2015,35(4) 龚隆财等 :ctni linker TnC 融合蛋白的原核表达及鉴定 49 免疫反应鉴定, 表明重组表达的 ctni linker TnC 融合蛋白具有较好的免疫原性, 保存了 ctni 和 ctnc 单体的天然结构, 有望成为天然 ctni TnC 复合物的替代物, 为下一步

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耿男窦
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2015,35(4):48 53 DOI: /j.cb ctni linker TnC 融合蛋白的原核表达及鉴定龚隆财罗镇明杨雁青王振宇向军俭 (1 暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室广州 ) 王宏 (2 广州市疾病与食品安全免疫学快速检测重点实验室暨南大学分室广州 ) 摘要从 PUBMED 中查找人心脏 ctni 和 ctnc 的 cdna 序列, 在两者之间加上 15 个中性氨基酸残基 (G4S)3 的 linker 编码序列, 并分别构建原核表达质粒 pet32a ctni linker TnC 和 pet28a ctni linker TnC, 转化入大肠杆菌表达菌株 BL21(DE3) 中, 用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG) 诱导其表达通过 SDS PAGE 电泳和间接 ELISA 对目的蛋白进行初步鉴定, 并优化表达条件以实现目的蛋白的可溶性高表达用标准抗 ctni 单克隆抗体和标准抗 ctnc 单克隆抗体对目的蛋白进行 Westernblot 鉴定和双抗体夹心 ELISA 鉴定, 同时用八位心肌梗塞患者血清做间接 ELISA 鉴定结果表明,cTnI linker TnC 融合蛋白在表达载体 pet32a 中实现了可溶性高表达, 最佳表达条件为 mmol/LIPTG 诱导表达 5h; 且融合蛋白具有较好的免疫原性, 保存了 ctni 和 ctnc 单体的天然结构, 有望成为天然 ctni TnC 复合物的替代物, 为下一步制备高特异性的抗 ctni TnC 复合物的单克隆抗体奠定了基础关键词 ctni linker TnC 融合蛋白原核表达双抗体夹心 ELISA 中图分类号 Q789 正常情况下肌钙蛋白 I(TnI) 和肌钙蛋白 T(TnT) 以及肌钙蛋白 C(TnC) 以三联体复合物的形式存在于肌原纤维细肌丝上, 是肌肉能量供应的重要调控蛋白由于心肌肌钙蛋白 I(cTnI) 特异性地存在于心肌组织中, 当发生心肌损伤时会释放入血, 由于它出现时间早, 持续时间长, 现已成为心肌细胞损伤的金标准 [1] 同时 AACC 认证的 ctni 参考校准物质由于采用 HyTest 公司专利直接从心肌组织提纯, 造成校准品成本较高, 且实际应用中使用效果也并不十分理想 [2] 研究表明, 不同因素会影响 ctni 的检测值, 包括翻译后修饰 ( 蛋白水解降解 [3], 磷酸化 [4] ), 与其他分子 ( 如肌钙蛋白 C [5], 肝素 [4] ) 形成复合物以及患者血清中循环的 [6] ctni 特异性自身抗体等并且由于不同检测方法中使用的抗体的抗原决定簇特异性不同,cTnI 的检测值可以相差 30 倍甚至更多 [7] 根据 HyTest 公司研究结果表明不可能找到一对抗体 ( 一个捕获抗体和一个检收稿日期 : 修回日期 : 广东省战略新兴产业核心技术攻关项目 (2012A ) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :wanghonghlj@yahoo.com.cn 测抗体 ) 完全不受所有已知的 ctni 修饰和干扰的影响现已证实, 心肌损伤早期患者血液中大部分 ctni(> 95%) 以二元 ctni TnC 复合物形式存在 [5,8], 所以制备针对 ctni TnC 复合物的特异性抗体有助于心肌损伤的早期诊断, 