42 山东科学 2013 年导向治疗是一种有望代替化疗的新的治疗手段, 应用免疫毒素或导向毒素是实现导向治疗的一个重要的发展方向, 通过特异性抗体或细胞因子激素等与毒素连接, 前者作为导向部分即配体, 可以引导分子到达肿瘤部位并与肿瘤细胞表面过量表达的该种受体结合 ; 后者作为毒素部分, 即杀灭

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1 山东科学 SHANDONG SCIENCE 第 26 卷第 2 期 2013 年 4 月出版 Vol.26No.2Apr.2013 DOI: /j.isn 重组人促性腺激素 - 铜绿假单胞菌外毒素 A 蛋白的可溶性表达纯化和对肿瘤细胞的抑制活性郭凯, 赵晓燕, 周红姿, 陈凯, 李纪顺, 陈泉, 杨合同 ( 山东省科学院中日友好生物技术研究中心, 山东省应用微生物重点实验室, 山东济南 ) 摘要 : 以人促性腺激素 - 铜绿假单胞菌外毒素 A 衍生物 (GnRH PE39KDEL) 为研究对象, 根据大肠杆菌密码子偏好性优化, 通过基因合成的方法获得重组蛋白核酸序列, 连接至 pet 24b 载体中, 并转化入大肠杆菌 BL21(DE3) 及 BL21( DE3)plyS 中进行诱导表达结果显示, 在含有 2mg/mL 葡萄糖的 LB 培养基中 37 培养至 OD 600 约为 0.6h, 加入 0.2mmol/LIPTG 在 30 诱导 2h 后, 重组蛋白可以实现可溶性高表达工程菌经超声波破碎高速离心后, 经镍柱纯化和脱盐后得到重组蛋白, 蛋白纯度达到 95% 以上, 蛋白最终得率在 2.6mg/g 菌体重组蛋白经 IC 50 检测, 可以较好地抑制肿瘤细胞株的生长关键词 : 人促黄体激素释放激素 ; 绿脓杆菌外毒素 A; 可溶性表达 ; 表达菌株中图分类号 :Q753 文献标识码 :A 文章编号 : (2013) SolubleexpressionandpurificationofGnRH PE39KDELandthe inhibitiontotheactivityofatumorcel GUO Kai,ZHAO Xiao yan,zhou Hong zi,chen Kai,LIJi shun, CHEN Quan,YANG He tong (ShandongProvincialKeyLaboratoryofAppliedMicroorganism,BiotechnologyCenter, ShandongAcademyofSciences,Jinan250014,China) Abstract Weobtainedful lengthnucleicacidsequenceofanrecombinantimmunotoxinofgnrhandpe39kdelbygene synthesisbasedonthee.colicodonbias.factorxarestrictionsitewasinsertedatthectermanolofgnrh PE39KDELto obtionpet 24b GnRH PE39KDELrecombinatedplasmidwhichwasthenconvertedintoE.coliBL21(DE3)andBL21 (DE3)plyS.Resultsshow thatrecombinantimmunotoxinexhibitshigh levelsolubleexpressionafter0.2mmol/liptg inductionat30 for2hinlbmediawith0.2% glucosetilod 600 isacquiredat37 forabout0.6h.thepurityoffusion