贾 园等 甲型 /3 流感病毒 /0 基因在昆虫细胞中的截短表达 # 共编码至少 种蛋白 许多研究已经证实 血凝素 /0 是流感病毒最重要的表面抗原 /0 含有 ( 个结构域 信号肽 胞浆区 跨膜区和胞外区 本实验设计去掉 /0 信号肽 跨膜域和胞内域个结构域的基因序列 通过昆虫杆状病毒表达系统表达

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1 中国生物工程杂志! 甲型 流感病毒 基因在昆虫 细胞中的截短表达 贾 园 沈 阳 邱亚峰 史子学 邵东华 王晓杜 邓绪芳 王皓婷 赵福广 马志永 中国农业科学院上海兽医研究所 上海 ( 吉林农业大学 长春 ) 摘要 目的 利用 "" * * +,-. 表达重组 /0 蛋白 1 及 0 方法鉴定其表达 方法 采用 方法扩增 0 2 ( #/3 /0 基因 将其克隆到 - /40 载体上 重组质粒 - /4"/0 经双酶切及测序鉴定正确后 转化阳性重组载体进入 5/ 感受态细胞中 通过 *" 蓝白斑筛选 鉴定获得重组转座子 6"/0 从重组转座子中提取 6"/0 质粒 530 转染 2# 昆虫细胞 制备重组杆状病毒 重组杆状病毒感染 2# 细胞表达重组蛋白 1 及 0 鉴定重组蛋白表达情况 结论 成功构建了甲型 /3 流感病毒 /0 基因的昆虫杆状病毒表达载体 该表达载体转染昆虫细胞后制备的重组杆状病毒病毒滴度较高 重组杆状病毒表达的重组蛋白经 1 及 0 鉴定后具有良好的免疫反应原性 关键词 甲型 /3 "" * * +,-. /0 中图分类号 78!) # 年 ( 月 墨西哥 美国相继爆发甲型 /3 流感 甲型 /3 流感病毒是猪 禽 人流感病毒发生重配后的新毒株 虽然世界卫生组织于 年! 月宣布甲型 /3 流感大流行已经结束 但是它仍有局部流行现象 据 年 月 ) 日英国卫生防护局的最新报道 英国自入冬以来已有 (& 人死于甲型 /3 # 流感病毒 年 月 日至 年 月 日 据 )8 个国家 地区及地域的流感中心统计数据显示 有 ) ) 样本显示流感病毒阳性 其中 8&9&: 是由 0 型流感病毒引起的 对 0 型流感病毒亚型分析显示!(9: 由甲型 /3 毒株引起 0 / 3 仅引起 &98: 因此建立快速 有效的诊断方法仍然是研究的重点 ( 杆状病毒表达载体系统 #! 由. 等建立 收稿日期 " " 修回日期 "!" 转基因生物新品种培育科技重大专项 # $! % 上海市科技兴农重点攻关项目 沪农科攻文 # 第 & % 号 资助项目 通讯作者 电子信箱 ' 首次利用苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 0 ;3 成功表达人 " 干扰素 现已被广泛用于表达外源蛋白质 现在应用广泛的是 "" +,-. 它基 & 于 ## 年 * 等改良的细菌体内转座的方法 后来商业化 杆状病毒表达系统不仅可用于表达外源蛋白 现已成功地用于表达如人类乳头瘤病毒 * -- * / 的 * " - ) 以及丙型肝炎病毒 人类严重急性呼吸综合症冠状病毒 * * - 6 *.. 8! 轮状病毒等的 杆状病毒表达系统已被广泛用于表达病毒样颗粒 但是在表达异源病毒方 # 面很少见 8 年 3 6 等通过 "" +,-. 成功地表达了禾谷缢管蚜病毒 - -* -6 * 这一发现同样为其他病毒在杆状病毒表达系统中的表达提供了理论与实践依据 杆状病毒表达系统具有良好的应用前景 甲型 /3 流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属 是单股负链 30 病毒 基因组由! 个 30 片段组成