并且 HyTest 公司已经成功制备出针对 ctni TnC 复合物的特异性单克隆抗体并应用于 ctni 夹心免疫分析, 其灵敏度可达 0.01ng/ml, 远远高于传统的仅针对 ctni 单分子的夹心免疫分析方法由于天然的 ctni TnC 复合物容易受各种因素的影响而解聚 [9], 所以制备稳定的 ctni TnC 复合物替代天然复合物至关重要我们从 PUBMED 中查找人心脏 ctni 和 ctnc 的 cdna 序列 (NCBI 序列编号分别为 NM_ 和 NM_ ), 并在两者之间加上 15 个中性氨基酸残基 (G4S) 3 的 linker 编码序列 ( 即 ggtggtggtggtctggtggtggtggtctggtggtggtggtct), 构建 ctni linker TnC 融合蛋白的原核表达系统, 在大肠杆菌中成功实现了 ctni linker TnC 融合蛋白的稳定可溶性高表达经商品化的特异性抗 ctni 单克隆抗体和特异性抗 ctnc 单克隆抗体鉴定, 以及用心肌梗塞患者血清进行

2 2015,35(4) 龚隆财等 :ctni linker TnC 融合蛋白的原核表达及鉴定 49 免疫反应鉴定, 表明重组表达的 ctni linker TnC 融合蛋白具有较好的免疫原性, 保存了 ctni 和 ctnc 单体的天然结构, 有望成为天然 ctni TnC 复合物的替代物, 为下一步制备高特异性的抗 ctni TnC 复合物的单克隆抗体奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料表达载体 pet28a pet32a 和大肠杆菌 BL21 由本实验室保存 ; 小量质粒抽提试剂盒及 DNA 凝胶回收试剂盒购自 Axygen 有限公司 ;T4DNAligase DNA 标准分子量 marker 及快切酶 BamH I 和 HindⅢ 购自 TaKaRa 公司 ; 鼠源标准抗 ctni 的单克隆抗体 19C7 以及标准抗 ctnc 的单克隆抗体 7B9 购自 Hytest 公司 ( 货号分别为 Cat4T21 和 Cat4T27); 人源心肌肌钙蛋白 I (ctni) 标准品购自 Hytest 公司 ( 货号为 Cat8T53); 八位心肌梗塞患者血清购自暨南大学附属第一医院, 正常人血清由本文作者提供 ;Balb/c 小鼠购自南方医科大学动物实验中心 ; 异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG),HRP 标记的羊抗小鼠 IgG( 购自 SantaCruz Biotechnology,Inc. 货号为 sc 2005),HRP 标记的羊抗人 IgG( 购自 EarthOxLLC, 货号为 E ); 普通标准蛋白 marker 购自 Fermentas 公司 ; 其余所用化学试剂均为分析纯 1.2 方法重组 ctni linker TnC 基因的构建在 PUBMED 数据库中查找 ctni 和 ctnc 的 cdna 序列, 用一段柔性肽 (G4S)3 序列将两者连接起来, 并在其 N 端和 C 端分别引入酶切位点 BamHI 和 HindⅢ, 由华大基因人工合成此段重组序列, 插入质粒 puc57 simpe 中获得重组质粒 puc57 ctni linker TnC, 转化入大肠杆菌克隆菌株 DH5α 中重组表达载体 pet32a ctni linker TnC 和 pet28a ctni linker TnC 的构建及鉴定 Axygen 质粒提取试剂盒提取重组质粒 puc57 ctni linker TnC, 用内切酶 BamHI 和 HindⅢ 进行双酶切, 酶切产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定,Axygen 试剂盒回收琼脂糖凝胶中的 ctni linker TnC 基因片段用 BamH I 和 HindⅢ 双酶切表达载体 pet32a 和 pet28a, 在 T4DNAligase 体系中, 