proteinisabove95% andtheproteinyieldisabout2.6mg/gaftersonication,high speedcentrifugation,histrapcolumn purificationanddesalt.ic 50 detectionindicatesthattherecombinantproteincansignificantlyinhibitthegrowthoftumorcel strains. Keywords GnRH;PE39KDEL;solubleexpression;expressionstrain 收稿日期 : 基金项目 : 国家重大新药创制科技重大专项 (2009ZX ); 山东省科技发展计划 (2012GSF12114); 山东省科学院博士基金 ( ) 作者简介 : 郭凯 (1982-), 男, 博士, 助理研究员, 研究方向为生物化学与分子生物学通讯作者, 杨合同 (1966-), 男, 博士, 研究员, 研究方向为应用微生物 yanght@sdas.org

2 42 山东科学 2013 年导向治疗是一种有望代替化疗的新的治疗手段, 应用免疫毒素或导向毒素是实现导向治疗的一个重要的发展方向, 通过特异性抗体或细胞因子激素等与毒素连接, 前者作为导向部分即配体, 可以引导分子到达肿瘤部位并与肿瘤细胞表面过量表达的该种受体结合 ; 后者作为毒素部分, 即杀灭肿瘤细胞的部分部分免疫毒素, 如 OVB3 PE IgG HD37 dga IgG RFB4 dga B3 PE40 LHRH PE40 等已进入临床观察,DAB389 IL 2 ( 商品名为 ONTAC) 已通过 FDA 批准上市, 显示出良好的疗效 [1] 绿脓杆菌外毒素 A 属于单转移酶家族, 将 NAD + 的 ADP - 核糖基转移至底物使其 ADP - 核糖化 [2-3] 绿脓杆菌外毒素 A(PEA) 的分子量为 66.0kD, 主要功能结构域包括 :DomainIa(AA1 252), 与受体识别的结合的结构域 ;DomainIb(AA );Domain I(AA ),Domain I 与毒素从细胞膜外到细胞内的跨膜转运相关 ;Domain I(AA ),Domain I 和 Ib 共同组成催化 ADP - 核糖化的催化结构域在真核细胞内, 绿脓杆菌外毒素 A 催化蛋白质延长因子 eef 2ADP, 使其发生核糖基化作用从而丧失活性, 最终阻断细胞内的蛋白质合成, 导致细胞的死亡 [2-3] 人促性腺激素释放激素 (GnRH) 做为重组蛋白的导向部分, 能够和癌细胞表面表达的 GnRH 受体特异性结合大量实验表明,GnRH 受体在某些癌细胞表面高度表达, 而相应的正常细胞表面该受体几乎不表达 [4-5] 有文献报道 PE 毒素的 AA 缺失后,PE 的活性会大幅度提高 [6] ; 此外, 将 PE 末端 5 个氨基酸 REDLK 突变为 KDEL 后, 也会使其活性大幅度提高 [7] 所以本文选取 PEA 衍生物 PE39KDEL 作为靶向抗肿瘤蛋白的毒素部分目前文献报道的 PEA 衍生物的相关基因工程蛋白中, 都是以包涵体形式表达 [8-9], 纯化后需要进行蛋白质复性操作, 然而蛋白质的复性过程较为繁琐, 且无法保证蛋白质的天然活性构象 [10-11] 本文通过表达载体的构建和后期表达优化, 最终得到可溶性表达的蛋白 GnRH PE39KDEL 前体, 经一步纯化后蛋白纯度达到 95% 以上, 蛋白最终得率在 2.6mg/g 菌体, 解决了 GnRH PE39KDEL 重组蛋白无法可溶表达的难题, 为进一步工业化生产奠定了基础 1 材料与方法 1.1 材料质粒和菌株大肠杆菌 DH5α BL21(DE3) 和 BL21(DE3)plysS 为本实验室保存菌种, 质粒 pet 24b 购自 Navogen 公司, 基因 GnRH PE39KDEL 