* 北京大学学报 医学版 :3 73:09 ;: 9 8 ;:939;0 &35 * 提高乳腺癌细胞对抗微管生成药物的敏感性 & 研究还发现 ;3 的高表达与结直肠癌 乳腺癌等肿瘤的预后密切相关 是预后判断的潜在标志物 &&>&* 但 ;3 的生物学功能及其在肿瘤发生发展中的作用目

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1 北京大学学报 医学版 :3 73:09 ;: 9 8 ;:939;0 &35 * & 论著 抗! 3 单克隆抗体识别的抗原表位区域的确定 谢 玮 苏亚辉 刘彩云 寿成超 北京大学临床肿瘤学院 北京肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所生物化学与分子生物学研究室 恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室 北京 && * 摘 要 目的 确定已获得的多株抗突触蛋白 ;3 单克隆抗体识别的抗原表位区域 为相关后续研究奠定基础 方法 分别构建谷胱甘肽疏基转移酶 ; 与 ;3 不同截短体的表达载体并表达 ; ;3 截短体融合蛋白 采用 98:; 和 < 检测单抗与不同截短体融合蛋白的反应 推知不同单抗的抗原识别表位区域 依据推测的抗原识别表位的区域 构建并表达 ; 表位小肽融合蛋白 并用相应单抗进行 98:; 和 < 检测 确定单抗的抗原表位区域 结果 确定了 && 株 ;3 单抗的抗原识别表位区域 分别是 K *K 和 9 抗体的抗原表位位于 ;3 第 & 到 *& 位氨基酸 &&K 和 **K 抗体的抗原表位位于 ;3 第 (-/ * 位氨基酸 &K& K&-K&K 和 K 抗体的抗原表位位于 ;3 第 到 && 位氨基酸 - 抗体的抗原表位位于 ;3 第 &&&/&*( 位氨基酸 结论 确定了 && 株 ;3 单抗的抗原识别表位区域 为 ;3 的进一步研究和血清学检测奠定了基础 关键词 癌基因 抗体 单克隆 免疫显性表位 乳腺肿瘤 中图分类号 (* 文献标识码 文章编号 & (& & (* & ( &,& (& & (* *. :! ; 3! 3&! :9<;7 8:7 ; ; : && * ( (. 2 =!;?? ;3 ;3 ;?*9 9 ;3 ;3 = 98:; <? ;?*9 9 = 98:; <!!9 = ;3 = K *K 9 & *& ;3 &&K**K (- * &K& K&-K&K K && - &&& &*(! = ;3 : ;3 ;3,*-./ : 突触蛋白 ;3 最初是利用差异显示技术筛选出的在乳腺癌中特异表达而在正常乳腺组织中不表达的基因 因此又被命名为乳腺癌特异基因 & ; & & ;3 正常表达于脑和外周神经组织 近年的许多 研究表明 ;3 在乳腺癌 结肠癌 胃癌 肝癌和膀胱癌等多种肿瘤中均有异常表达 *> ;3 的过表达可以促进乳腺癌细胞的增殖和转移 ( 有研究报道 ;3 的高表达还可能与肿瘤细胞的耐药和凋亡抑制有关 -> 通过抑制 ;3 的活性可以 基金项目 国家高技术研究发展计划 - 计划 * * * 和国家重点基础研究发展计划 ( 计划 *.*&- 项目 ; 3 - * * * ; ( *.*&-!