将 ctni linker TnC 基因分别插入表达载体 pet32a 和 pet28a 中, 构建重组质粒 pet32a ctni linker TnC 和 pet28a ctni linker TnC, 分别转化入感受态克隆菌株 DH5α 中涂固体培养基平板 ( 分别含 100mg/L 氨苄青霉素和 70mg/L 卡那霉素 ) 挑取单克隆, 在 LB 培养基中培养 10h, 提取重组质粒 pet32a ctni linker TnC 和 pet28a ctni linker TnC, 经双酶切后 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定, 并进行基因序列测定将鉴定正确的重组质粒分别转化入感受态表达菌株 BL21(DE3) 中, 用于诱导表达目的蛋白重组蛋白的表达及表达条件优化分别挑取含重组质粒 pet32a ctni linker TnC 和 pet28a ctni linker TnC 的 BL21 单克隆菌株, 接种至 LB 培养基中, 220r/min 37 培养 3h 使得菌体处于对数生长期, 用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG) 诱导表达在和 37 三个温度条件下, 分别加入终浓度为 0.1mmol/L 0.4mmol/L 0.7mmol/L 和 1 mmol/l 的 IPTG 诱导目的蛋白表达, 选择最佳诱导条件在诱导后 3h 5h 和 7h 测定 ctni linker TnC 融合蛋白的表达量, 确定最佳表达时间重组蛋白的纯化及鉴定 pet32a 作为载体表达的重组蛋白 N 端带有一个由 6 个 His 组成的标签, 可用 NTA 树脂进行亲和层析纯化用含 20,60,100,150, 300,500mmol/L 咪唑的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱, 收集洗脱液后超滤脱盐并测定融合蛋白的浓度将纯化后的融合蛋白用 12% 的 SDS PAGE 电泳进行鉴定和间接 ELISA 鉴定 ( 将不同浓度的融合蛋白用 ph9.6 的碳酸盐溶液包被于聚苯乙烯板孔内,4 过夜, 分别用商品化的抗 ctni 的单克隆抗体 19C7(8 万倍稀释, 融合蛋白包被浓度分别为 10,25,50,75,100, 125,150,175,200,250ng/ml, 包被 100μl) 和商品化的抗 ctnc 的单克隆抗体 7B9(4 万倍稀释, 融合蛋白包被浓度分别为 10,50,100,150,200,250,300,350, 400ng/ml, 包被 100μl) 作为一抗, 用辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗鼠 IgG 作为二抗 ; 同时用购买的标准 ctni 蛋白做阳性对照 (19C78 万倍稀释做为一抗, 包被浓度分别为 ng/ml, 包被 100μl) 和不含目的基因的空载体菌株诱导表达产物做阴性对照 ) 融合蛋白免疫原性的鉴定 (1)Westernblot 检测 1 未经纯化的重组质粒 pet32a ctni linker TnC 和 pet28a ctni linker TnC 表达的融合蛋白作为抗原, 商品化的单克隆抗体 19C7 和 7B9 作为一抗 ( 均为 1 万倍稀释 ),HRP 标记的羊抗鼠 IgG 作为二抗 (1 万倍稀释 ), 分别进行 Westernblot 检测

50 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No.

(2) 双抗体夹心 ELISA 检测用本实验室已经建立的双抗体夹心 ELISA 检测方法进行检测, 即用单克隆抗体 7B9 作为捕获抗体 (10μg/ml, 包被 100μl), 用 HRP 19C7 作为检测抗体 (1000 倍稀释 ), 加入不同浓度的融合蛋白溶液 (800,400,200,100,50,25,12.5, 6.25,3.