和相关引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成试剂 PfuTaqDNA 聚合酶购自天为时代 ; 限制性核酸内切酶 T4DNA 连接酶及 DNAMarker 购自 TaKaRa 公司 ;IPTG 购自罗氏 ; 蛋白质中等分子量 marker 卡那霉素凝胶电泳回收试剂盒购自生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司 ;HisTrapHP( 通用电器生命科学部 ); 其它为国产分析纯试剂仪器 PCR 仪 :Bio RadMyCycler 温度梯度 PCR 仪电泳及成像 :Bio Rad 和 G BOX 紫外凝胶成像系统蛋白质纯化及电泳 :GE 公司的 AKTApurifier 亲和层析系统,Bio RadSDS PAGE 垂直电泳系统 1.2 方法 GnRH PE39KDEL 基因的获得依据大肠杆菌密码子偏好性优化 GnRH PE39KDEL 核酸序列, 通过基因合成的方法, 获得全长序列, 由上海鼎国生物技术有限公司合成 pet 24b GnRH PE39KDEL 载体的构建和鉴定

3 第 2 期郭凯, 等 : 重组人促性腺激素铜绿假单胞菌外毒素 A 蛋白的可溶性表达纯化和对肿瘤细胞的抑制活性 43 含 GnRH PE39KDEL 全长的 Puc57 的 DH5α 大肠杆菌经质粒回收试剂盒提取完整质粒作为 PCR 模板设计的正向引物含有蛋氨酸起始密码子及 Nde I 酶切位点,pET 24b Forward:5 ggaatc CATATGGAACACTGGTCTTACGGTC; 反相引物中引入 FactorXa 蛋白酶切割位点及 EcoRI 酶切位点,pET 24bReverse:5 ccggaattcgcgaccttccaccagttcgtctttcggcgg 用 NdeI 和 EcoRI 限制性内切酶双酶切 PCR GnRH PE39KDEL 回收产物和质粒 pet 24b, 两者按摩尔比 5 : 1 混匀, 使用 T4DNA 连接酶 4 连接过夜连接产物 1μL 转化到大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中, 涂布于含卡那霉素的琼脂糖平板上,37 培养过夜, 挑取单克隆摇菌, 提取质粒比较重组 DNA 分子量大小, 限制性内切酶 PCR 鉴定后进行重组质粒的测序, 将阳性克隆命名为 pet 24b GnRH PE39KDEL DH5α pet 24b GnRH PE39KDEL 表达载体转化及在不同大肠杆菌中诱导表达条件的优化将鉴定后的 pet 24b GnRH PE39KDEL 表达载体转入制备好的感受态细胞株 BL21(DE3) 和 BL21 (DE3)plysS 中, 分别记为 pet 24b GnRH PE39KDEL DE3 和 pet 24b GnRH PE39KDEL plyss 诱导温度诱导剂浓度及诱导时间 : 挑取 pet 24b GnRH PE39KDEL DE3 单菌落于 20mL 含有 100μmol/L 卡那霉素的 LB+0.2mg/mL 葡萄糖液体培养基,37 180r/min 过夜培养, 按 4% 的接菌量转接至 50mL 含有 100μmol/L 卡那霉素的 LB+0.2mg/mL 葡萄糖培养基中,37 180r/min, 继续培养 3h 至 OD 600 为 0.6, 加入异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG) 至终浓度 mmol/L, 分成 2 组, 分别于 r/min 培养 5h, 每 1h 取样一次菌液 12000g 离心 2min, 使用 1 loadingbufer 重悬菌体,99 保温 