2 贾 园等 甲型 /3 流感病毒 /0 基因在昆虫细胞中的截短表达 # 共编码至少 种蛋白 许多研究已经证实 血凝素 /0 是流感病毒最重要的表面抗原 /0 含有 ( 个结构域 信号肽 胞浆区 跨膜区和胞外区 本实验设计去掉 /0 信号肽 跨膜域和胞内域个结构域的基因序列 通过昆虫杆状病毒表达系统表达其重组蛋白 以期获得具有生物活性的重组蛋白 为进一步建立流感病毒的诊断方法奠定基础 材料与方法 材 料 5/& 菌种 本室保存 5/ 菌种购自 公司 - /40 载体质粒购自 公司 -;5"! 4 载体购自大连宝生物工程公司 ( 530 连接酶 限制性内切酶均购自 4 公司 2# 细胞 童光志研究员惠赠 2#. ;< = * * ; 6* 购自 < > 公司 2 购自 公司 质粒提取试剂盒购自天根生物工程公司 530 胶回收试剂盒 预染蛋白质 ; 购自中晶生物公司 显影液定影液 0 蛋白浓度检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所 2 * '0 /3. * # / * 0 6 购自北京义翘神州生物技术有限公司 / 抗体购自中国科学院 + 发光试剂盒购自 公司 方 法 9 9 引物的设计与合成 根据 < 发表的 0 2 ( # /3 ( * /0 的序列 用 - &9 软件设计含有 和 酶切位点 下划线部分 的上 下游引物 扩增 /0 基因 上游引物 &?<<<0044< <4040 <<4404? 下游引物 &?004<0<4<< <44<044? 引物由英俊生物有限公司合成 9 9 /0 基因 扩增 0 * 2 9& 634 9) 上游引物 9 下游引物 /0530 模板 66/ >& 混匀 反应条件 # A 预变性 #(A (& &&A (& 8 A 循环 & 次 8 A 终延伸 8 产物经 : 琼脂糖电泳分析 切胶回收 9 9 重组 - /40"/0 载体的构建 /0 基因和 - /40 质粒分别用 和 双酶切消 化 酶切产物用少量 530 片段纯化回收试剂盒纯化 回收目的片段和载体片段 回收产物用 4( 530 连接酶连接 转化大肠杆菌 5/& 挑取单菌落克隆提取质粒进行酶切鉴定 并测序确认 9( 重组杆状病毒载体的构建 从阳性克隆中提取 - /40"/0 质粒转化到含有 6 和 - 质粒的大肠杆菌 5/ 感受态细胞中 通过 *" 蓝白斑筛选 挑取白色单菌落克隆 提取重组 6 6 质粒 然后用 6 的上 下游引物 -B ; 进行 鉴定 筛选出阳性克隆 9 9& 重组杆状病毒的构建 碱裂解方法提取阳性克隆中的 6"/0530 按照 公司 "" * * +,-. 技术手册 将 6"/0 530 和 2 混合 接种于处于对数生长期的 2# 昆虫细胞 8 A& 后 弃去原混合物 然后加入含有 :. 的 < = * * ; 6* 8 A 继续培养 直到 8&: 的细胞出现病变后 收获培养基和细胞 & 离心 & 上清即为原代毒种 ( A 避光保存备用 将 毒种在 2# 昆虫细胞上继续扩大培养 次后即为 鉴定毒种滴度 并将毒种于 %! A 保存备用 4 5& 法测定病毒滴度 ) 的细胞加入 #) 孔板 待细胞长满后 倍比稀释病毒 """ 取各稀释度病毒液 分别加入各孔 8A 作用 弃去培养液及病毒 换上新鲜培养基 8A 培养 8 后观察病变状况 统计计算病毒的滴度 9 9) 重组蛋白的表达与鉴定 1 鉴定 取 病毒感染 2# 细胞 ;> C& 8 A 培养 8 后收获细胞 离心去上清 6 * 2 重悬细胞 煮沸 &.5." 0<+ 电泳 取下聚丙烯酰胺凝胶 采用 )& 恒压 将凝胶上的蛋白湿转印至硝酸纤维膜上 封闭液室温封闭 相同样品分两组 一组用终浓度 D 的 /0 单抗 另一组用终浓度 D 的 / 单抗 室温孵育 4.4 洗涤次 加入 D& 的羊抗鼠 < 二抗 室温结合 4.4 洗涤次 显色 9 98 间接免疫荧光检测重组 /0 蛋白 将 2# 细胞接种于 ( 孔板中 密度为 & 待细胞贴壁后 感染重组杆状病毒 8 后以!: 冷丙酮固定 一抗用 2 * ' 0 /3. * # / * 0 6 二抗用羊抗小鼠 4 标记的荧光抗体 在正置荧光显微镜下拍照