3 50 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No 重组质粒 pet32a ctni linker TnC 表达的融合蛋白, 经 Ni 离子亲和层析柱纯化后 300mmol/L 咪唑洗脱液作为抗原, 商品化的单克隆抗体 19C7 和 7B9 作为一抗 ( 均为 1 万倍稀释 ),HRP 标记的羊抗鼠 IgG 作为二抗 (1 万倍稀释 ), 分别进行 Westernblot 检测 ; 同时用购买的标准 ctni 蛋白作为阳性对照 (2) 双抗体夹心 ELISA 检测用本实验室已经建立的双抗体夹心 ELISA 检测方法进行检测, 即用单克隆抗体 7B9 作为捕获抗体 (10μg/ml, 包被 100μl), 用 HRP 19C7 作为检测抗体 (1000 倍稀释 ), 加入不同浓度的融合蛋白溶液 (800,400,200,100,50,25,12.5, 6.25,3.125ng/ml) 进行检测 ; 同时加入不含目的基因的空载体菌株诱导表达产物做阴性对照 (3) 心肌梗塞患者血清鉴定原核表达的融合蛋白作为抗原 (800ng/ml, 包被 100μl), 同时用购买的标准 ctni 蛋白作为阳性对照 (400ng/ml, 包被 100μl),8 位心肌梗塞患者血清作为一抗,HRP 标记的羊抗人 Ig G 作为二抗 (1 万倍稀释 ), 进行间接 ELISA 检测 ; 同时用正常人血清作为阴性对照 2 结果 2.1 重组表达载体 pet28a ctni linker TnC 和 pet32a ctni linker TnC 的鉴定 1% 琼脂糖凝胶电泳 ( 图 1) 结果表明, 重组质粒 pet28a ctni linker TnC 和 pet32a ctni linker TnC 经双酶切后成分均一且分子量正确经测序,DNA 序列完全正确 ( 测序结果略 ) 2.2 重组蛋白的表达 12% SDS PAGE 电泳结果 ( 图 2) 表明, 在同样的条件下, 重组质粒 pet32a ctni linker TnC 的可溶性表达量明显高于重组质粒 pet28a ctni linker TnC 的可溶性表达量图 2 融合蛋白 ctni linker TnC 在表达载体 pet32a 和 pet28a 中表达融合蛋白 ctni linker TnC 经重组质粒 pet32a ctni linker TnC 表达后的分子量约为 60kDa; 经重组质粒 pet28a ctni linker TnC 表达后的分子量约为 40kDa Fig.2 Theexpresionofthefusionprotein ctni linker TnCinthepET32a andpet28avectors,3:theexpresionofthefusionproteinctni linker TnC in recombinantvectorpet32a ctni linker TnC for3h,5h and 7h respectively;m:proteinmarker;4,5,6:theexpresionofthe fusionproteinctni linker TnCinrecombinantvectorpET28a ctni linker TnCfor3h,5hand7hrespectively 2.3 表达条件的优化通过优化重组表达载体 pet32a ctni linker TnC 的表达时间, 表达温度和诱导剂 IPTG 的浓度, 结果表明最佳表达条件为 mmol/LIPTG 诱导表达 5h ( 图 2 和图 3) 图 1 重组质粒 pet28a ctni linker TnC 和 pet32a ctni linker TnC 的酶切鉴定双酶切后目的基因大小为 1167bp Fig.1 Theidentificationofrecombinantvectors pet28a ctni linker TnCandpET32a ctni linker TnC M:1kb protein markerand DL2000 marker;1: Production of pet28a ctni linker TnC;2:ProductionofpET32a ctni linker TnC 图 3 融合蛋白 ctni linker TnC 在表达载体 pet32a 中表达温度和 IPTG 浓度的优化 Fig.3 Theoptimizationoftheexpresingtemperatures andconcentrationsofiptg inpet32a,3:theexpresionofctni linker TnCat25,28 and37 ; M:Proteinmarker;4,5,6,7:TheconcentrationofIPTG is0.1 mmol/l,0.4mmol/l,0.7mmol/land1mmol/l

2015,35(4) 龚隆财等 :ctni linker TnC 融合蛋白的原核表达及鉴定 51 2.

