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革赵
7 years ago
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1 第卷第期年月文章编号四川理工学院学报自然科学版! " #$ %&' $ $ $$ & $ $ & () ( (!" 人 $ 组轮状病毒结构蛋白 - 原核表达及其卵黄抗体效价的研究李丙超李再新胡卫东黄永生唐文才张智四川理工学院生物工程学院化学与制药工程学院四川自贡富顺县人民医院四川自贡 %% 摘 % 要为获得人, 组轮状病毒重组结构蛋白 < 及其高效价的卵黄抗体使用 <4 技术扩增 <, 片段并将其克隆到原核表达载体 7- 上形成重组质粒 7- < 将重组质粒转化基因工程菌 %: 898 用 /2 5<7 诱导 < 重组蛋白的表达通过包涵体纯化和蛋白复性后将 < 重组蛋白与弗氏佐剂混匀免疫产蛋鸡收集鸡蛋用水稀释盐析法纯化卵黄抗体 5 A 进一步应用 <, 85, 和点杂交技术分析该卵黄抗体的纯度效价和特异性结果表明在基因工程菌 %: 898 中能够实现 < 重组抗原的表达将重组抗原 < 免疫产蛋鸡提取纯化得到滴度为的抗 < 卵黄抗体且特异性的识别野生型, 组轮状病毒关键词人, 组轮状病毒 < 原核表达包涵体免疫卵黄抗体中图分类号 ( 文献标志码, 引言轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属其中人, 组轮状病毒是引起婴幼儿急性胃肠炎的最主要病原体可造成严重脱水甚至危及生命全球每年约有 ( 亿人发生轮状病毒腹泻并导致大约 - 万儿童死亡人, 组轮状病毒为双链, 病毒含有个分节段的基因片段共有种结构蛋白 < < < < < < 和种非结构蛋白 <5 < < < < 其中轮状病毒 < 蛋白是该病毒的一个重要的结构蛋白在激发机体体液免疫产生特异性抗体方面发挥极为重要的作用为此本研究拟通过原核表达获得轮状病毒 < 的重组抗原将纯化的重组抗原免疫产蛋鸡进一步应用水稀释盐析法提取分离高效价含抗 < 的卵黄抗体为轮状病毒感染性腹泻的靶向性药物研发奠定基础材料和方法材料与试剂基因工程菌株 %: 8 3 和 %: 898 以及原核表达质粒 7-6 均为四川理工学院化学制药实验室保存含野生型, 组轮状病毒诊断为血清型粪便样品和对照样品均由自贡某医院提供 7, 连接酶购于 9 公司 F7 1, 聚合酶限制性核酸内切酶 % 6 和 / 等购于 7 公司, 片段回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购于北京博大泰克公司 3 < 标记的兔抗鸡 5 A 弗氏完全佐剂弗氏不完全佐购于 / 公司 9 蛋白定量试剂盒购于 9 公司其余试剂均为国产分析纯含 < 全长序列的模板由北京中科院微生物研究所陈晓英老师收稿日期 ** 基金项目新疆生物资源基因工程重点实验室开放课题 ** 四川省战略新兴产业资助项目 ***+ 四川省教育厅项目 +,-- 作者简介李丙超.--* 男河北廊坊人硕士生主要从事发酵工程方面的研究 */ /