2 * 北京大学学报 医学版 :3 73:09 ;: 9 8 ;:939;0 &35 * 提高乳腺癌细胞对抗微管生成药物的敏感性 & 研究还发现 ;3 的高表达与结直肠癌 乳腺癌等肿瘤的预后密切相关 是预后判断的潜在标志物 &&>&* 但 ;3 的生物学功能及其在肿瘤发生发展中的作用目前尚不清楚 本课题组前期工作应用杂交瘤技术制备获得了多株高特异性 高亲和力的抗 ;3 单克隆抗体 它们可应用于不同的免疫学方法 并且可检测内源性 ;3 && 本室前期对乳腺癌 结肠癌肿瘤患者的手术后组织标本中 ;3 表达水平与肿瘤患者的生存预后进行了详尽的研究 均表明 ;3 表达阳性患者的无病生存率和总生存率显著低于 ;3 表达阴性患者 而且 ;3 高表达患者术后复发的可能性也显著升高 应用所得的抗 ;3 特异单抗还建立了双抗夹心 98:; 法 证实了结直肠癌细胞培养上清及结直肠癌患者血清中存在 ;3 蛋白 但所获得的这些抗 ;3 单抗识别的抗原表位不清楚 因此本研究旨在对前期获得的 && 株 ;3 单抗识别的抗原表位进行较为系统的鉴定 确定各株单抗的表位分布 为更好利用 ;3 单抗进行进一步相关研究和血清学检测奠定基础 材料与方法 材料 质粒 菌株 单克隆抗体及其它分子克隆试剂 9 & ;3 质粒和 8*& 菌种由本室保 存 待测 ;3 单抗由本室保存 其中 &K K& K 和 **K 为培养杂交瘤上清液 &&K&-K K *K9 和 - 为含单抗的小鼠腹水 &K 为纯化抗体 ; 抗体和小鼠 : 由本室保存 B 3 聚合酶 各种限制性内切酶和 3 连接酶为 3 9 公司产品 凝胶 3 回收纯化试剂盒为 D: 93 产品 其余试剂均为进口分装或国产分析纯 ;3 截短体 引物及小肽寡核苷酸片段的设计及合成 根据 ;3 序列共设计了 个 ;3 截短体 图 & 其中 ;3&* 和 分别代表从 端去除 &(. 和 -- 个氨基酸残基的 ;3 截短体 ;33&* 和 分别代表从 3 端去除 *. 和 *& 个氨基酸残基的 ;3 截短体 根据设计的截短体分别设计引物扩增截短体 3 片段 表 & 上游引物设计添加 位点 下游引物设计添加 4( 位点 其中 ;3&* 和 共用上游引物 ;33&* 和 共用下游引物 依据不同单抗与不同 ; ;3 截短体融合蛋白的反应 推知其可能的识别表位区域 据此设计合成能编码 个候选 ;3 表位区域的小肽 &/*& (-/ * / && &&&/&*( 寡核苷酸片段 图 片段两端分别设计有 和 4( 的黏性末端 在 4( 位点上游设计插入 * 位点以便克隆的鉴定 表 & 引物及寡核苷酸片段均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 表 ;3 截短体 引物及小肽寡核苷酸片段的设计 ;3 3 B B B B.@@ ;3 ;3& ;3* ;3 ;33 ;33& ;33* ;33 & & * *

3 谢 玮 等 抗 单克隆抗体识别的抗原表位区域的确定 方法 ;3 截短体表达质粒的构建 以 9 & ;3 质粒为模板 通过 扩增 个 ;3 截短体 3 片段 产物经凝胶电泳后用 3 回收试剂盒进行纯化 纯化的 产物和 9 & 质粒同时分别用,4( 双酶切 片段和载体经 3 凝胶回收后进行连接并转化 8*& 感受态细菌 挑取克隆扩增培养后提取质粒 质粒 3 用,4( 进行酶切鉴定 并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序 ;3 小肽表达质粒的构建 分别取编码 ;3 小肽的寡核苷酸片段的正义链及互补的反义链各 * 加 * 至 8 -.I 水浴. 缓慢冷却至室温 取此退火产物 & 8 与经,4( 双酶切后回收的 9 & 载体连接 转化 8*& 感受态细菌 挑取克隆培养后提取质粒 3 用 * 酶切鉴定 并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序 ; 融合蛋白的表达 将测序正确的质粒转化 8*& 挑取单克隆于 8 8 E 培养基中 (I 振荡培养至 约 & 加入异丙基硫代半乳糖苷 : 至终浓度为.,8(I 诱导表达 I&*, 离心. 