3 中国生物工程杂志 9 39 实验结果 目的基因的克隆 0 2 ( # /3 /0 基因全长 8 - 以人工合成的 -B&8"/0 为模板用特异性的引物进行 扩增 仅扩增 /0 的胞外区 & - E&!8 - 序列 大小为 & ) - 产物经 : 琼脂糖电泳 在约 & - 附近可见特异性条带 图 * 重组杆状病毒载体构建将重组质粒 - /4"/0 转化到 5/ 中 通过庆大霉素 卡那霉素 四环素种抗性和 *"< 蓝白斑筛选得到阳性单菌落克隆 提取质粒 用特异性引物 -B ; 通过 鉴定重组杆状病毒 530 图 图 扩增 基因!"#$ %&% ; /0 重组载体 ' # '" 的构建载体质粒 - /40 和 -;5"!4"/0 同时用 和 双酶切消化 回收约 & - 的 /0 目的片段 将目的片段与载体进行连接 转化感受态 5/& 提取质粒酶切鉴定 得到与预期片段相符的酶切片段 图 测序结果表明构建的载体是正确的 图 * 鉴定重组杆状病毒 + *,%&# $ "'# &$%"( &'&# '"!)-! +. ; /4" / /4 6 ; / 昆虫细胞的转染将重组杆状病毒转染昆虫细胞 8 后 观察细胞病变 如图 ( 所示 相对于未感染病毒的对照组 感染病毒的细胞有明显病变 变大 变圆 还有部分细胞发生脱落 将所获 重组杆状病毒感染 2# 细胞扩增 4 5& 方法测定 重组杆状病毒的滴度为 8 图 / 重组质粒 '"( 转染 $0 细胞病变 / '& $%"# &$ $0 "%)1 # '"( 6"/0 2 3 图 ' # '" 双酶切鉴定 % %&# $ "'# &$%"( &'&# )' ( ' # '" ; /4"/06 6 " - /46 6 " ; % #%& )# 鉴定重组 蛋白的表达 代重组杆状病毒感染 2# 细胞 8 后 收集细胞制样 进行 1 分析 一抗分别为 / 抗体与 /0 抗体 二抗为羊抗小鼠 < 以野生杆状病毒表达的蛋白作为对照 如图 & 结果显示 分别用两种抗体作用 在 )) 5 大小均有一个特异性条带 证明重组杆状

4 贾 园等 甲型 /3 流感病毒 /0 基因在昆虫细胞中的截短表达 病毒表达了 /0 蛋白 间接免疫荧光重组杆状病毒感染细胞 8 后!: 冷丙酮固定后 一抗用 /0 抗体 显微镜下照相 图 ) 由结果可见 绿色代表重组 /0 蛋白 证明重组杆状病毒表达重组 /0 蛋白 * 讨 论 图 % #%& )# 检测重组 蛋白的表达 % %#%"# &$% % &$%"( &'&# #% &. % #%& )# /0- 本实验通过对人工合成的 /0 基因进行 扩增 获得 & ) - /0 胞外区基因序列 成功地将该基因构建到杆状病毒穿梭载体上 制备的重组杆状病毒感染 2# 昆虫细胞后 经 0 及 1 鉴定均有重组 /0 蛋白的表达 为检测方法的建立奠定了基础 血凝素 /0 是流感病毒最重要的表面抗原 /0 可以与细胞表面的特异性受体结合 它与宿主细胞表面 图 重组 蛋白鉴定,%&# $ "'# &$%"( &'&# #% & 50 6 * * 0"/ 受体的唾液酸残基末端的结合 调节病毒和细胞膜的融合 /0 含有 ( 个结构域 信号肽 前导序列 胞外区 