2 四川理工学院学报自然科学版 ))))) ))))))) 年月提供来源于, 组轮状病毒株 7 海蓝褐蛋鸡湖北省宜昌市种鸡厂购买方法 (( 引物设计及合成参考 $ 中, 组轮状病毒 < 的, 序列根据提供的 < 序列设计 < 原核表达引物在一对引物的 G 端加上和! 酶切位点 < 扩增引物序列如下下划线者为酶切位点上游引物 G 44,, ,,77,47 *,747,7 G 下游引物 G , 4,774 7* , G 为保证酶切效率酶切位点前加上了保护碱基引物由深圳华大基因公司合成预期扩增片段长度约为 (( < 的 <4 扩增与原核及真核表达载体构建取 < 全长, 序列作为模板 <4 扩增 < 基因扩增条件为变性. % 退火 % 延伸 / 共个循环凝胶电泳鉴定将 <4 产物按, 片段回收试剂盒说明书进行回收 5 和! 5 双酶切回收产物与同样经过双酶切处理的原核表达载体 7-6 进行连接重组质粒命名为 7- < 按常规方法酶切及 <4 鉴定重组质粒进行基因测序 (( < 重组蛋白的诱导表达将鉴定正确的重组质粒 7- < 转化 98 感受态细胞将转化后的菌在 89 固体平板培养基含卡那霉素过夜培养次日挑取单菌落接种于 /8 含卡那霉素的 89 液体培养基于 / 振荡培养过夜培养后按接种扩大培养待菌液值为 ( ;(- 时加入终浓度为 ( /2 5<7 诱导同时设不加 5<7 诱导或空载体相关对照! 后取样离心收集菌体 <, 电泳分析 (( 包涵体蛋白的洗涤与复性确定表达后扩大菌体培养离心收集菌体用 <9 重悬洗涤次按照菌体裂解液体积比 H 加入裂解缓冲液包含溶菌酶浓度为 / /8 的 <9 溶液冰浴! 采用次反复冻融法裂解菌体 / 离心 / 收集包涵体沉淀先用包含 ( 7 & 的 2 尿素洗涤包涵体沉淀一次 / 离心 / 收集沉淀用 2 尿素洗涤包涵体次离心收集沉淀并用含 - 2 尿素的 ( 27 % 缓冲液 3-( 按照 H 包涵体体积比溶解包涵体 / / 离心 / 收集上清液按照体积比进行尿素梯度透析复性初始透析液为含 2 尿素的 7 % 缓冲液 7 % 缓冲液配方 3 -( /2 7 % ( /2 7, /2 48 甘油 ' 然后逐步透析复性弃体积透析液加入新的等体积透析液透析! 共透析次最后用 <9 透析! 次 / 离心 / 收集上清液并应用 9 法和 <, 对复性的重组蛋白进行检测分析 (( 免疫产蛋鸡使用考马斯亮蓝法测定纯化蛋白浓度适当调节蛋白浓度初次免疫时使用完全弗氏佐剂与纯化 < 重组抗原完全混匀并充分乳化每只鸡免疫量为分别于初次免疫后第周加强免疫加强免疫时使用不完全弗氏佐剂免疫剂量为每次免疫均采用三点肌肉注射免疫初次免疫一周后每周收集鸡蛋一次保存备用 (( 卵黄抗体提取将蛋清与蛋黄分离将蛋黄上蛋清液去除干净按照卵黄超纯水为比例用超纯水稀释卵黄液混匀用冰醋酸调节卵黄稀释液 3 至 ( 静置! 或过夜次日下 / 离心 / 收集上清液缓缓加入 4 终浓度为 -(- 调节 <3 至静置! 下 / 离心 / 收集沉淀沉淀中加入 /8 3 重悬静置! / 低温离心 / 收集沉淀用超纯水溶解然后将溶液装入透析袋用超纯水透析 -! 并每! 换水一次将透析后的溶液在下 / 离心 / 收集上清液进行冷冻干燥即为纯化的 5 A 抗体成品并按 9 法进行蛋白定量 (( 85, 分析 5 A 滴度将纯化的 < 重组蛋白用包被液稀释至 / /8 85, 板每孔包被 8 过夜 <97 洗板次后加入终浓度为 / /8 的 9, 溶液每孔 8 室温封闭!<97 洗板次后加入不同稀释倍数的纯化 5 AH ;H 室温孵育!<97 洗板次加入 H 稀释的辣根过氧化物酶 3 < 标记的羊抗鸡 5 A 8 孔孵育!<97 洗板次加孔显色避光作用 / 每孔

