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姬堀和
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1 国际中医中药杂志 7 年 7 月第 39 卷第 7 期 Int J Trad Chin Med July 7 Vol. 39 No.7 67 建立凤尾草中总黄酮和木犀草素的含量测定方法实验与方药李梦薇马月梅刘傲雪王豪陈新晶刘洋摘要目的建立凤尾草中木犀草素及总黄酮的含量测定方法方法采用 D 大孔树脂分段洗脱并采用紫外分光光度法测定总黄酮含量 ; 采用 HPLC 法测定木犀草素含量色谱柱为 RP-C8 柱 (4.6 mm 5 mm5 μm); 流动相为乙腈 -.% 磷酸 (35 65) 检测波长 349 nm 流速. ml/min 柱温 3 结果 3 批凤尾草药材中木犀草素含量依次为.5%.9%.6%; 总黄酮含量依次为.55%.66%.59% 结论所建立的分析方法准确简便可为定量评价凤尾草药材的质量提供依据关键词凤尾草 ; 黄酮类 ; 色谱法高压液相 ; 木犀草素 Development and validation for the determination of total flavonoids and luteolin from Pteris multifida Poir Li Mengwei Ma Yuemei Liu Aoxue Wang Hao Chen Xinjing Liu Yang. School of Chinese Materia Medica Beijing University of Chinese Medicine Beijing China Corresponding author: Liu Yang liuyang@bucm.edu.cn Abstract Objective To determine the content of total flavonoids and luteolin from Pteris multifida Poir. Methods The content of total flavonoids was determined by gradient elution of macroporous resin D and ultraviolet spectrophotometry. The content of luteolin was determined by HPLC. The analysis was performed on a RP-C8 column(4.6 mm 5 mm 5 μm) with aceconitrile-.% phosphoric acid (35:65) as the mobile phase at a flow rate of. ml/min and 3 temperature. Results The detection of wave length was set at 349 nm. The content of luteolin was.5%.9%.6% and the content of total flavonoids was.5%.9%.6% respectively. Conclusions The method is suitable for the determination of flavonoids componets from Pteris multifida Poir. Key words Pteris multifida; Flavones; Chromatography high pressure liquid; Luteolin 凤尾草为凤尾蕨科植物凤尾草 Pteris multifida Poir. 