4min,12000g 离心 2min 后 -20 保存待用宿主菌优化 : 挑取 pet 24b GnRH PE39KDEL DE3 和 pet 24b GnRH PE39KDEL plyss 单菌落于 20mL 含有 100μmol/L 卡那霉素的 LB+0.2% 葡萄糖液体培养基,37 180r/min 过夜培养, 按 4% 的接菌量转接至 50mL 含有 100μmol/L 卡那霉素的 LB+0.2mg/mL 葡萄糖培养基中,37 180r/min, 继续培养 3h 至 OD 600 为 0.6,IPTG 至终浓度 0.2mmol/L, 分成 2 组, 于 r/min 培养 5h, 每 1h 取样一次菌液 12000g 离心 2min, 使用 1 loadingbufer 重悬菌体,99 保温 4min,12000g 离心 2min 后 -20 保存待用变性 SDS PAGE 电泳分析配制 12mg/mL 的分离胶和 5mg/mL 浓缩胶, 进行 SDS PAGE 电泳分析蛋白表达 GnRH PE39KDEL 融合蛋白的大量表达和初纯品的制备接种单克隆 pet 24b GnRH PE39KDEL plyss 含有 100μmol/L 卡那霉素的 LB+0.2mg/mL 葡萄糖液体培养基中 r/min 过夜培养, 按 5(V/V) 接菌量接种种子液至 500mL 含有 100μmol/L 卡那霉素的 LB+0.2mg/mL 葡萄糖液体培养基中, 约 2.5hOD 600 升为 0.6 时, 降温至 30 加入 IPTG 至终浓度 0.2mmol/L, 诱导重组蛋白表达 2h, 高速离心收集菌体, 按照菌体和破碎缓冲液 (50mmol/LTrispH=8.0, 0.5mol/LNaCl,5% Glycerol,20mmol/LImidazole)1 : 5(V/V) 的比例重悬菌体, 超声波破碎, 高速离心后收集上清加入 1μg/mLDNase 和 RNase 及 1mmol/LMgCl 2, 经 0.22μm 过滤膜过滤利用 GEAKTApurifier 系统平衡层析柱后, 使用上样泵将样品加载入亲和层析柱上 ( 流速 4mL/min, 柱压 0.3MPa) 使用上样缓冲液(50mmol/LTrispH=8.0,0.5mol/LNaCl) 冲洗层析柱至 UV 280 达到平衡调节洗脱缓冲液 (50mmol/LTrispH=8.0,0.5mol/LNaCl,500mmol/LImidazole) 的体积至 10% (50mmol/LImidazole), 洗脱结合在层析柱中的杂蛋白, 设定 UV 收集提高洗脱缓冲液体积比至 50%(250mmol/LImidazole), 最后使用 100%(V/V) 洗脱缓冲液清洗层析柱 [12-13] 层析柱平衡后保存至缓冲液中, 将各组分进行 SDS 电泳分析活性检测收集对数期细胞 A549, 调整细胞悬液浓度, 每孔加入 200μL, 铺板使待测细胞调密度至 10 3 ~10 4 个 / 孔

44 山东科学 2013 年体积分数为 5% 的 CO 2,37 孵育, 至细胞单层铺满孔底 (96 孔平底板 ), 加入浓度梯度的药物, 孵育 16~48h 每孔加入 20μL5mg/mL 的 MTT 溶液, 继续培养 4h 终止培养, 小心吸去孔内培养液每孔加入 150μL 二甲基亚砜 (DMSO), 置摇床上低速振荡 10min 在酶联免疫检测仪 490nm 处测量各孔的吸光值 2

