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汗炜韩
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1 山东科学 SHANDONG SCIENCE 第 31 卷第 1 期 2018 年 2 月出版 Vol.31 No.1 Feb.2018 DOI: / j.issn 中药与天然活性产物正交试验法优选痛利舒颗粒水提工艺杨龙飞 1 ꎬ 丁晓彦 2 ꎬ 高燕 2 ꎬ 国锦 1 ꎬ 孙启慧 1 2 ꎬ 赵渤年 (1. 山东中医药大学 ꎬ 山东济南 ꎻ2. 山东省中医药研究院 ꎬ 山东省中药质量标准研究重点实验室 ꎬ 山东济南 ) 摘要 : 采用正交试验法 ꎬ 以栀子苷含量芍药苷含量得膏率为评价指标 ꎬ 优选痛利舒颗粒的水提工艺参数 ꎮ 实验结果表明 ꎬ 最佳水提工艺参数为 8 倍量水 ꎬ 煎煮 3 次 ꎬ 每次 2 hꎮ 该研究优选的工艺合理可行 ꎬ 提取效率高 ꎬ 可做为痛利舒颗粒的水提工艺 ꎬ 适用于工业生产 ꎮ 关键词 : 痛利舒颗粒 ꎻ 正交试验 ꎻ 水提工艺 ꎻ 含量测定 ꎻ 得膏率中图分类号 :R284.2 文献标识码 :A 文章编号 : (2018) Optimization of water extraction process for Tonglishu Granule by orthogonal experiment YANG Long fei 1 ꎬDING Xiao yan 2 ꎬGAO Yan 2 ꎬGUO Jin 1 ꎬSUN Qi hui 1 ꎬZHAO Bo nian 2 (1.Shandong University of Traditional Chinese Medicineꎬ Jinan ꎬChinaꎻ2.Shandong Provincial key laboratory of Chinese Medicine Quality Standard ResearchꎬShandong Academy of Chinese Medicineꎬ Jinan ꎬChina) Abstract Based on the orthogonal designꎬ parameters of the water extraction process of Tonglishu Granule were optimized by using gardenin contentꎬ peoniflorin content and the extract yield as the index. The experimental results showed that the optimal conditions for water extraction were as follows: eight times of waterꎬ extracting two hours and three times. The optimal extraction technology was reasonable and feasibleꎬ and the extraction efficiency was highꎬ which could be used as the water extraction technology for Tonglishu Granuleꎬ and suitable for industrial producion. Key words Tonglishu Granuleꎻorthogonal designꎻwater