的干燥全草具有清热利湿消肿解毒凉血止血等功效临床用于治疗痢疾黄疸带下扁桃体炎痈疮疖肿血热出血及外伤出血等 [] 凤尾草主要含有黄酮类萜类甾醇类苯丙素类挥发油类等化学成分黄酮类成分是其主要 [-8] 的活性成分之一凤尾草总黄酮含量的测定多以芦丁为对照品采用 NaNO -Al(NO 3 ) 3 -NaOH 或 DOI:.376/cma.j.issn 基金项目 : 国家中医药管理局中药标准化项目 (ZYBZH-Y-GS-) 作者单位 : 北京中医药大学中药学院 ( 李梦薇刘傲雪王豪陈新晶刘洋 ); 亚宝药业集团股份有限公司北京药物研究院 ( 马月梅 ) 通信作者 : 刘洋 liuyang@bucm.edu.cn [9-] AlCl 3 比色法进行测定为了对凤尾草药材进行有效的质量控制本试验以凤尾草中含量较高的黄酮类成分木犀草素为指标成分建立 HPLC 法测定其黄酮单体成分含量的方法并采用 D 大孔树脂 - 紫外分光光度法对其总黄酮进行含量测定为凤尾草的质量评价提供参考仪器与试药. 试验仪器 LC-AT 高效液相色谱仪 SPD-AT 紫外检测器 UV-5PC 型紫外分光光度计 ( 日本岛津公司 );BPD 型电子分析天平 ( 德国 SARTROIUS 公司 );KQ-5DB 型数控超声清洗器 ( 昆山市超

2 68 国际中医中中药杂志 7 年 7 月第 39 卷第 7 期 Int J Trad Chin Med July 7 Vol. 39 No.7 声仪器有限限公司 ) A. 药品与与试剂凤尾草草购自中国 ( 亳州 ) 中药材交交易中心经中国中医科科学院中药研研究所郝近大教教授鉴定为凤尾蕨科植物物凤尾草 Pteris multifida Poir. 的干燥地上部分木木犀草素对照品 ( 北大世佳佳企业自制纯度 99.66% 批号 FWC--8); 甲醇 ( 色谱纯康科德有限限公司批号 4366); 乙腈 ( 色谱纯 B Dimka 公司批号 5445); 水为重重蒸水 ; 其他试剂均为分析析纯方法与结结果. HPLC 法测定凤尾草中木犀草素素含量.. 色谱谱条件 : 色谱柱柱为 RP-C8 柱 (4.6 mm 5 mm5 μm); 流动动相为乙腈 -.% 磷酸溶液 (35 65) 检测波长 349 nm 流速. ml/min 柱温 3.. 溶液液制备 : 木犀犀草素对照品品溶液的制备 : 精密称取木木犀草素对照品 5.78 mg 甲醇溶解并定容于 5 ml 量瓶摇匀即得浓度为.5 mg/ml 的对照品溶溶液备用供试品溶液液的制备 : 称取凤尾草药药材粗粉 ( 过 4 目筛 ) 约 g 精密称定用 7% 乙醇 ml 回流流提取次 h/ 次过滤合并滤液至 ml 容量量瓶中. μm 滤膜滤过即得供试品品溶液 3 阴性空白溶液的制备 :7%% 乙醇. μm 滤膜滤过即得..3 线性性关系考察 : 精密量取对照照品溶液 ml 分别置 ml 量瓶中加甲醇定容摇匀 ; 精密密量取对照品溶溶液.4.8. ml 分别置 ml 量瓶中加甲醇醇定容摇匀匀分别吸收上述各浓度对对照品线性溶液液各 μl 依次注入液相色谱仪按上述色谱条条件测定以对对照品浓度为横坐标 (X) 峰面积为纵纵坐标 (Y) 绘制标准曲线得回归方程程为 Y=67 83 X-9 55 r= 结果表明木犀草素在.3 4~.3 4 μg 范围内与峰面积线线性关系良好色谱图见图图注 A: 供试品溶液 ;B: 木犀草素对照品溶溶液 ;C: 阴性空白溶液 ; : 木犀草草素图..4 木犀草素 HPLC 图品溶液分别精密吸取 μl 连续进样 6 次计算 RSD 为.% 表明仪器精密密度良好..5 RSD 为.% 表明明本供试品在室室温条件下 4 h 内稳定性性良好 C t/min 精密度考察 : 制备同一份份凤尾草药材材对照稳定性考察 : 精密吸取同一一供试品溶液 μl 分别于 h 测定峰面积计算重复性考察 : 取同一批凤凤尾草药材 6 份按供试试品溶液制备备方法制成样品溶液在上上述色谱条件件下测定计算平均含量为.5%RSD 为.77% 表明本方法法重复性良好好..7 回收率试验 : 称取 6 份同一一样品粉末约.5 g 精密称称定并加入入一定量的对照照品按供试试溶液制备方方法制成样品溶液精密吸吸取 μl 在上述色谱条条件下测定计算回收率结果显示平均回收率率为.46% RSD 为.4%(n=6) 表明回收率良良好结果见表