4 44 山东科学 2013 年体积分数为 5% 的 CO 2,37 孵育, 至细胞单层铺满孔底 (96 孔平底板 ), 加入浓度梯度的药物, 孵育 16~48h 每孔加入 20μL5mg/mL 的 MTT 溶液, 继续培养 4h 终止培养, 小心吸去孔内培养液每孔加入 150μL 二甲基亚砜 (DMSO), 置摇床上低速振荡 10min 在酶联免疫检测仪 490nm 处测量各孔的吸光值 2 结果 2.1 pet 24b GnRH PE39KDEL 重组表达载体质粒的鉴定使用单克隆菌落回收的质粒经 PCR 单酶切双酶切结果证实 ( 图 1), 在 pet 24b GnRH PE39KDEL 载体中含有正确插入的重组蛋白核酸序列琼脂糖电泳结果显示在 1.2kb 处有特异目的条带, 提取重组质粒后使用 BamHI EcoRI 进行双酶切, 在 5.3kb 和 1.2kb 处获得 2 个片段经生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司正反向测序后, 核酸序列与合成的重组蛋白核酸序列一致图 1 重组质粒 pet 24b GnRH PE39KDEL 构建的琼脂糖凝胶电泳图 Fig.1 ElectrophoreticanalysisofcolonyPCRproductsenzymaticdigestion 2.2 pet 24b GnRH PE39KDEL 表达产物的初步鉴定及表达条件的优化融合蛋白表达含有 395 个氨基酸残基, 理论分子量为 42.8kD 重组菌株中总蛋白经 SDS PAGE 电泳显示在 35~45kD 处有一明显的目的条带, 同时在 0.2mmol/LIPTG 诱导浓度下, 蛋白表达达到最大值, 增加 IPTG 并未增加诱导蛋白表达量 ( 数据未列出 ) 在温度诱导条件下,37 蛋白表达量较 30 明显增高, 但是为包涵体表达形式,30 时蛋白以可溶形式表达故使用 30 进行重组蛋白大量生产在 IPTG 诱导下, 重组蛋白在 BL21(DE3)plysS 中 2h 达到最大表达量, 而在 BL21(DE3) 此过程需要 4h( 图 2) BL21 (DE3)plysS 带有的 plyss 质粒编码 T7 噬菌体溶菌酶, 可以极大或完全抑制诱导剂 (IPTG) 加入前的重组蛋白的非诱导表达, 而重组蛋白在菌体生长中的痕量表达有可能对 IPTG 诱导的蛋白过程起到一定的反馈抑制作用, 这可能是 BL21(DE3)plysS 表达重组蛋白速度更快的原因使用 ImageProPlus 对 SDS PAGE 的结果分析显示, 重组蛋白表达量占总蛋白的 30%(w/w) 左右, 占可溶蛋白的 40%(w/w) 以上

第２期郭凯等重组人促性腺激素铜绿假单胞菌外毒素Ａ蛋白的可溶性表达纯化和对肿瘤细胞的抑制活性４５Ｍ蛋白Ｍｋ取样时间分别为０２４５９１７ｈ图２ｐＥＴ２４ｂＧＲＨＰＥ３９ＫＤＥＬ在ＥｃＢＬ２１ＤＥ３和ＥｃＢＬ２１ＤＥ３ｐｙＳ重组ＳＤＳＰＡＧＥ电泳图Ｆｇ２ＳＤＳＰＡＧＥｙｆｃｍｂ

３中可见在２５３０ｋＤ有宿主蛋白条带在后续的纯化过程中这些非特异性吸附蛋白被去除掉数据未列出样品流经ＨＴｐｈｐｂ５０ｍｍＬｍｄｚ洗脱下的非特异性吸附的杂蛋白ｃ２５０ｍｍＬｍｄｚ洗脱下的重组蛋白ＧＲＨＰＥ３９ＫＤＥＬｄ５００ｍｍＬｍｄｚ冲洗柱子Ａ重组蛋白经ＡＫＴＡＰｕｆ纯化过程图３

5 第２期郭凯等重组人促性腺激素铜绿假单胞菌外毒素Ａ蛋白的可溶性表达纯化和对肿瘤细胞的抑制活性４５Ｍ蛋白Ｍｋ取样时间分别为０２４５９１７ｈ图２ｐＥＴ２４ｂＧＲＨＰＥ３９ＫＤＥＬ在ＥｃＢＬ２１ＤＥ３和ＥｃＢＬ２１ＤＥ３ｐｙＳ重组ＳＤＳＰＡＧＥ电泳图Ｆｇ２ＳＤＳＰＡＧＥｙｆｃｍｂｔｐｔｆｐＥＴ２４ｂＧＲＨＰＥ３９ＫＤＥＬＥｃＢＬ２１ＤＥ３ｄｅｃＢＬ２１ＤＥ３ｐｙＳ２３重组蛋白纯品的制备经过ＨＴｐ亲和层析柱纯化得到的蛋白纯度约为９０使用脱盐柱缓冲液置换后去除了小分子量的蛋白和一些线性蛋白蛋白纯度达到９５以上见图３蛋白纯化过程中存在一些可以和镍柱亲和吸附的宿主菌蛋白在图３中可见在２５３０ｋＤ有宿主蛋白条带在后续的纯化过程中这些非特异性吸附蛋白被去除掉数据未列出样品流经ＨＴｐｈｐｂ５０ｍｍＬｍｄｚ洗脱下的非特异性吸附的杂蛋白ｃ２５０ｍｍＬｍｄｚ洗脱下的重组蛋白ＧＲＨＰＥ３９ＫＤＥＬｄ５００ｍｍＬｍｄｚ冲洗柱子Ａ重组蛋白经ＡＫＴＡＰｕｆ纯化过程图３重组蛋白纯化过程与ＳＤＳＰＡＧＥ电泳结果Ｆｇ３ＰｕｆｃｔｆｃｍｂｔｐｔＧＲＨＰＥ３９ＫＤＥＬ２４质谱鉴定重组蛋白氨基酸序列取蛋白样品２００μｇ溶于５０μＬ含有８ｍＬｕ１０ｍｍＬＤＴＴ５０ｍｍＬＮＨ４ＨＣＯ３的溶液中置３７Ｃ水浴中还原４ｈ然后加入５μＬ０５ｍＬ碘乙酰胺放置暗处１ｈ进行烷基化加２５０μＬ５０ｍｍＬ