extraction processꎻcontent determinationꎻextract yield 痛利舒颗粒是由茵陈葛根白芍栀子等 15 味中药组成的临床经验方 ꎬ 具有清热利湿化瘀止痛益气滋阴之功效 ꎬ 临床上对痛风具有显著的疗效 ꎮ 由于传统汤剂有煎煮不方便服用量大质量不可控不易储存和携带等弊端 ꎬ 为了提高临床疗效保证药品质量 ꎬ 使该处方更好地服务于临床和广大病患 ꎬ 对汤剂进行了剂 [1 10] 型改革 ꎮ 通过对处方的分析 ꎬ 在查阅文献和预实验的基础上 ꎬ 根据各药物的理化性质和药理作用 ꎬ 确定了本制剂的提取工艺 ꎮ 该制剂水提取工艺的优化研究 ꎬ 为痛利舒颗粒的工业生产提供了技术支持 ꎮ 收稿日期 : 基金项目 : 山东省中医药科技发展计划 ( ) 作者简介 : 杨龙飞 (1988 )ꎬ 男 ꎬ 博士研究生 ꎬ 研究方向为中药质量综合评价及新药研究 ꎮ Tel: ꎬE mail:chongcao1988@ 163.com 通信作者 ꎬ 赵渤年 ꎬ 男 ꎬ 研究员 ꎬ 博士生导师 ꎬ 研究方向为中药质量控制及有效成分分析 ꎮ Tel: ꎬE mail:bonianzh@ 163.com

2 24 山东科学 2018 年 1 仪器试剂与试药 1.1 仪器 Waters e2695 型高效液相色谱仪 ( 美国沃特世公司 )ꎻThermo Syncronis C 18 色谱柱 (250 mm 4.6 mmꎬ 5 μm)ꎻbp211d 型电子天平 ( 赛多利斯科学仪器 ( 北京 ) 有限公司 )ꎮ 1.2 试剂乙醇甲醇磷酸为分析纯 ꎻ 乙腈为色谱纯 ꎻ 高效液相色谱用水为超纯水 ꎮ 1.3 试药生地山药枸杞白术苍术白芍栀子茵陈葛根丹参黄芪牛膝地骨皮泽泻甘草 ( 山东建联盛嘉中药有限公司中药饮片厂 ꎬ 质量合格 )ꎻ 栀子苷 ( 批号 : RSꎬ 云南特法特生物科技有限公司 )ꎻ 芍药苷 ( 批号 : ꎬ 中国药品生物制品检定所 )ꎮ 2 方法与结果 2.1 得膏率的测定按处方量称取饮片 ꎬ 按正交设计分别进行实验 ꎬ 合并滤液 ꎬ 将药液转移至干燥恒重的蒸发皿中 ꎬ 水浴蒸干 ꎬ 于 105 条件下干燥 3 hꎬ 转移至干燥器中冷却 30 minꎬ 称重并计算各次实验的得膏率 : 2.2 栀子苷含量测定样品溶液的制备对照品溶液的制备得膏率 = 干膏重量 100%ꎮ 药材重量取栀子苷对照品 ꎬ 精密称定 ꎬ 加甲醇制成 50 μg / ml 的溶液 ꎬ 即得 ꎮ 供试品溶液的制备取正交试验工艺提取所得干膏 1.5 gꎬ 精密称定 ꎬ 置锥形瓶中 ꎬ 精密加入甲醇 25 mlꎬ 称重 ꎬ 超声处理 20 min(53 Hzꎬ300 kw)ꎬ 放冷 ꎬ 称重 ꎬ 用甲醇补足减失的重量 ꎬ 滤过 ꎬ 取续滤液 10 mlꎬ 置 25 ml 容量瓶中 ꎬ 加甲醇定容至刻度 ꎬ 摇匀 ꎬ 用 0.45 μm 微孔滤膜滤过 ꎬ 即得 [11 ] ꎮ 阴性样品溶液的制备按处方比例称取除栀子以外的其他药味 ꎬ 按照样品制备方法制备阴性样品 ꎬ 取阴性样品约 1.2 gꎬ 按项下方法制备 ꎬ 即得 ꎮ 色谱条件色谱柱 :Thermo Syncronis C 18 柱 (250 mm 4.6 mmꎬ5 μm)ꎻ 以乙腈水 (11 : 89ꎬV / V) 为流动相 ꎬ 柱温 30 ꎬ 检测波长为 238 nmꎬ 流速 1.0 ml / minꎬ 进样量 10 μlꎮ 理论板数按栀子苷峰计算应不低于 1 500ꎮ 专属性考察吸取不同样品溶液各 10 μl 进行测定 ꎬ 结果表明 ꎬ 供试品溶液色谱与对照品溶液色谱在相同保留时间处有相应色谱峰 ꎬ 分离度良好 ꎬ 阴性无干扰 ꎮ 色谱图见图 1 ~ 3ꎮ 线性关系考察精密吸取不同体积对照品溶液注入液相色谱仪 ꎬ 测定 ꎬ 得回归方程 :y = x ꎬr = ꎬ 结果表明 ꎬ 栀子苷在 0.10 ~ 1.02 μg 范围内线性关系良好 ꎮ 精密度实验取栀子苷对照品溶液 10 μlꎬ 连续进样 6 次 ꎬ 测定 ꎬ 相对标准偏差为 1.11%ꎬ 表明仪器精密度良好 ꎮ