3 国际中医中药杂志 7 年 7 月第 39 卷第 7 期 Int J Trad Chin Med July 7 Vol. 39 No.7 69 称样量表理论含加入量量木犀草素加样回收率试验结果测得量回收率平均值 RSD 凤尾草中木犀草素含量测定 : 取 3 批凤尾草药材平行测定 3 份并在上述色谱条件下测定计算样品中木犀草素含量结果显示 3 批样品中木犀草素含量依次为.5%.9%.6%. 紫外分光光度法测定凤尾草中总黄酮含量.. D 大孔树脂除杂富集总黄酮 : 按.. 供试品溶液制备方法制备凤尾草供试品溶液取 ml 蒸干用水转溶到 5 ml 容量瓶中上样于预处理的 D 大孔吸附树脂柱 (.8 cm 3 cm 装 cm) 分别用蒸馏水 % 乙醇 3% 乙醇 5% 乙醇 7% 乙醇无水乙醇洗脱蒸干溶剂后甲醇转溶至 ml 容量瓶过. μm 滤膜取续滤液 μl 进液相色谱仪记录凤尾草药材中 6 个黄酮单体的峰面积用外标一点法计算 D 大孔树脂除杂分段洗脱液中各黄酮单体的含量计算转移率结果见表表 D 大孔树脂除杂分段洗脱液中各黄酮单体的转移率木犀草素木犀草素芹菜素木犀草素芹菜 -7-O-β-D- -4'-O-β-D- 洗脱溶剂 -4 -O-α-L- -7-O-β-D- 素吡喃葡萄吡喃葡萄鼠李糖苷鼠李糖苷糖苷糖苷水木犀草素 % 乙醇 % 乙醇 % 乙醇 % 乙醇无水乙醇总转移率结果表明水和 % 乙醇洗脱部位中 6 个黄酮单体化合物含量极低故可采用 % 乙醇除杂指标成分木犀草素和其他黄酮类成分大部分富集在 3% 乙醇 5% 乙醇和 7% 乙醇部位芹菜素和木犀草素 -4'-O-β-D- 吡喃葡萄糖苷经 5% 乙醇洗脱后转移率为 64.6% 36.7% 再经 7% 乙醇洗脱转移率分别增加 34.% 9.% 增加率较高故选择 7% 乙醇洗脱液进行含量测定.. 溶液制备 : 木犀草素对照品溶液制备 : 同.. 项下方法供试品溶液制备 : 称取凤尾草药材约 g 加入 7% 乙醇 ml 回流提取次 h/ 次提取液过滤合并滤液至 ml 容量瓶中 ; 取 ml 上述提取液蒸干溶剂用 5 ml 蒸馏水转容 ; 上样于 D 大孔树脂用 % 乙醇 5 ml 除杂再用 7% 乙醇 5 ml 洗脱洗脱液定容于 5 ml 容量瓶中..3 线性关系考察 : 分别精密吸取木犀草素对照品溶液 ml 置 ml 容量瓶中甲醇定容摇匀以甲醇为空白在 349 nm 处测定值以对照品浓度 (X) 为横坐标 (Y) 为纵坐标绘制标准曲线回归方程为 Y= X+.69 5r= 表明木犀草素在.5 4~.3 μg 范围内与线性关系良好..4 精密度考察 : 取同一份凤尾草药材供试品溶液在波长 349 nm 处测其计算 RSD 为.% 表明仪器精密度良好..5 稳定性考察 : 取同一份供试品溶液分别在室温 h 波长 349 nm 处测定其计算 RSD 为.% 表明供试品在室温 4 h 内具有良好的稳定性..6 重复性考察 : 取同一批次凤尾草药材 6 份按.. 供试品溶液制备方法操作得到 6 份药材供试品溶液在波长 349 nm 处测定木犀草素对照品溶液和供试品溶液的计算平均含量为.55%RSD 为.3% 表明本法重复性良好..7 回收率考察 : 称取凤尾草药材粗粉约.5 g

