademyofBiomedicine,Tianjin ,China) (2SchoolofPharmacyNankaiUniversity,Tianjin ,China) Abstract Objective:Topreparetheanti Ebolanucleoproteinmonoclonalandpolyclonalantibodies,and establishamethodfordeterminingtheebovnucleoprotein.methods:therabbitsandmicewereimmunizedwith EBOV nucleoprotein forpreparingpolyclonaland monoclonalantibodies, respectively. Afteroptimized the conditions,suchastheconcentrationofantibodies,coatingsolutionandsoon,thesandwichelisa was established.results:thepolyclonalantibodiesandtwohybridomacellinesthatcouldproducemonoclonal antibodieswereprepared.theresultsofwesternblotshowedthatthebindingregionofbothpolyclonaland monoclonalantibodieswereinn terminal1~35aminoacidofthenucleoprotein.thesandwichelisa for detectingebovnucleoproteinhasbeenoptimized.thelinearrangeofdetectionwas31.2~1000ng/ml.and thelimitofdetectionwas2.6ng/ml.conclusions:thehighspecificpolyclonalandmonoclonalantibodiesof anti EBOV nucleoprotein were prepared. The quantitative method to detecting EBOV nucleoprotein was established. Keywords Ebolavirus Nucleoprotein Antibody SandwichELISA

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人

54 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 道 [14 16] 1~35 位氨基酸多肽 (EBOVNP1~35) 为上海吉尔生化公司合成 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 50%PEG1450 溶液 HAT 和 HT 选择性培养基均为 Sigma 产品

54 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 道 [14 16] 1~35 位氨基酸多肽 (EBOVNP1~35) 为上海吉尔生化公司合成弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂 50%PEG1450 溶液 HAT 和 HT 选择性培养基均为 Sigma 产品