3 第１期杨龙飞ꎬ等:正交试验法优选痛利舒颗粒水提工艺Ｆｉｇ.１图１２.２.６栀子苷对照品溶液ＨＰＬＣ色谱图ＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆＧａｒｄｅｎｏｓｉｄｅＦｉｇ.２Ｆｉｇ.３２５图３图２供试品溶液ＨＰＬＣ色谱图ＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＴｏｎｇｌｉｓｈｕＧｒａｎｕｌｅ缺栀子阴性样品溶液ＨＰＬＣ色谱图ＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＧａｒｄｅｎｉａＦｒｕｃｔｕｓｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ重复性实验取５号干膏粉末１.５ｇꎬ平行６份ꎬ精密称定ꎬ按２.２.１.２项下方法制备供试品溶液ꎬ测定ꎬ相对标准偏差为２.０２ ꎬ表明该方法重复性良好ꎮ ２.２.７稳定性实验取供试品溶液(５号) 分别在第０２４８１２２４ｈ注入液相色谱仪ꎬ测定ꎬ结果栀子苷峰面积相对标准偏差为１.５３ ꎬ表明供试品溶液在２４ｈ内稳定ꎮ ２.２.８加样回收实验取５号干膏粉末０.７５ｇꎬ平行５份ꎬ精密称定ꎬ分别精密加入浓度为１.８９ｍｇ / ｍｌ的栀子苷对照品溶液１ｍｌꎬ按照２.２.１.２项下方法制备供试品溶液ꎬ测定ꎬ计算得平均回收率为１００.５８ ꎬ相对标准偏差为２.０５ ꎮ

4 ２６山２.３东科学２０１８年芍药苷的含量测定２.３.１样品溶液的制备２.３.１.１对照品溶液的制备２.３.１.２供试品溶液的制备取芍药苷对照品ꎬ精密称定ꎬ加甲醇制成３０ μｇ / ｍｌ的溶液ꎬ即得ꎮ 取正交试验工艺提取的干膏１.５ｇꎬ精密称定ꎬ置锥形瓶中ꎬ精密加入稀乙醇５０ｍｌꎬ称定重量ꎬ超声处理３０ｍｉｎ(５３Ｈｚꎬ３００ｋｗ) ꎬ放冷ꎬ称重ꎬ用稀乙醇补足减失的重量ꎬ滤过ꎬ取续滤液ꎬ用０.４５ μｍ微孔滤膜滤过ꎬ 即得 [１１ ] ꎮ ２.３.１.３阴性样品溶液的制备按处方比例称取除白芍以外的其他药味ꎬ按照样品制备方法制备阴性样品ꎬ取阴性样品约１. ４ｇꎬ按２.３.１.２项下方法制备ꎬ即得ꎮ ２.３.２色谱条件色谱柱:ＴｈｅｒｍｏＳｙｎｃｒｏｎｉｓＣ１８柱(２５０ｍｍ４.６ｍｍꎬ５ μｍ)ꎻ以乙腈０.１磷酸溶液(１１:８９ꎬＶ / Ｖ)为流动相ꎬ柱温３０ ꎬ流速０.９ｍｌ / ｍｉｎꎻ检测波长为２３０ｎｍꎬ进样量１０ μｌꎮ 理论板数按芍药苷峰计算应不低于２０００ꎮ ２.３.３专属性考察吸取不同样品溶液各１０ μｌꎬ测定ꎬ结果表明ꎬ对照品溶液色谱与供试品溶液色谱在相同保留时间处有相应色谱峰ꎬ分离度良好ꎬ阴性无干扰ꎮ 色谱图见图４ ~ ６ꎮ Ｆｉｇ.４图４芍药苷对照品溶液ＨＰＬＣ色谱图ＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆＰａｅｏｎｉｆｌｏｒｉｎＦｉｇ.５图５供试品溶液ＨＰＬＣ色谱图ＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＴｏｎｇｌｉｓｈｕＧｒａｎｕｌｅ