4 6 国际中医中中药杂志 7 年 7 月第 39 卷第 7 期 Int J Trad Chin Med July 7 Vol. 39 No.7 平行 6 份精密称定再精密加入对照品按供试品溶液制制备方法操作得到药材供供试品溶液在波长 349 nm 处测定木木犀草素对照品溶液和供试品溶液的吸计算平平均加样回收收率为 98.39% % RSD 为.88% 表明总黄黄酮回收率良良好见表 3 表 3 凤尾草总黄酮酮加样回收率试试验结果称样量理论含含量对照品浓度 (mg/ml) 测得量回收率平均值 RSD 供试试品含量测定 : 取 3 批凤尾草药材按.. 方法制备供试试品溶液并在在上述色谱条件下测定平行测定 3 份计算样品中木犀草素含量按.. 方法制制备供试品溶液按..6 方法测定供供试品中总黄酮酮的含量结结果显示 3 批样品中木犀犀草素含量依依次为.5%.9%.6% 总黄黄酮含量依次次为.55%.66%.59%.3 总黄酮酮测定供试品品制备方法考察.3. 考察察供试品溶液液不同检测方法法的紫外扫描图 : 紫外外分光光度法 : 精密吸取. 8 mg/ml 木犀草素对对照品溶液 ml 于 5 ml 容量瓶中甲醇定容摇匀即得对对照品溶液精密吸取按.. 方法制备的供试试品溶液 5 ml 于 5 ml 容量瓶中甲醇定容摇匀即得供试试品溶液将稀释后的对对照品和供试品溶液在 ~4 nm 范围内扫描紫紫外吸收光谱见图 AlCl 3 比色法 : 分别吸取.3. 中的的木犀草素对照照品溶液和供试品溶液各 ml 于 ml 试管中加入 % AlCl 3 溶液 ml 用溶剂稀释至至刻度充分摇摇匀在 3~~ 6 nm 范围围内测定吸光光度值随行制制备空白溶剂见图 3 3 Al(NO 3 ) 3 -NaNO -NaOH 比色法 : 分别吸取.3. 中的木犀犀草素对照品溶溶液和供试品溶液各 ml 于试管中分别加入..5% NaNO 溶液 5 ml 摇匀放置 5 min 加入 % Al( (NO 3 ) 3 溶液.5 ml 摇匀放置 5 min 加入 4% NaOH 溶液 5 ml 摇匀放置 min 后在 4~8 nm 范围内内紫外扫描随行制备空白白溶剂见图 4 注 : 供试品溶液 ;: 木犀草素对照品溶溶液图木犀草素对照品和供试品紫外扫描图..5. 注 : 木犀草素对照品溶溶液 ;: 供试品溶溶液图 3 AlCl 3 比色法下木犀草素对照品与供试试品紫外扫描色谱谱图注 : 木犀草素对照品溶溶液 ;: 供试品溶溶液图 4 Al(NO 3 ) 3 -NaNO -NaOH 比色法下木木犀草素对照品与供供试品紫外扫描色色谱图结果表明木犀草素对照品和供试品的的紫外谱图最最大吸收波长长有一定差异经 AlCl 3 显色和 Al(NO 3 ) 3 -NaNO -NaOH 显色后后紫外图谱差差别仍较大故不能直接用用于测定凤尾尾草中总黄酮酮含量应进一一步考察供试品溶液除杂后后的紫外谱图图

5 国际中医中药杂志 7 年 7 月第 39 卷第 7 期 Int J Trad Chin Med July 7 Vol. 39 No 考察供试品溶液经 D 大孔树脂除杂分段洗脱液的紫外扫描图 : 直接紫外法 : 精密吸取. 8 mg/ml 木犀草素对照品溶液.5 ml 置于 ml 量瓶中甲醇定容摇匀将稀释后的木犀草素对照品溶液和上述经 D 大孔树脂除杂后的分段洗脱液在 ~4 nm 范围内扫描紫外吸收光谱 AlCl 3 比色法 : 精密吸取. 8 mg/ml 木犀草素对照品溶液.5 ml 于 ml 容量瓶中甲醇定容摇匀分别吸取稀释后的木犀草素对照品溶液和供试品溶液各 ml 置于 ml 试管中采用 AlCl 3 比色法进行测定方法同.3. 3 Al(NO 3 ) 3 -NaNO -NaOH 比色法 : 分别吸取. 8 mg/ml 木犀草素对照品溶液和供试品溶液各 ml 于试管中采用 Al(NO 3 ) 3 -NaNO - NaOH 比色法进行测定方法同.3. 