2017 年 4 月第 19 卷第 4 期 ModChinMed Apr 2017 Vol 19 No 4 和药理作用较明确 [5 7], 并已被 2015 版 中华人民共和国药典 收录 入药部位不同的蒙药材蓝刺头, 被 内蒙古蒙药材标准 中华本草 蒙药卷 中华人民共和国卫生部药品标准 蒙药分册 收

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1 年 月 第 卷 第 期 M C M A V N 基础研究 UPLC MS同时测定蒙药材蓝刺头中 个成分的含量 麻剑南 马超美 田志杰 刘卫东 内蒙古盛唐国际蒙医药研究院有限公司 内蒙古 内蒙古大学 生命科学学院 内蒙古 呼和浩特 呼和浩特 内蒙古大唐药业股份有限公司 内蒙古 呼和浩特 摘要 目的 建立超高效液相色谱 串联质谱法 UPLC MS 同时测定蒙药材蓝刺头中绿原酸 二咖啡酰 二咖啡酰奎宁酸 二咖啡酰奎宁酸 和 葡萄糖苷含量的方法 方法 样品分 奎宁酸 析采用 A 液质联用仪 色谱柱为 A ZORBAXRRHDE P C 流动相为 甲酸水溶液 甲 醇 梯度洗脱 离子源为电喷雾电离源 ES I 采用负离子多反应监测模式 MRM 结果 绿原酸 二咖啡酰奎 宁酸 二咖啡酰奎宁酸 葡萄糖苷 二咖啡酰奎宁酸和分别在 μ ml 线性关系良好 加样回收率为 RS D为 结论 该方法专属 性强 精密度高 重复性好 为蒙药材蓝刺头的成分研究提供科学参考 关键词 蓝刺头 绿原酸类 黄酮类 超高效液相色谱 串联质谱法 含量测定 S m D m S xc m E T F w buplc MS MAJ MAC m TI ANZ j LI UW I M S T M M R I C L H C C L S I M U H C I M G P m C L H C Ab Obj T UPLC MSm m w E T M B UPLC MSm x m w mw m b w m A ZORBAXRRHD E P C m w E z w z m m m MRM R T w μ ml T x m w C Tm b m m m w E K w E UPLC MS j 蓝刺头 E T 为菊科蓝刺头 属植物 为中药禹州漏芦的基原植物之一 其干燥 根具有清热解毒 消痈 下乳 舒筋通脉的功能 而其干燥头状花序则为常用蒙药 名为 蓝刺头 蒙药名 乌日格斯图 呼和 具有固骨质 接骨愈 伤 清热解痛的功效 中药材禹州漏芦化学成分 基金项目 呼和浩特市重大科技专项 通信作者 刘卫东 制药高级工程师 研究方向 新药研发 T E m w m