5 第 1 期杨龙飞 ꎬ 等 : 正交试验法优选痛利舒颗粒水提工艺 27 Fig.6 图 6 缺白芍阴性样品溶液 HPLC 色谱图 HPLC chromatogram of Radix paeoniae alba negative control 线性关系考察精密吸取不同体积对照品溶液注入色谱仪 ꎬ 测定 ꎬ 得回归方程 :y = x ꎬr = ꎬ 结果表明 ꎬ 芍药苷在 0.06 ~ 0.60 μg 范围内呈良好的线性关系 ꎮ 精密度实验吸取芍药苷对照品溶液 10 μlꎬ 连续进样 6 次 ꎬ 相对标准偏差为 0.30%ꎬ 表明仪器精密度良好 ꎮ 重复性实验取 5 号干膏 1.5 gꎬ 平行 6 份 ꎬ 精密称定 ꎬ 按项下方法制备供试品溶液 ꎬ 测定 ꎬ 相对标准偏差为 2. 79%ꎬ 该方法重复性良好 ꎮ 稳定性实验取供试品溶液 (5 号 ) 分别在第 h 注入液相色谱仪 ꎬ 测定 ꎬ 计算各样品中芍药苷峰面积相对标准偏差为 1.34%ꎬ 结果表明供试品溶液在 24 h 内稳定 ꎮ 加样回收实验取 5 号干膏粉末 0.75 gꎬ 平行 5 份 ꎬ 精密称定 ꎬ 分别精密加入浓度为 33.5 μg / ml 芍药苷对照品溶液 1 mlꎬ 按照项下方法制备供试品溶液 ꎬ 测定 ꎬ 计算得平均回收率为 99.49%ꎬ 相对标准偏差为 1.50%ꎮ 2.4 水提工艺的优选研究资料表明 [12 13] ꎬ 栀子白芍等药味中的有效成分均具有较好的水溶性 ꎬ 且临床应用时多以水煎剂为主 ꎬ 故在预实验的基础上 ꎬ 以水为提取溶剂 ꎬ 采用 L 9 (3 4 ) 正交试验法 ꎬ 选取加水量 ( A) 煎煮时间( B) 和煎煮次数 (C) 制定因素水平表 ꎬ 以得膏率栀子苷及芍药苷含量作为考察指标 ꎬ 优选水提工艺 ꎮ 正交试验因素水平见表 1ꎮ 表 1 水提工艺正交试验因素水平表 Table 1 The orthogonal factor level table of water extraction process 水平因 A( 加水量 )( 倍 ) B( 煎煮时间 ) / h C( 煎煮次数 ) / 次素正交试验结果评价水煎煮工艺效果的主要指标为栀子苷与芍药苷含量 ꎬ 故将含量测定权重系数定为 0.6ꎬ 芍药苷和栀

6 28 山东科学 2018 年子苷含量各自为 0.3ꎬ 得膏率在实际生产中也有重要意义 ꎬ 权重系数定为 0.4ꎮ 综合评分 = 芍药苷含量 0.3+ 芍药苷含量最大值正交试验结果见表 2ꎬ 方差分析结果见表 3ꎮ 栀子苷含量 0.3+ 栀子苷含量最大值得膏率 0.4ꎮ 得膏率最大值 Table 2 表 2 水煎煮工艺正交试验结果 Orthogonal test results of water extracting technology 试验号因素 A B C D( 误差项 ) 得膏率 / % 栀子苷 / (mg g -1 ) 芍药苷 / (mg g 1 ) 综合评分 K K K R 表 3 方差分析结果表 Table 3 Results of the variance analysis 方差来源偏差平方和自由度均方 F 值 P A >0.05 B >0.05 C <0.05 误差 e 实验结果表明 ꎬ 水提工艺的煎煮次数 (C) 对栀子苷与芍药苷的含量和得膏率有显著性影响 ꎬ 以 C 3 为最佳 ꎬ 而对加水量 (A) 煎煮时间(B) 的影响较小 ꎬ 二者可任选一水平 ꎬ 根据综合评分结果 ꎬ 并考虑到节约能源 ꎬ 降低成本 ꎬ 故选用 A 2 B 2 ꎮ 因此 ꎬ 最佳组合为 A 2 B 2 C 3 ꎬ 即在水提工艺中选用 8 倍量水 ꎬ 煎煮 3 次 ꎬ 每次煎煮 2 h 为水提工艺的适宜条件 ꎮ 2.6 