跨膜区和胞内区 本研究以 0 2 ( #/3 的 /0 序列为模板 去掉 /0 的信号肽 跨膜区和胞内区 仅扩增只有 & ) - 大小的 /0 部分片段 编码 & 个氨基酸残基 预测蛋白大小约为 &8 5 我们选择性地表达 /0 的胞外区蛋白 包括 /0 和 /0 两部分 二者以二硫键相连 /0 是病毒主要的抗原决定区和受体结合位点 /0 与病毒囊膜与宿主细胞膜的融合有很大的关联 /0 作为主要诱导中和抗体产生的抗原 在机体免疫反应中起重要的作用 所以我们选择该区段进行表达 为检测流感病毒抗体提供抗原 昆虫杆状病毒表达系统用于表达重组蛋白具有诸多优点 周期短 "" * * +,-. 只需 周即可完成重组杆状病毒的分离与纯化 蛋白表达水平高 表达的重组蛋白可进行翻译后修饰 如糖基化修饰等 表达出具有生物活性重组蛋白 用于进行蛋白结构与功能的研究 杆状病毒是专一性的昆虫病毒 与其他种属之间的种属差异极大 操作安全 昆虫杆状病毒表达系统现已广泛用于生物制药 基因工程及疫苗的研究当中 具有重要的应用价值 本实验利用昆虫杆状表达系统成功地表达了甲型 /3 的 /0 蛋白 经 1 鉴定在约 )) 5 大小的位置可见特异性条带 截短 /0 蛋白编码 & 个氨基酸残基 预测蛋白大小约为 &8 5 但在昆虫杆状表达系统中 昆虫细胞对蛋白质表达后修饰加工的方式与哺乳动物细胞接近 能识别并正确地进行信号肽的切除及磷酸化 糖基化等反应 故表达的蛋白约 )) 5 大小 间接免疫荧光结果也证明重组蛋白已经在昆虫细胞中表达 该重组蛋白的表达对甲型 /3 流感诊断方法的建立与防治具有重要意义

5 中国生物工程杂志 9 39 参考文献 - 6 -! 6, - - * 3 3 )1 2 * - ) * * ' *-6 < * (. <+ ;.* ;5 ; * 2 * - 6 * 6 * - 6 #! () &!("&# & * 0. < * * * " " * * - - 6! ## )8!(&))"(&8# ) / - 5; +2 2 * " * -- - ) 6! * 6 ' 6 6 ( )( 8&8"8)& 8 / / * 0 2* * - 6 * " - - * (!! "!!! 0 / 0 0 ;6 * " - - 6* * *,- 2 * * * 8!!8&"!#( # * * ",- 6 6 * 2 * -6 8! 8 # #"# (& 秦爱建 崔冶中 * 等 禽白血病病毒 亚群囊膜蛋白 基因的克隆和表达 病毒学报 8&("&# 7 0 * * 2 8&("&# /*. * * ' 2 2* - * ##& & )&" 8(. * * * 6 * 2 / * 3 < 1 < / 0 6 4, 2 2 * ' 6. 6 ##! &(")( '"!)-! % &$!&"'#% %&%$2,&$)!%&"%3! 0 *./+3 7 B "2./ ",*./0>5 "* /0> *" * ;0 ". * * * * * B *! #'"# > 6,- /0 - * "" * * +,-. 4,- 2 / ; ( #/3/ * 6 - / /4"/ ' 6 6 * /4"/0 * * 2 6 5/ - 4 6"/ *" * 6 -* # 4 * 6 2 2# # 2 6 * * 6 6 ' , * 4,- 6 2,- 0 /3 2 * * /0 * * * 6 4 -,- 6 * * 2 6 2# * 6 /0 - ' /02 # /3 2 * ' * 4%. 1 0 /3 2 * ' * "" * * +,-. /0

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