3 第卷第期 )) 李丙超等人, 组轮状病毒结构蛋白 < 原核表达及其卵黄抗体效价的研究加入 8 / 83 终止液终止反应酶标自动分析仪 / 波长测定其光吸收值实验中设相应对照吸光度值倍以上为阳性标准测定抗体滴度的融合 < 蛋白相符且在 ; 条件下 < 主要以包涵体形式表达收集包涵体通过对包涵体的洗涤和梯度透析复性包涵体复性回收效率达到. 将回收的 < 分别经透析粗纯化及柱细纯化后能得 ((- <, 分析 5 A 抗体到纯度较高的 < 经过 <, 检测结果表明最分别取的 5 A 于个 < 管中分别加入变性后得到了纯度较高的 < 重组蛋白图 9 和非变性的蛋白电泳上样缓冲液通过 <, 电泳检测 5 A 纯度并应用 9 法对 5 A 进行蛋白定量分析 ((. & & 点杂交将含野生型, 组轮状病毒粪便粗提液诊断为血清型和对照腹泻粪便粗提液诊断为非轮状病毒腹泻用 <9 溶液按倍倍比稀释粗提液并用微量加样器点 8 于 4 膜上置恒温箱! 9, 室温摇床上封闭! 将纯化的 < 重组蛋白进行 <, 凝胶电泳利用蛋白电转移系统将蛋白转至 4 膜 9, 室温摇床上封闭! 加纯化的 5 A 抗体作一抗 H 室温作用! 或过夜 797 洗涤次每次 / 加入 H 稀释的二抗 3 < 标记的羊抗鸡 5 A 室温作用. / 797 洗涤次每次 /,9 显色结果 - 的 -53 扩增及其重组质粒的鉴定经 < 序列特异性引物 <4 扩增后出现约为片段图大小与预期相符将 < 克隆到, 2 中分子量标准蛋白 4 对照菌诱导前对照菌诱导后转化菌诱导前转化菌诱导后 9 2 中分子量标准蛋白纯化前纯化图 - 重组蛋白的诱导表达和纯化卵黄抗体 & 的提取与纯化按水稀释法粗提的卵黄抗体 5 A <, 电泳发现所提取的 5 A 水粗提取液 =: 中含有大量杂蛋白 =: 再经过 3 盐析和超滤纯化后其纯度提高在非还原状态下 5 A 左右左右的特征性条带图在还原状态下处可见清晰的条特征性条带分别是 5 A 的重链和轻链图最后定量结果表明卵黄抗体 5 A 的产量可达 - / /8 蛋黄纯度可达. 7- 载体上形成重组质粒 7- < 将重组质粒基因测序测序结果与预期结果一致图 - 基因 -53 扩增 - 重组蛋白的诱导表达与包涵体处理将鉴定正确的重组质粒 7- < 转化 %: 8 98 ( /25<7 诱导 <, 结果表明的融合蛋白图, 大小与预期 2 中分子量标准蛋白非变性条件下电泳变形条件下电泳图卵黄抗体 & -$'9 电泳图 $ ) - & 的滴度分析用间接 85, 方法检 < 特异性 5 A 的抗体效价

4 - 四川理工学院学报自然科学版 ))))) ))))))) 年月变化规律如图所示蛋鸡初免约周后蛋黄中可检测到特异性卵黄抗体加强免疫后特异性 5 A 效价呈明显的增长趋势第二次加强免疫后抗体滴度上升达到较高水平抗体滴度可达 H 并且在两次加强免疫后 5 A 能在较长的时间内保持较高的滴度也未得到理想的效果感染性腹泻时常反复发生造成该疫苗在发展中国家和地区难以得到普及限制了疫苗对引起腹泻的预防 * 卵黄抗体 5 A 及其鸡蛋易获得不能激活补体和胃肠道细胞 : 段受体对人体无毒副作用和可以阻止胃肠道病毒感染的优点现已成为消化道感染的一种很有前途的候选药物相对于常规治疗口服抗抗体均能显著缩短患儿的病程提高抗的能力 * 但是临床上在国内一直缺乏针对人高效价卵黄抗体的应用目前的抗卵黄抗体均以分离的全毒株为免疫原免疫产蛋鸡获得卵黄抗体但该抗体效价低试 < 实验免疫组对照组初次免疫第一次加强免疫二次加强免疫图抗 - 卵黄抗体的动态特征,)0+,) 点杂交以纯化的 5 A 