讨论痛风在临床上主要表现为高尿酸血症 ꎬ 是由嘌呤类物质代谢紊乱引起的血尿酸浓度持续增高 ꎬ 而使尿酸 [14 盐结晶沉积在软组织所导致的一组代谢性疾病 ] ꎮ 痛利舒颗粒为多味药组成的复方 ꎬ 在临床上治疗痛风作用显著 ꎬ 且克服了汤剂使用不便服用量大不易储存携带等缺陷 ꎮ 为达到提取工艺可控稳定的目的 ꎬ 本研究采用多指标综合评分来优化提取工艺 ꎮ 根据各药味中成分特点 ꎬ 以水为提取溶剂 ꎬ 成本低安全性高 ꎬ 且与传统中医用药方法相契合 ꎮ 指标的选择与综合评分权重比例是根据其药理作用在制剂中的含量及其在生产中的意义决定的 ꎬ 方中

7 第 1 期杨龙飞 ꎬ 等 : 正交试验法优选痛利舒颗粒水提工艺 29 [15 16 栀子与白芍均可降低血清中尿酸水平 ] ꎬ 故将其作为评价提取工艺的主要指标 ꎬ 并采用 HPLC 测定栀子苷与芍药苷的含量 ꎮ 通过方差分析 ꎬ 最终确定 8 倍量水 ꎬ 煎煮 3 次 ꎬ 每次煎煮 2 h 为水提工艺适宜条件 ꎮ 优选出的提取工艺具有科学性和合理性 ꎬ 可作为痛利舒颗粒生产中提取工艺的参考 ꎬ 并为下一步质量标准的研究制定提供了实验依据 ꎮ 参考文献 : [1] 侯学谦 ꎬ 祝婉芳 ꎬ 曲玮 ꎬ 等. 枸杞化学成分及药理活性研究进展 [J]. 海峡药学 ꎬ2016ꎬ28(8):1 7. [2] 李红伟 ꎬ 孟祥乐. 地黄化学成分及其药理作用研究进展 [J]. 药物评价研究 ꎬ2015ꎬ38(2): [3] 徐硕 ꎬ 夏路风 ꎬ 金鹏飞 ꎬ 等. 泽泻的化学成分及生物活性研究进展 [J]. 中国医药导报 ꎬ2015ꎬ12(27): [4] 曹锦花. 茵陈的化学成分和药理作用研究进展 [J]. 沈阳药科大学学报 ꎬ2013ꎬ30(6): [5] 张秀云 ꎬ 周凤琴. 地骨皮药效成分及临床应用研究进展 [J]. 山东中医药大学学报 ꎬ2012ꎬ36(3): [6] 孙政华 ꎬ 邵晶 ꎬ 郭玫. 黄芪化学成分及药理作用研究进展 [J]. 中医临床研究 ꎬ2015ꎬ7(25): [7] 岳美颖 ꎬ 潘媛 ꎬ 敖慧. 白术化学药理与临床研究进展 [J]. 亚太传统医药 ꎬ2016ꎬ12(5): [8] 欧阳臻 ꎬ 江涛涛 ꎬ 缪亚东 ꎬ 等. 苍术的化学成分道地性和药理活性研究进展 [J]. 时珍国医国药 ꎬ2006ꎬ17(10): [9] 刘娟 ꎬ 刘颖. 丹参药理活性成分研究进展 [J]. 辽宁中医药大学学报 ꎬ2010ꎬ12(7): [10] 楚纪明 ꎬ 马树运 ꎬ 李海峰 ꎬ 等. 葛根有效成分及其药理作用研究进展 [J]. 食品与药品 ꎬ2015ꎬ17(2): [11] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 2015 年版一部 [S]. 北京 : 中国医药科技出版社 ꎬ2015. [12] 那莎 ꎬ 郭国田 ꎬ 王宗殿 ꎬ 等. 栀子及其有效成分药理研究进展 [J]. 中国中医药信息杂志 ꎬ2005ꎬ12(1): [13] 张利. 白芍的药理作用及现代研究进展 [J]. 中药临床研究 ꎬ2014ꎬ6(29): [14] 徐娜 ꎬ 陈海生. 治疗痛风药物研究进展 [J]. 药学实践杂志 ꎬ2013ꎬ31(1): [15] 戴芸 ꎬ 杨林 ꎬ 朱莉萍. 白芍总苷降尿酸实验研究 [J]. 化学工程师 ꎬ2016 (3): [16] 孟兆青 ꎬ 唐朝辉 ꎬ 闫云霞 ꎬ 等. 栀子苷降尿酸作用研究 [J]. 世界科学技术中医药现代化 ꎬ2014ꎬ16(7):

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.