2 2017 年 4 月第 19 卷第 4 期 ModChinMed Apr 2017 Vol 19 No 4 和药理作用较明确 [5 7], 并已被 2015 版 中华人民共和国药典 收录 入药部位不同的蒙药材蓝刺头, 被 内蒙古蒙药材标准 中华本草 蒙药卷 中华人民共和国卫生部药品标准 蒙药分册 收录, 尚未被 中华人民共和国药典 收录, 且还未见相关成分含量测定的研究报道 本研究首次利用超高效液相色谱 串联质谱 (UPLC MS) 技术, 对蓝刺头的 6 个化学成分绿原酸 1,5 二咖啡酰奎宁酸 (1,5 DCQA) 3,5 二咖啡酰奎宁酸 (3,5 DCQA) 4,5 二咖啡酰奎宁酸 (4,5 DCQA) 和 7 O 葡萄糖苷进行了含量测定, 其中 3 个二咖啡酰奎宁酸类成分为首次在蓝刺头中报道 本研究旨在借助现代技术, 为明确蓝刺头的成分和提升民族药材的质量标准研究奠定科学基础 1 材料与仪器 1 1 试药蒙药材蓝刺头分别购自安国市义通中药材有限公司 ( 批号 : , 产地 : 河北 ) 和济南人和中药饮片有限公司 ( 批号 : , 产地 : 内蒙古 ), 经内蒙古盛唐国际蒙医药研究院有限公司张树森教授鉴定为菊科蓝刺头 EchinopslatifoliusTausch 的干燥花序 对照品绿原酸 ( 批号 :NO ) 3,5 二咖啡酰奎宁酸 ( 批号 :NO ),4,5 二咖啡酰奎宁酸 ( 批号 :NO ) 7 O 葡萄糖苷 ( 批号 :NO ) 购自上海同田生物技术股份有限公司,1,5 二咖啡酰奎宁酸 ( 北京世纪奥科生物技术有限公司, 批号 : ), ( 中国食品药品鉴定研究院, 批号 : ),6 个对照品纯度均大于 98%; 甲醇为色谱纯 ; 其他试剂均为分析纯 ; 水为纯化水 1 2 仪器超高效液相色谱 四极杆质谱联用仪 (UPLC MS): 分析用 Agilent1290infinityUPLC 系统, 连接有 6430 三级串联四极质谱检测器 [Agilent Technologies Sin 78, Singapore(International)Pte. Ltd, 新加坡 ];FDU 1200 型冷冻干燥机 (-45 ) ( 上海爱郎仪器有限公司 );QE 100g 中药粉碎机 ( 浙江屹立工贸有限公司 );JP 100/S 型超声波清洗机 ( 深圳洁盟清洗设备有限公司 );SC 04 型低速离心机 ( 安徽中科中佳科学仪器有限公司 );TB 25 型分析天平 ( 美国 Denver 公司 ) 2 方法与结果 2 1 色谱和质谱条件 AgilentZORBAX RRHD EcilipsePlus C 18 色谱柱 (50mm 2 1mm,1 8μm); 流动相 :0 1% 甲酸水溶液 (A) 甲醇 (B) 梯度洗脱(0~3min,18% ~ 22% B;3~3 5min,22% ~25% B;3 5~15min, 25% B;15~17min,25% ~45% B;17~18min, 45% ~80% B;18~20min,80% ~100% B); 柱温 :30 ; 流速 :0 4mL min -1 ; 进样量 :2μL; 负离子多反应监测模式 (MRM); 电喷雾 (ESI) 离子源 ; 干燥气温度 :350, 氮气流速 :11L min -1, 喷雾器压力 45Psi(1Psi=6 895kPa), 毛细管电压 : 3 5kV UPLC MS 优化结果见表 1, 混合对照品及供试品色谱图见图 对照品溶液的制备分别精密称定绿原酸 1,5 DCQA 3,5 DCQA 4,5 DCQA 和 7 O 葡萄糖苷对照品适量, 加无水乙醇, 分别制成 1 0mg ml -1 的贮备溶液, 即得 2 3 供试品溶液的制备取冷冻干燥后的蓝刺头药材, 粉碎处理过 4 号筛, 称取 20mg 药粉, 置 50mL 具塞锥形瓶中, 精密加入 60% 乙醇水溶液 10mL 超声提取 30min (10min/ 次 )(500W,40kHz), 转移至 15mL 离心 表 1 MRM 模式下 6 个对照品的 UPLC MS 优化结果 编号 t R /min 化合物 分子量 [M H] - (m/z) 子离子 绿原酸 (Chlorogenicacid) ,5 二咖啡酰奎宁酸 (3,5 DCQA) ,5 二咖啡酰奎宁酸 (1,5 DCQA) O 葡萄糖苷 (Apigenin 7 O glucoside) ,5 二咖啡酰奎宁酸 (4,5 DCQA) (Apigenin)

3 年 月 第 卷 第 期 M C M A V N 注 A 个对照品 B河北产蓝刺头 C内蒙古产蓝刺头 绿原酸 二咖啡酰奎宁酸 二咖啡 葡萄糖苷 二咖啡酰奎宁酸 酰奎宁酸 图 MRM 模式下蓝刺头中 个成分的 UPLC MS色谱图 管 中 离 心 取 上 清 液 m m μm微孔滤膜滤过 取滤液 备用 线性关系考察 表 蓝刺头中 个成分的线性回归分析结果 化合物名称 绿原酸 回归方程 线性范围 ml μ Y X 精密配制 个对照品的混合对照品溶液 过程 二咖啡酰奎宁酸 Y X 如下 精密量取 个对照品贮备溶液适量 加 二咖啡酰奎宁酸 Y X 乙醇水溶液稀释 即得最高质量浓度混合对照品溶 乙醇水溶液将混合对照品 液 L 然后 用 以 的比例稀释 个梯 溶液 L 葡萄糖苷 Y X 二咖啡酰奎宁酸 Y X Y X 度 即得 个 质 量 浓 度 的 混 合 对 照 品 溶 液 L 连 续 测 定 次 测 得 绿 原 酸 L 最后 择优选取 个质量浓度对照品溶液 用 和 葡萄糖苷 于标准曲线的绘制 以峰面积为纵坐标 Y 质量 的峰面积 RSD 分别为 浓度为横坐标 X 作线性回归 结果见表 表明仪器精密度良好 精密度试验 稳定性试验 取同一混合对照品对照品溶液 按 项条件 取同一供试品溶液 按 项条件分别在