结果表明 3% 醇洗脱液 5% 醇洗脱液 7% 醇洗脱液的直接紫外图谱和经 AlCl 3 和 (NO 3 ) 3 -NaNO -NaOH 显色后与对照品图谱具有较好的相似性.3.3 3% 5% 和 7% 乙醇洗脱后凤尾草药材中总黄酮的含量 : 按上述 3 种方法测定凤尾药药材提取液的大孔树脂不同分段部位总黄酮含量见表 4 结果表明对照品和不同溶剂洗脱后的供试液样品中总黄酮含量相似考虑到紫外法更方便快捷简单故采用 D 大孔树脂除杂后紫外法测定凤尾草药材中总黄酮的含量表 4 大孔树脂不同分段部位不同方法测定的总黄酮含量洗脱溶剂紫外法 AlCl 3 比色法 Al(NO 3 ) 3 -NaNO -NaOH 比色法 3% 乙醇 % 乙醇 % 乙醇小结木犀草素为黄酮类化合物是许多中药材含量测定的指标性成分应用 HPLC 法测定凤尾草中木犀草素含量的研究较少本试验建立的 HPLC 法简便可行可为凤尾草的质量标准提供依据大孔树脂应用范围广理化性质稳定分离性能优良可有效富集黄酮类化合物由于凤尾草提取液紫外扫描图与木犀草素的紫外扫描相似度较差因此考察了大孔树脂除杂后 AlCl 3 比色 (NO 3 ) 3 -NaNO -NaOH 比色和紫外法 3 种方法确定了以木犀草素为对照品利用紫外法测定凤尾草中总黄酮含量的方法该法简便易行且结果稳定可靠可为凤尾草的质量控制提供参考参考文献 [] 江苏新医学院. 中药大辞典 [M]. 上海 : 上海科学技术出版社 985: [] 王文蜀王志骞周亚伟. 凤尾草化学成分研究 [J]. 中药材 83(8): DOI:.33/j.issn: [3] 李凤亚. 凤尾草化学成分研究 [D]. 昆明 : 云南大学. [4] 苗得足高峰鞠建刚. 凤尾草化学成分研究 [J]. 今日健康 4(3):8-9. [5] 舒积成张锐张维等. 凤尾草中黄酮类化学成分研究 [J]. 中成药 34(6):-6. DOI:.3969/j.issn [6] 舒积成潘景行张锐等. 凤尾草中倍半萜类成分研究 [J]. 中成药 33():4-7. DOI:.3969/j.issn [7] 徐宏懿李凤亚杨明明等. 凤尾草化学成分研究 (Ⅰ)[J]. 云南民族大学学报 : 自然科学版 3(5): DOI:.3969/j.issn [8] Ouyang DWNi XXu HYet al. Pterosins from Pteris multifida[j]. Planta Med76(6): DOI:. 55/s [9] 刘建群刘健蒋伟等. 凤尾草药材质量标准研究 [J]. 中国中药杂志 54(): DOI:.468/cjcmm53. [] 余俊陈晓青蒋新宇等. 凤尾草中总黄酮的提取工艺研究 [J]. 中成药 79(): DOI:.3969/j.issn [] 杨晓敏. 凤尾草中总黄酮的含量测定方法研究 [J]. 中国药业 87(6):8-9. DOI:.3969/j.issn [] 周国梁刘小胖俞浩等. 星点设计 - 效应面法优化凤尾草总黄酮超声提取工艺 [J]. 安徽科技学院学报 59(3): 5-3. DOI:.3969/j.issn ( 收稿日期 :6--) ( 本文编辑 : 张琪 )

70 陈伟珠, 等 : 超高压液相色谱法测定鱼油中的和 DHP-EE % (RSD 1.05 %) respectively. The RSD of repetition was 1.54 %(n=6) for and 1.25 %(n=6) for. This method was

70 陈伟珠, 等 : 超高压液相色谱法测定鱼油中的和 DHP-EE % (RSD 1.05 %) respectively. The RSD of repetition was 1.54 %(n=6) for and 1.25 %(n=6) for. This method was DOI 10.3969/j.issn.1005-6521.2013.08.019 Food Research And Development 2013 3 34 6 69 1 2 1 1 * 1 1 1 1. 361005 2. 361005 : 采用超高压液相方法检测鱼油中的二十碳五烯酸乙酯 () 和二十二碳六烯酸乙酯 (), 采用 UPLC BEH C18(2.1 mm 50 mm,1.7 μm)