收菌 每 &8 细菌加入 &8 细菌裂解液 含溶菌酶 &,8 苯甲基磺酰氟 ; &, 8&A 体积分数 & 临用前用 ; 配制 将细菌悬浮后冰上放置 * 然后置冰上间歇超声裂解 *4 = 超声. 暂停 & 至菌液透亮不黏稠 然后 I&*, 离心 & 取上清对其中融合蛋白定量后 图略 进行后续实验 ;3 单抗的 98:; 检测 取含待测蛋白的细菌裂解上清用 98:; 包被缓冲液 &,8 - 的碳酸缓冲液 稀释至.,8 包被 孔板.8, 孔 室温包被 * 弃去蛋白包被液后 &A 体积分数 *, ; 洗 次 加入.A 质量分数 脱脂奶粉 &(8, 孔 I 封闭过夜 &A 体积分数 *, ; 洗 次后 分别加入浓度大致为 &,8 的不同 ;3 单抗.8, 孔室温反应 & 其中 &K& K 抗体用 &A 质量分数 ; 体积比 & & 稀释 K 和 **K 抗体 & * 稀释 &&K&-K *K9 和 - 抗体 & 稀释 &K 和 K 抗体 & & 稀释 同时以小鼠 : 和 ; 抗体 分别稀释至 &,8 作为阴 阳性对照 每个反应分别设 个平行孔 &A 体积分数 *, ; 洗 次后加入辣根过氧化物酶 标记羊抗小鼠 :.8, 孔室温反应. &A 体积分数 *, ; 洗. 次后 加入邻苯二胺 显色液 &8, 孔 室温避光显色 显色充分后加入 &*.A * ;.8, 孔终止反应 酶标仪测定 * ;3 单抗的 < 检测 取待测蛋白约. 进行 &*A 质量分数 ; ; 9 电泳结束后 &. 恒流转膜 &. 至硝酸纤维素膜 用.A 质量分数 脱脂奶粉室温封闭 分别与 质量 浓度约为 &,8 的 ;3 单抗在 I 反应过夜 抗体均用 &A 质量分数 ; 稀释 同时以小鼠 : 和 ; 抗体 分别稀释至 &,8 作为阴 阳性对照 &A 体积分数 *, ; 洗 次 ; 洗 * 次后 加 标记羊抗小鼠 : 室温反应. &A 体积分数 *, ; 洗 次 ; 洗 * 次后 使用化学发光法进行发光检测 结果 不同 ; ;3 截短体融合蛋白表达质粒的鉴定及表达构建的 9 & ;3 截短体质粒分别用,4( 双酶切进行鉴定 可见释放出的相应截短体 3 大小的片段 图 & 图 & 测序结果正确 图略 说明截短体融合蛋白表达质粒构建成功 质粒转化 8*& 细菌后用 : 诱导表达 ; 融合蛋白 并进行 ; ; 9 检测 可见有较大量的融合蛋白的表达 图 & 箭头所指处即为表达的相应融合蛋白 ;3 单抗与 ; ;3 截短体融合蛋白的反应检测用 98:; 检测不同 ;3 单抗 &K K&&K & K&-K**K&K K *K9 和 - 与不同 ; ;3 截短体融合蛋白的反应 图 * 与小鼠 : 相比 单抗 &K& K&-K&K 和 K 同 ;3& ;33&;33* 和 ;33 有反应 单抗 &&K 和 **K 同 ;3&;33* 和 ;33 有反应 单抗 - 同 ;33&;33* 和 ;33 有反应 而单抗 K *K 和 9 与不同蛋白的反应无明显差异 用 < 检测不同 ;3 单抗与不同 ; ;3 截短体融合蛋白的反应 图 * 可见单抗 K *K 和 9 与 ;3&;3* 和 ;3 有较特异的反应 其余单抗反应结果与 98:; 结果一致 与相应截短体融合蛋白有特异反应 由 98:; 和 < 的结果可推出各单抗

4 北京大学学报 医学版 :3 73:09 ;: 9 8 ;:939;0 &35 * 识别 ;3 的大致表位 分别为 K *K 和 9 抗体的抗原表位位于 ;3 第 &/*& 位氨基酸 &&K 和 **K 抗体的抗原表位位于 ;3 第 (-/ * 位氨基酸 &K& K&-K&K 和 K 抗体的抗原表位位于 ;3 第 /&& 位氨基酸 - 抗体的抗原表位位于 ;3 第 &&&/&*( 位氨基酸 图 * ;3 ;3&* ;33&* :? ;3 4( = 9? ;3 ; ; 9 47 &;3&*;3*;3 ;33&. ;33* ;33 图 不同 ; ;3 截短体融合蛋白表达载体的构建与表达? ;3?*9 ;3 小肽的质粒构建及表达 9 & 载体上有一个 * 位点 距多克隆位点约 &( 由于小肽寡核苷酸片段 4( 位点上游设计插入了一个 * 位点 因此用 * 单酶切时 9 & 空载体被切成线性单一片段 图 的 & 泳道 而构建的 9 & ;3 小肽质粒则释放约 &(. 