4 2017 年 4 月第 19 卷第 4 期 ModChinMed Apr 2017 Vol 19 No h 进样测定 计算绿原酸 1,5 DCQA 3,5 DCQA 4,5 DCQA 和 7 O 葡萄糖苷的峰面积 RSD(n=9) 分别为 0 6% 1 1% 0 4% 1 2% 1 7% 1 3%, 表明供试品溶液在 24h 内基本稳定 2 7 重复性试验取同一批号 ( ) 蓝刺头药材, 按 2 3 项平行制备 6 份供试品溶液, 按 2 1 项条件测定 计算绿原酸 1,5 DCQA 3,5 DCQA 4,5 DCQA 和 7 O 葡萄糖苷的峰面积 RSD(n=6) 分别为 2 1% 2 5% 1 9% 2 2% 2 3% 1 6%, 表明该方法重复性良好 2 8 加样回收率精密称取同一批号 ( ) 已知含量的蓝刺头样品 6 份, 分别准确加入一定量的 2 2 项中对照品贮备溶液 (1 0mg ml -1 ), 按 2 3 项制备供试品溶液, 测定 6 个化合物的峰面积, 计算回收率, 结果见表 样品含量测定分别取两批次的不同产地蓝刺头药材各 6 份, 同法测定样品中 6 个成分的含量, 结果见表 4 表 3 蓝刺头中 6 个成分的加样回收率试验结果 (n=6) 成分 编号 称样量 /mg 样品中含量 /μg 加入量 /μg 测得量 /μg 回收率 (%) 平均回收率 (%) RSD(%) 绿原酸 ,5 DCQA ,5 DCQA O 葡萄糖苷 ,5 DCQA

5 年 月 第 卷 第 期 M C M A V N 表 续 成分 编号 称样量 m 样品中含量 μ 加入量 μ 测得量 μ 回收率 平均回收率 RSD 表 蓝刺头中 个成分的含量测定 m 绿原酸 葡萄糖苷 样品批号 质量分数 RS D 质量分数 RS D 质量分数 RSD 质量分数 RS D 质量分数 RSD 质量分数 RSD 生部药品标准 蒙药分册 S 讨论 张冬 艳 杨 雷 薛 培 凤 等 药 用 植 物 蓝 刺 头 的 研 究 进 本研究首次利用 UPLC MS技术对蒙药材蓝刺头 的 个化学成分进行了含量测定 并首次在该药材 中发现含有 个二咖啡酰奎宁酸类化合物 分别是 二咖啡酰奎宁酸 二咖啡酰奎宁酸和 二咖啡酰奎宁酸 近年来的研究结果显示 绿原 酸类化 合 物 具 有 诸 多 的 药 理 活 性 特 别 是 在 抗 病毒 抗氧化 抑制胰腺脂酶 等方面效果 显著 故预测蒙药材蓝刺头具有潜在的多重药理活 性 该研究结果为蒙药材蓝刺头的应用提供了理论 展 J 中国药师 胡伊力格其 HPLC法测定民族药材禹州漏芦不同部位 中国民族医药杂志 中绿原酸的含量 J 杨斌 萨茹丽 刘敏 等 蓝刺头花絮水提物的降血糖作 用研究 J 西北农 林 科 技 大 学 学 报 自 然 科 学 版 刘颖 郭明晔 白根本 绿原酸的研究进展 J 中药材 W GF S LP R YD A B 参考 J A R 参考文献 国家药典委员会 中华人民共和国药典 一部 S 北 京 中国医药科技出版社 内蒙古自治区卫生厅 内蒙古蒙药材标准 S 国家中医药管理局 中华本草 编委会 中华本草 蒙 药卷 S 上海 上海科学技术出版社 中华人民共和国卫生部药典委员会 中华人民共和国卫 XJG HQ P L Y A x DNA m J JA F C m C KH S D G K m S M I b b m L m F C m J J A 收稿日期

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