作为一抗分析该卵黄抗体识别和结合病毒的能力结果如图所示将含病毒粗提液稀释到倍时制备的, & < 5 A 亦能检测到较强信号而对照样品检测不到信号表明免疫获得的 5 A 抗体具有识别和结合病毒抗原的活性验结果待发表制备过程需要病毒培养纯化和灭活等过程且制备过程技术要求高灭活不彻底散毒和病毒残存等风险如葛兰素史克公司生产的疫苗 & 因被检出动物病毒污染而于年被迫暂停使用相对于已有人, 组卵黄抗体的制备方法本文以人, 组的 < 为靶点通过基因工程技术实现了 < 重组抗原在基因工程菌中的大量表达并纯化出 < 重组抗原进而免疫产蛋鸡制备了成本低滴度高稳定性好且能特异性识别和结合野生型人, 组的 5 A 卵黄抗体为后期开展轮状病毒感染性腹泻的诊断治疗和预防用口服抗体药物制剂的开发奠定了基础参考文献讨论 4 临床检测不含轮状病毒的粗提物临床检测含轮状病毒的粗提物图 ) - & 点杂交结果人, 组衣壳蛋白 < 是一种能够结合钙离 (# 6, % " % # # #7 1 ' 1 +!# % */ - 0%% 6 %" %"#!" %! %# % ", * ' $ %# # ( 1 44 /3-3::* -399 : 0# #% 8 7! ; ; %# > #% 1, % " 子的糖蛋白通过低钙作用诱导病毒颗粒从三层同心圆的衣壳蛋白包被向二层同心圆衣壳蛋白包被转化与细胞表面的整合素受体和结合使黏附进入细胞因此将 < 作为药靶通过其抗体结合抑制病毒颗粒转化和细胞黏附抑制对婴幼儿小肠绒毛的感染是理想的选择之一虽然灭活疫苗已在澳大利亚墨西哥和巴西使用但后续临床观察表明此疫苗与发生肠套叠相关而停止在发展中国家可能是区域内婴幼儿遗传免疫发育和身体健康状况等差异临床试验 %# %" %"# # '1 " 6 ' 1 + " :.4 24*-4 9 姜琳琳张孝云马莉等基因工程抗体抗 &4 ' 5& 的制备及生物学活性研究中国药理学通报 -.:. :3:*:32 5" #% ;," 1$ #% 1 %' # % %* " "%#* $1 %# (0/ #"%1#!# % * % ' '%$ # % ( /3 339:*33 3 <I%#, # 0 ;, #% 1 (0/ # %# %#

5 第卷第期 )) 李丙超等人, 组轮状病毒结构蛋白 < 原核表达及其卵黄抗体效价的研究. +%# %!, % " # 7% +%#$ : % "$ #1 +%#$*8 $ %# ( /2.2:4*.29/ / 江保明杨晓明徐德启轮状病毒疫苗的现状和发展动向中国生物制品学杂志 *- : 2 0%#1 & 0"1 #% 1 ( %* "!% 7% # ## '# " #! # ;$1 # -.. :3- :9*:4 4 0%#1 %##1# & #%, #% 1,#1*7 1 %! % " % 0# % +!# % & -. :. *. (# 6, % " % # # #7 1 ' 1 +!# % /*3: 5" "$ 0 6 #% 1, % " ( $# % $# %# % 7% % *'1 $ " %* $# ( *44. - 陈六英黄雄七胡永红等抗组轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白的临床评价中国实用儿科杂志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

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