标溶液 备用 2. 4 供试品溶液的制备. 1 取芍药样品粉末约 0. 8 g 精密称定 置 100 ml 具塞三角瓶中 精密加入甲醇 50 ml 称定 超声处 理 0 min 放冷 甲醇补足失重 摇匀 精密吸取上 清液 ml 至 50 ml 量瓶中 精密加入内标溶液 5. 0 ml 加

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1 与 HPLC 特征指纹谱的建立及其 在质量控制中的应用 王瑞 1 2 黄山君1 杨琪伟1 石燕红1 王峥涛1 2 * ( 1. 上海中医药大学 中药学院 上海 20120; 2. 上海中药标准化研究中心 上海 20120;. 上海中医药大学 中药研究所 中药标准化教育部重点实验室 上海 20120) 摘要 目的: 建立与的高效液相色谱特征指纹分析方法 为科学评价和有效控制其质量提供方法 方法: 采 用 Polaris C18 -A 色谱柱; 流动相乙腈-磷酸水溶液( ph. 0) 梯度洗脱; 检测波长 20 nm; 流速 1. 0 ml min ; 测定了 67 批不 同来源的与样品的 HPLC 特征指纹谱 结果: 指认了 9 个芍药苷类和酚酸类成分 并以龙胆苦苷为内标对特征指纹 峰进行半定量分析 根据系统聚类分析和相似度分析结果 对与进行了评价 结论: 特征指纹谱可对和进 行鉴别 并能够用于和的质量评价 关键词 ; ; 特征指纹谱; 高效液相色谱法 芍药是具有多种功效的传统中药 有赤 白之 分 中国药典 2010 年版规定为毛茛科植物 Tedia 公司 ) 双蒸水 其他试剂均为分析纯 没食 子酸 没食子酸甲酯 芍药内酯苷 芍药苷 没食子酰 芍药 Paeonia Lactiflora Pall. 的干燥根 夏 秋二季 采挖 洗净 除去头尾和细根 置沸水中煮后除去外 芍药苷 苯甲酸 五没食子酰基葡萄糖 苯甲酰芍药 苷 丹皮酚 龙胆苦苷对照品( 自制 纯度 98% ) 皮或去皮后再煮 晒干 为毛茛科植物芍药 P. Lactiflora Pall. 或川 P. veitchii Lynch 的干燥根 收集与样品 67 份 由上海中医药大学 中药研究所吴立宏副研究员鉴定 分别为 P. 春 秋二季采挖 除去根茎 须根及泥沙 晒干 具有 1 清热凉血 散瘀止痛之功效 杂芍药 P. hybrida lactiflora No. 1 21; P. lactiflora No ; P. veitchii No. 42 6( 川) ; P. hybri- Pall. 的干燥纺锤状块根 称为新疆或 因 资源丰富 在新疆地区大量收购 作为代用品在 da No ( 新疆 ) 标本保存于上海中医 药大学中药研究所标本室 2 当地应用 目前 对和的质量控制主要 1 2 方法 2. 1 本研究采用高效液相色谱法建立了评价和 质量的特征指纹分析方法 通过与对照品对照 色谱条件 Polaris C18 -A ( 4. 6 mm 250 mm 5 μm) 色谱 柱; 流动相乙腈( A) -磷酸水溶液 ( ph. 0 B) 梯度 指认了 9 个成分并分析了其差异; 以特征指纹图谱进 行聚类分析和相似度分析 并以形态学鉴定结果相比 5% 9% A; 8 20 min 9% 15% 洗脱: 0 8 min 15% 17% A; min 17% A; A; min 较 为完善和的质量评价标准提供依据 1 材料 min 17% 0% A; min 0% A 流 是根据芍药苷的含量高低来进行评价 速 1. 0 ml min ; 色谱峰采集波长范围 nm; 检测波长 20 nm; 柱温 0 ; 进样量 10 μl Agilent 1100 高效液相色谱仪 配有二极管阵列 检测器 乙腈( 色谱纯 Merck 公司) 磷酸( 色谱纯 2. 2 稿件编号 分别精密称取对照品适量 置 5 ml 量瓶中 甲 醇溶解并定容至刻度 配制成质量浓度已知的混合 基金项目 国家 重大新药创制 科技重大专项( 2009ZX ZX ) ; 上 海 市 自 然 科 学 基 金 项 目 ( 008ZR ) ; 中医药行业科技专项( ) 通信作者 * 王峥涛 wangzht@ shutcm edu cn 作者简介 王瑞 副教授 ellewangtam@ gmail com 对照品溶液的制备 对照品溶液 备用 2. 内标溶液的制备 精密称取龙胆苦苷对照品适量 置 50 ml 量瓶 中 甲醇溶解并定容至刻度 配制成 0. 2 g L 的内 729