间接 ELISA 鉴定融合蛋白 ctni linker TnC 19C7 为抗 ctni 的单克隆抗体 ;7B9 为抗 ctnc 的单克隆抗体 ; 标准 ctni 作为阳性对照 Fig.5 TheidentificationofcTnI linker TnCbyindirectELISA 图 4 融合蛋白 ctni linker TnC 经 NTA 树脂纯化后 SDS PAGE 鉴定 Fig.

4 2015,35(4) 龚隆财等 :ctni linker TnC 融合蛋白的原核表达及鉴定重组蛋白的纯化及鉴定重组表达的融合蛋白 ctni linker TnC 经 NTA 树脂纯化后进行 SDS PAGE 鉴定 ( 图 4) 分别用抗 ctni 的单克隆抗体 19C7 和抗 ctnc 的单克隆抗体 7B9 做间接 ELISA 鉴定, 结果 ( 图 5) 表明融合蛋白 ctni linker TnC 很好地保存了 ctni 和 ctnc 单体的结构, 且阴性对照结果为阴性图 5 间接 ELISA 鉴定融合蛋白 ctni linker TnC 19C7 为抗 ctni 的单克隆抗体 ;7B9 为抗 ctnc 的单克隆抗体 ; 标准 ctni 作为阳性对照 Fig.5 TheidentificationofcTnI linker TnCbyindirectELISA 图 4 融合蛋白 ctni linker TnC 经 NTA 树脂纯化后 SDS PAGE 鉴定 Fig.4 ThepurificationofcTnI linker TnC byntacolumn M:Proteinmarker;1:150mmol/Limidazole; 2:300mmol/Limidazole 2.5 融合蛋白免疫原性的鉴定 Westernblot 检测结果 ( 图 6) 表明, 两种单克隆抗体 19C7 和 7B9 均能够与两种表达载体 pet32a 和 pet28a 表达的融合蛋白发生特异性免疫反应 ; 经 NTA 树脂纯化后的融合蛋白也可与两种单克隆抗体发生特异性反应 ( 图 7) 双抗体夹心 ELISA 实验结果 ( 图 8) 表明, 融合蛋白 ctni linker TnC 的检测限为 6~200ng/ml 图 6 融合蛋白 ctni linker TnC 在表达载体 pet32a 和 pet28a 中表达后的 Westernblot 鉴定 Fig.6 TheWesternblotidentificationofthefusionproteincTnI linker TnCinpET32aandpET28avectors (a)specificmonoclonalantibody(19c7)ofanti ctni 1:TheexpresionproductsofcTnI-linker-TnC-pET28a;2:Theexpresionproductsof ctni-linker-tnc-pet32a (b)specificmonoclonalantibody(7b9)ofanti ctnc 1:TheexpresionproductsofcTnI-linker-TnC- pet32a;2:theexpresionproductsofctni-linker-tnc-pet28a 心肌梗塞患者血清间接 ELISA 结果 ( 图 9) 表明, 当 OD 值为 1.0 且融合蛋白 ctni linker TnC 作为抗原时, 八位心肌梗塞患者血清稀释倍数分别为倍 ; 当 OD 值为 1.0 且标准 ctni 作为抗原时, 八位心肌梗塞患者血清稀释倍数分别为倍 ; 且正常人血清不反应 3 讨论现已证实, 心肌损伤早期患者血液中大部分 ctni (>95%) 以二元 ctni TnC 复合物形式存在 [5,8], 游离的 ctni 较少, 并且由于其 30~110 之间的肽段和 TnC 结合形成复合物而稳定, 但是其 N 端和 C 端未形成复合物的部分很容易被蛋白水解酶水解 [3] 由于 ctni 和 ctnc 在 Ca 2+ 离子的作用下有形成 IC 复合物的趋势 [10], 因此有的学者尝试在 Ca 2+ Mg 2+ 存在的条件下

5 52 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No 图 7 Westernblot 鉴定 300mmol/L 咪唑洗脱液 7B9 为抗 ctnc 的单克隆抗体 ;19C7 为抗 ctni 的单克隆抗体 ; 标准 ctni 作为阳性对照 Fig.7 TheWesternblotidentification ofthe300mmol/leluent 图 8 双抗体夹心 ELISA 检测融合蛋白 ctni linker TnC Fig.8 TheidentificationofcTnI linker TnC bydoubleantibodysandwichelisa [9] 非融合的 ctni 都不稳定而 Liu 等研究发现重组表达的 ScTnI C 和 ScTnI C 2 的稳定性得到了很大程度的提高 ( 它们在 2~8 条件下能够稳定保存 4 个月, 在 - 20 条件下至少能够稳定保存一年 ) 由于载体 pet32a 的前导序列中多了一段硫氧还蛋白标签 (Trx tag) 序列, 使得重组表达的融合蛋白 ctni linker TnC 在 pet32a 表达载体中的可溶性表达量远远高于在 pet28a 表达载体中的可溶性表达量. 