6 46 山东科学 2013 年 NH 4 HCO 3 溶液将尿素稀释到 1mol/L 以下, 最后加入 5μg 的胰蛋白酶 37 保温反应 16h, 取出后冷冻干燥成粉末, 用流动相 ( 体积分数 0.1% 的甲酸水溶液 ) 复溶至 200μL 待测使用 Agilent 串联快速分离液相型四极杆飞行时间质谱 (RRLC Q TOF) 鉴定, 肽段和数据库比较得出, 此蛋白含有正确的 PEA66 蛋白序列由于重组蛋白是一种毒性蛋白, 在大肠杆菌中是否表达, 是否表达全长序列需要检测通过质谱分析并结合 SDS 电泳分析发现, 在宿主菌中重组蛋白得以表达并且可以全长正确表达, 结果图 4 所示 2.5 重组蛋白对肿瘤细胞 A549 的增值抑制效果本实验室前期得到的包涵体蛋白复性后的活性检测结果表明, 包涵体复性蛋白活性明显低于可溶性表达的重组蛋白同时包涵体复性过程不仅增加了操作步骤和生产成本, 同时由于操作步骤过多降低了蛋白的得率实验结果 ( 图 5) 显示可溶性表达重组蛋白对于肺癌细胞株 A549 的增殖有很好的抑制作用, 经计算 IC 50 所需要的重组蛋白浓度为 20.70μg/mL, 相对应的包涵体复性蛋白浓度为 μg/mL 由此可见可溶性表达的重组蛋白具有很好的抑制肿瘤细胞增殖的作用 2.6 讨论目前以 GnRH 或其衍生物为导向部分, 以绿脓杆菌外毒素 A(PE) 的截短形式及其衍生物为毒素部分的靶向治疗剂已经有报道 [14] 这种靶向治疗剂是利用 GnRH 受体在某些肿瘤细胞表面过量表达的现象, 用融合蛋白中的 GnRH 部分与过度表达 GnRH 受体的肿瘤质谱检测到的肽段以黑体标注, 肽段覆盖率为 15% 图 4 重组蛋白质谱检测 Fig.4 MSdetectionofrecombinantprotein A. 前体 GnRH PE39KDEL B. 包涵体前体 GnRH PE39KDEL 复性图 5 GnRH PE39KDEL 浓度 - 生长抑制率曲线 Fig.5 ConcentrationgrowthinhibitionratecurveofGnRH PE39KDEL 细胞表面的 LHRH 受体产生特异性的结合, 然后将其毒素部分 PE 衍生物导入肿瘤细胞, 同时对正常细胞作用较少或无影响与传统的肿瘤治疗方法相比 GnRH PE 衍生物的靶向性治疗以其特异性和高效性而占有无可争辩的优势 [15-17] 在已有的 PE 类衍生物的重组蛋白报道中, 重组蛋白以包涵体形式表达, 这为后期蛋白复性和工业化生产带来很多问题本研究构建的 pet 24b GnRH PE39KDEL BL21(DE3)plysS 能够实现重组蛋白的可溶性表达, 在对重组蛋白表达条件进行初步优化后, 利用 AKTApurifier 系统可以获得纯度达 95% 以上的目的蛋白, 蛋白最终得率在 2.6mg/g 菌体并且通过 IC 50 检测, 证实了前体蛋白良好的毒杀肿瘤细胞活性本实验通过工程菌株的筛选和优化表达纯化工艺, 得到了一套较为成熟和简便的 GnRH PE39KDEL 纯化流程, 为后续工业放大生产奠定了可靠的基础参考文献 : [1]AQEILANR,KEDARR,BEN YEHUDAHA,etal.Mechanismofactionofinterleukin 2(IL 2) Bax,anapoptosis inducing chimaericproteintargetedagainstcelsexpresingtheil 2receptor[J].BiochemJ,2003,370(Pt1): [2]YATESSP,MERRILLAR.AcatalyticloopwithinPseudomonasaeruginosaexotoxinAmodulatesitstransferaseactivity[J].J