片段 图 的 泳道 用 单酶切 9 & ;3 小肽质粒其表现为线性化的单一片段 图 的 泳道 从图 可知 编码 & * 和 小肽的寡核苷酸片段均已成功克隆入 9 & 载体 并且质粒测序结果正确 图略 用 ; ;3 小肽融合蛋白表达质粒转化 8*& 细菌后用 : 诱导表达 ; 小肽融合蛋白 并进行 ; ; 9 检测 从图 可见 构建的 种 ; 小肽融合蛋白均获得了较高表达 箭头所指处为表达的相应融合蛋白 相对分子质量约 * 不同单抗识别 ;3 抗原表位的区域确定用 98:; 检测不同单抗与相应表位的 ; ;3 小肽融合蛋白的反应 图 可见除 *K 和 9 反应稍弱外 其余单抗均可与相应表位区域的 ; ;3 小肽融合蛋白反应 在体系对照中 小鼠 : 与 ; 及 ; 融合蛋白均无反应 而 ; 抗体与 ; 和不同 ; 融合蛋白均有反应 图略 用 < 检测不同单抗与相应表位区域的 ; ;3 小肽融合蛋白的反应 图 可见各株单抗均可与相应表位区域的 ; ;3 小肽融合蛋白反应 图 中的 ; 抗体和小鼠 : 为 < 的阳性和阴性对照 图 中显示的不同单抗与 ;3 小肽的 98:; 和 < 检测结果 进一步确定了各株 ;3 单抗与 ; ;3 截短体融合蛋白的反应所提示的单抗识别位点所在的区域 图 * 即 K *K 和 9 抗体的抗原表位位于 ;3 第 &/*& 位氨基酸 &&K 和 **K 抗体的抗原表位位于 ;3 第 (-/ * 位氨基酸 &K& K&-K&K 和 K 抗体的抗原表位位于 ;3 第 /&& 位氨基酸 - 抗体的抗原表位位于 ;3 第 &&&/&*( 位氨基酸 讨论 是一类表达于神经组织和某些肿瘤中的可溶性小分子蛋白家族 包括 ;3 ;3 和 ;3 的异常表达与人类多种神经系统疾病密切相关 而 ;3 在多种肿瘤中均有异常表达 ;3 与 ;3 和 ;3 的同源性分别为. A 和. A 目前的研究表明 ;3 的异常表达与肿瘤细胞的增殖 侵袭 转移 以及耐药相关 (> 但是 ;3 的正常生物学功能仍不清楚 其与肿瘤发生发展的确切关系及机制也尚不明确 目前尚未见理想的商品化抗 ;3 抗体用于相关研究的报道 因此制备 ;3 特异性单抗并明确其抗原表位 对 ;3 的相关研究无疑具有重要意义

5 谢7玮等7抗 _, / 单克隆抗体识别的抗原表位区域的确定 (C?F( >WVX Y> _, (YQ!N, & ^. / YQ!N0>4 &\> _, (Y Q!N, & ^. / Y Q!N0>4 4_ ` 4 &!I. & YQ!N * & & * * a (4 _( -0>4 58Y Q!( 8&BY Q!( B&CY Q!( C&<Y QQ( 8&FY QQ( B&?YQQ( C&@NY I/ Y Q!N&ENYI5 图 &不同单抗与不同 NY I/ Y Q!N截短体融合蛋白的反应检测,./ 0&I. / YQ!N0 4 ( 0>4 ^.( -NY I/, (YQ!N, &

6 北京大学学报 医学版 :3 73:09 ;: 9 8 ;:939;0 &35 * &&>*& * (-> * >&& &&&>&*( 9 & & * * = = 9 & * = & ; & * ; ; 9 4& * ; & ; * ;. ; ; 图 ; ;3 小肽片段融合蛋白表达载体的构建与表达? ; ;3?*9 本室前期制备获得了多株高特异性 高亲和力的抗 ;3 单克隆抗体 它们可应用于不同的 ;3 免疫学检测方法 如 98:; < 免疫细胞化学 免疫组织化学和免疫沉淀 为进行 ;3 相关基础研究提供了有力的工具 为了进一步明确不同单抗与 ;3 的结合特点 拓展其应用领域 本研究对前期制备的 && 株 ;3 单抗的抗原表位区域进行了定位 我们首先设计构建了 个 ;3 截短体 图 & 通过相互的重叠片段 可将 ;3 大致分为 ( 个片段 采用 98:; 和 < 检测各株单抗与 ;3 截短体的反应 从而推知单抗识别 ;3 的大致表位 由于 家族蛋白结构上属于一类固有无序化蛋白 : & 没有明显的二级结构 因此所得到的抗 ;3 单抗所识别 ;3 表位应为线性表位 而不太可能有构象型表位 从以下各单抗在 98:; 和 < 结果的一致性上也 基本表明所得单抗识别 ;3 为线性表位 实验结果中 &K&&K& K&-K**K&K K 和 - 单抗在 98:; 和 < 检测中均能与相应的 ;3 截短体反应 从而可以明确地推知各个单抗识别表位的区域 但是 K *K 和 9 单抗与不同截短体的 98:; 反应都较弱 并且没有明显的差异 可能与单抗的性质和活性有关 < 能够清楚地检测到 K *K 和 9 单抗与 ;3&;3* 和 ;3 有反应而不与 ;33&;33*;33 反应 因此能够推知这三株单抗识别的位点位于 ;3 的 3 端 &/*& 位氨基酸 图 * 为了进一步明确抗体的抗原表位区域 本研究根据单抗与不同 ;3 截短体的反应情况 对推测识别的表位区域进行了重组表达 并通过 98:; 和 < 进行了进一步的验证 从而确定了不同单抗识别的 ;3 抗原表位区域 此外 我们还鉴定了前期用于双抗夹心法检测血清 ;3 的单抗 * && 发现 * && 单抗与 个截短体均有反应 图略 推测 * && 单抗识别的表位可能是 ;3 中的一些重复序列 & 或一些相似的基序 结构 最终确定需要有关实验的进一步验证 本研究通过单抗与不同截短体蛋白的反应分析和小肽片段的反应特异性锁定 确定了 && 株 ;3 单抗的抗原识别表位 分别位于 ;3 的 个片段 & /*& (- / * /&& &&& / &*( ;3 单抗识别表位的确定可以为 ;3 的相关研究 ;3 单抗的进一步应用及相关药物的开发提供重要信息 本室前期研究应用抗 ;3 单抗建立的双抗夹心 98:; 法检测了结直肠癌患者和正常人群血清中的 ;3 水平 研究结果提示血清 ;3 蛋白的检测可能有助于对结直肠癌的诊断及患者的预后判断 本研究确定了所获得的多株抗 ;3 单克隆抗体的抗原识别表位区域 可以为血清检测所用双抗夹心 98:; 选择配对抗体及条件优化提供有用的信息 双抗夹心 98:; 要求所用的包被抗体和酶标检测抗体能够识别同一抗原的不同表位 并且识别的抗原表位能够在空间构象上有一定距离而不会造成抗体结合位阻 这就需要对备选抗体的抗原识别表位进行鉴定 从而选择合适的抗体配对进行双抗夹心 98:; 本研究确定了多株已获得的抗 ;3 单克隆抗体抗原识别表位区域 其中 K *K 和 9 单抗识别表位位于 ;3 的 3 端 &/*& 其余 - 株单抗识别表位分别位于 ;3 的 端的 个区域 (-/ * /&& &&&/&*( 因

7 谢 玮 等 抗 单克隆抗体识别的抗原表位区域的确定 此 后续实验中可以尝试用 K *K 和 9 单抗与其余 - 株单抗配对组合进行双抗夹心 98:; 检测 ;3 建立血液中 ;3 水平的检测方法 以期可 ( 以为结直肠癌及其他肿瘤的早期诊断及预后评估提供新的方法 也可以为制定更为合理的治疗方案提供有价值的参考指标 98:; ;3 < ;3 图 不同单抗识别 ;3 抗原表位区域的确定 = ;3 已有研究发现 ;3 的异常表达与肿瘤细胞的耐药有一定的相关性 - 阻断或者抑制 ;3 的活性可以提高肿瘤细胞对肿瘤治疗药物的敏感性 & 本室前期已制备获得了多株抗 ;3 单克隆抗体 后续可以深入探讨抗 ;3 单克隆抗体对 ;3 活性及功能的影响 在明确单抗对 ;3 具有抑制活性的基础上 结合本研究对单抗表位的鉴定结果有助于确定 ;3 的活性中心 进而可以为设计 ;3 活性抑制分子进行靶向治疗提供参考和依据 参考文献 & : ; & 3 B 5 & (.( (. >( * 5 ; : 5 *(&*& &* >&. D C D? 5 ;*- & & * >& * 8 8 << 8 5 *.. &((.>(. C <8 8 < 5 : 5* *-.&-&>&-- 4 ; ;3 ;& ;& 83*? 3 5 : 5 *-&*&* *( ->*-( ( ; 5 &. ( *>( ( - C = < : ; ***((-..>. 8< * *&(.(>.&. & ; 02C 5 ; 5 *( (* * > && 8 5 D *-* && ->&.- &* < 2D C < C 9? 4 5 *(&&*. > * ( & < 5 * & &.> *( & 5 5 **&&> * 收稿 本文编辑 王 蕾

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