所以我们选择了 pet32a 表达载体作为最佳表达载体并对其表达条件进行了优化但是从 Westernblot 结果 ( 图 6 和图 7) 可以看出, 未经 NTA 树脂纯化的表达产物未发生降解, 而经 NTA 树脂纯化的 300mmol/L 咪唑洗脱液则出现了降解, 且降解产物可以与抗 ctni 的单克隆抗体反应而不与抗 ctnc 的单克隆抗体反应, 说明此降解发生在亲和纯化过程中, 所以, 纯化条件有待进一步优化尽管我们已经成功地实现了融合蛋白 ctni linker TnC 的可溶性表达, 并且 ELISA 和 Westernblot 检测结果也表明我们表达的融合蛋白 ctni linker TnC 具有很好的免疫原性, 有望成为天然 ctni C 复合物的替代物但是由于 ctni 本身是一种由 5 个 α 螺旋构成的链状结 [12] 构而具有较强的可塑性, 且它在大肠杆菌原核表达载体中表达时由于缺乏真核细胞中所具备的翻译折叠系统, 所以, 重组表达的融合蛋白 ctni linker TnC 的空间构型可能存在较大差异, 而这种差异为我们制备多种针对 ctni C 复合物的特异性单克隆抗体奠定了基础参考文献 [1] 杨振华, 潘柏申, 许俊堂, 等. 中华医学检验分会文件. 心肌损伤标志物的应用准则. 中华检验医学杂志,2002,25(3):185. YangZH,PanB S,XuJT,etal.DocumentsofChinese Society of Laboratory Medicine. Application guidelines of 图 9 心肌梗塞患者血清间接 ELISA 反应鉴定 Fig.9 TheidentificationofcTnI linker TnC byindirectelisawiththeserum of myocardialinfarctionpatients 让分别重组表达的 ctni 和 ctnc 蛋白结合, 但结果发现这种结合稳定性差, 特别是在低浓度和有 EDTA 或 EGTA 存在的情况下很容易解离 [11] 所以, 游离的和 myocardial injury markers. Chinese Journal of Laboratory Medicine,2002,25(3):185. [ 2 ] Panteghini M. Standardization of cardiac troponin I measurements:thewayforwardclinicalchemistry.clinchem, 2005,51(9): [3]KatrukhaAG,BereznikovaAV,FilatovVL,etal.Degradation ofcardiactroponini:implicationforreliableimmunodetection. ClinChem,1998,44(12): [4]KatrukhaA,BereznikovaA,FilatovV,etal.Biochemicalfactors influencingmeasurementofcardiactroponiniinserum.clin

6 2015,35(4) 龚隆财等 :ctni linker TnC 融合蛋白的原核表达及鉴定 53 ChemLabMed,1999,37(11 12): [5]KatrukhaAG,BereznikovaAV,EsakovaTV,etal.TroponinI isreleased in bloodstream ofpatientswith acute myocardial infarctionnotinfreeformbutascomplex.clinchem,1997,43 (8Pt1): [6]EriksonS,HaleniusH,PulkkiK,etal.Negativeinterferencein cardiac troponin I immunoasays by circulating troponin autoantibodies.clinchem,2005,51(5): [7]DataP,FosterK,DasguptaA.Comparisonofimmunoreactivity offivehumancardiactroponiniasaytowardfreeandcomplexed formsoftheantigen:implicationsforasaydiscordance.clin Chem,1999,45(12): [8]WuAH,FengYJ,MooreR,etal.Characterizationofcardiac troponin subunitrelease into serum after acute myocardial infarctionandcomparisonofasaysfortroponintandi.clin Chem,1998,44(6Pt1): [9]LiuS,ZhangM Y,SongQ,etal.Recombinantsinglechain cardiactroponini Cpolypeptides:Superiorcalibrationandcontrol materialsforcardiactroponiniimmunoasays.clinlab,2001,47 (1 2): [10] 刘大彪, 张明明, 卢仁泉, 等. 