7 第 2 期郭凯, 等 : 重组人促性腺激素铜绿假单胞菌外毒素 A 蛋白的可溶性表达纯化和对肿瘤细胞的抑制活性 47 BiolChem,2001,276(37): [3]ARMSTRONGS,YATESSP,MERRILLAR.InsightintothecatalyticmechanismofpseudomonasaeruginosaexotoxinA[J]. Biochem,2002,277(48): [4]PATID,HABIBIH R.Inhibitionofhumanhepatocarcinomacelpro liferationbymammalianandfishgonadotropin releasing hormones[j].endocrinology,1995,136(1): [5] 罗海波, 朱平, 李兰娟. 细菌毒素与临床 [M]. 北京 : 人民卫生出版社,1999: [6]TAUPIACM P,BEBIENM,ALAMIM,etal.AdeletionwithinthetranslocationdomainofPseudomonasexotoxinAenhances translocationeficiencyandcytotoxicityconcomitantly[j].molmicrobiol,1999,31(5): [7]PASTANIH,FITZGERALDDJ.Recombinantpseudomonasexotoxinwithincreasedactivity:US, [P] [8] 朱海兵, 黄轶, 曾昭淳.F3 重组毒素的克隆表达及纯化 [J]. 科技导报,2009,27(12): [9] 朱海兵, 黄轶, 曾昭淳.F3 PE40 基因的克隆表达及纯化 [J]. 生物学杂志,2010,27(4): [10] 钟晓力, 黄华梁. 假单孢菌外毒素 A 的介绍 [J]. 生物学通报,2000,35(9): [11] 祁志荣.PE 类重组免疫毒素的研究进展 [J]. 微生物学免疫学进展,2006,34(1): [12]BORNHORSTJA,FALKEJJ.Purificationofproteinsusingpolyhistidineafinitytags[J].MethodsEnzymol,2000,326: [13]CROWEJ,MASONEBS,RibbeJ.One steppurificationofrecombinantproteinswiththe6xhistagandni NTAresin[J].Mol Biotechnol,1995,4(3): [14] 李树民, 李咏梅, 冯书章, 等.EGF PE35KDEL 嵌合毒素对 Hela 细胞的毒性作用 [J]. 中国肿瘤生物治疗杂志,2005,12 (02): [15]H 罗尔伯布姆 - 加尔斯基,A 本 - 耶胡达,A 内楚施坦, 等. 应用嵌合毒素诊断癌症的方法 : 中国, [P] [16] 聂李亚, 马素永, 文美玉. 一种能特异杀死肿瘤细胞的基因工程重组蛋白 : 中国, [P] [17] 聂李亚, 马素永, 金美玉. 高效低毒的系列功能蛋白 : 中国, [P]

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