重组人心肌 TnI TnC 复合物的特性及其初步应用. 放射免疫学杂志.2008,21(1): LiuDB,ZhangMM,LuRQ,etal.Characteristicpropertiesof recombinanthumancardiactni TnCcomplexanditsasay.Jof Radioimmunology.2008,21(1): [11] 黄应峰, 王英明, 朱乃硕. 人心肌肌钙蛋白 I 和 C 亚基的基因工程表达及两者的结合实验. 复旦大学学报,2004,43(2): HuangYF,WangYM,ZhuNS.TheexpresionofhumancTnI andctncine.coliandtheircombinationasay.journaloffudan University(Naturalscience).2004,43(2): [12]FerieresG,CalzolariC,ManiJC,etal.Humancardiactroponin I:preciseidentificationofantigenicepitopesandpredictionof secondarystructure.clinchem,1998,44(3): ProkaryoticExpresionandIdentificationofcTnI linker TnCFusionProtein GONGLong cai LUOZhen ming YANGYan qing WANGZhen yu XIANGJun jian WANGHong (1DepartmentofBioengineering,GuangdongProvinceKeyLaboratoryofMolecularImmunologyandAntibodyEngineering, JinanUniversity,Guangzhou ,China) (2GuangzhouKeyLaboratoryofDiseaseandFoodSafetyRapidTest,Guangzhou ,China) Abstract Theaim istoexpresand identifythefusion protein ctni linker TnC, and detectits immunogenicityforpreparationofmonoclonalantibodyofanti ctni TnC.AshortDNAsequencewhichcodes15 neutralaminoacidresidueswasusedtolinkctniandctnc.then,therecombinantprokaryoticexpresion vectorspet32a ctni linker TnC andpet28a ctni linker TnC wereconstructedtoexpresthefusionprotein ctni linker TnCbytransformedintoE.coliBL21celsrespectively.AndthefusionproteinscTnI linker TnC wereidentifiedby12% SDS PAGEandindirectELISAtest.Atthesametime,theconcentrationsoftheinducing agent,expresiontimesandtemperatureswereoptimizedtoobtainhighsolubletargetprotein.atlast,the commercialmonoclonalantibodiesofanti ctniandanti ctncwereusedtodothewesternblottestanddouble antibodysandwichelisa,andtheserum ofmyocardialinfarctionpatientswereusedtodotheindirectelisa. TheresultsshowedthatthefusionproteincTnI linker TnChasahighsolubleexpresion,andhasreservedits immunogenicitywel.thisindicatesthefusionproteinctni linker TnC mayreplacethenaturalctni TnC compoundinthefuture. Keywords ctni linker TnC Fusionprotein Prokaryoticexpresion DoubleantibodysandwichELISA

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