2 标溶液 备用 2. 4 供试品溶液的制备. 1 取芍药样品粉末约 0. 8 g 精密称定 置 100 ml 具塞三角瓶中 精密加入甲醇 50 ml 称定 超声处 理 0 min 放冷 甲醇补足失重 摇匀 精密吸取上 清液 ml 至 50 ml 量瓶中 精密加入内标溶液 5. 0 ml 加甲醇至刻度 摇匀 经 μm 微孔滤膜 过滤 取续滤液 作为供试品溶液 2. 5 精密度 重复性 稳定性试验 结果 与特征指纹谱的建立和识别 本研究测定了 67 份芍药样品 其代表性的特征 指纹谱见图 1 共获得 27 个色谱峰 经与对照品对 照 指认了 9 个主要的色谱峰 分别为没食子酸 ( 1 号峰) 没食子酸甲酯 ( 7 号峰 ) 芍药内酯苷 ( 15 号 峰) 芍药苷( 17 号峰) 没食子酰芍药苷( 21 号峰 ) 苯甲酸( 22 号峰) 五没食子酰基葡萄糖 ( 24 号峰 ) 苯甲酰芍药苷( 25 号峰 ) 丹皮酚 ( 27 号峰 ) 14 号 取同一批号样品的供试品溶液在上述液相色谱 条件下 连续进样 6 次 记录色谱图 考察精密度; 另 峰为内标龙胆苦苷 将其作为参比峰 采用二极管 阵列检测器 纪录每个色谱峰在全波长 ( 取该样品 6 份 精密称定 分别按供试品溶液制备方 法制备供试品溶液 进样分析 记录色谱图 考察重 nm) 范围内的紫外吸收光谱图 以各色谱峰对参比 h 进样分 复性; 将供试品溶液分别在 0 析 记录色谱图 考察供试品溶液稳定性 所得各主 要共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积均基本 一致 RSD 小于. 0% 符合指纹图谱要求 图 峰的相对保留时间和紫外吸收光谱图这两个指标定 性 同时对 9 个特征指纹峰进行了半定量分析 若 某一指纹图谱在某相对保留时间处无峰 相对峰面 积为零 仍给相应的编号 以保证各特征指纹谱都有 相同的色谱峰数 和的特征指纹图谱 与特征指纹图谱的分析与评价 系统聚 类 分 析 系统聚类分析是一种无 管 理 无 指 导 的 模 式 识 别 方 法 是 根 据 事 物 本 身 的具有 27 个色谱 峰 的 特 征 指 纹 谱 将 各 色 谱 峰 相对于 参 比 色 谱 峰 的 峰 面 积 量 化 得 到 的特征研究个体分 类 的 方 法 可 依 据 所 测 样 品 的 色谱指纹图谱特征数 据 对 样 品 进 行 分 类 以 阶原始 数 据 矩 阵 采 用 离 差 平 方 和 法 ( Ward s Method) 利用欧氏距离 ( Euclidean Distance) 作为 样品的 测 度 对 其 进 行 系 统 聚 类 分 析 通 过 对 照 经形态学鉴定的 67 份不同批次和产地的芍药样 品为研究对象 获 得 包 括 芍 药 苷 ( 17 号 峰 ) 在 内 并结合形态学 鉴 定 结 果 聚 类 分 析 首 先 将 芍 药样品分和赤 芍 二 大 类 其 次 又 将 赤 芍 区 分 70

3 为 2 类 即可以认 为 分 成 类 : 第 Ⅰ 类 为 白 芍 P. lactiflora 第Ⅱ类为 P. lactiflora 第 Ⅲ 类 为 川 集到的新疆 P. hybrida 样品数较少且与川赤 芍 P. veitchii 的 亲 缘 关 系 较 近 所 以 共 同 划 分 到 P. veitchii 和 新 疆 赤 芍 P. hybrida 因 为 收 第Ⅲ类 分类结果见图 2 图2 和的系统聚类分析 相似度 计 算 特 征 指 纹 图 谱 反 映 的 是 样 品 整 体 的 特 征 可 以 反 映 样 品 之 间 的 亲 疏 程 度 表1 No 和的来源与相似度 样品 来源 相似度 但是单纯 直 观 比 较 图 谱 峰 数 目 的 多 少 和 峰 面 积 1 对照 的 大 小 只 是 定 性 比 较 而 且 又 带 有 个 人 的 主 观 ( 炒) 上海华氏药房 ( 炒) 浙江杭州 湖南长沙 从 67 个 芍 药 样 品 中 分 别 选 取 白 芍 P. lactiflora P. lactiflora 和川 P. veitchii 有代表性的 9 杭 杭 浙江杭州 杭( 炒) 以中国药品生 物 制 品 检 定 所 提 供 的 对 照 药 12 辽宁省公司 材特征指纹谱作为 对 照 图 谱 建 立 赤 芍 和 白 芍 的 1 上海 14 浙江绍兴 河南洛阳 性 相似度可以定量描 述 特 征 指 纹 图 谱 使 用 中药色谱指 纹 图 谱 相 似 度 评 价 系 统 用 相 似 度 计 算 方 法 对 样 品 进 行 比 较 可 以 定 量 的 客 观 的 对芍药样品进行 评 价 首 先 结 合 聚 类 分 析 结 果 特征指纹谱共有模 式 分 别 计 算 赤 芍 与 白 芍 样 品 与共有模式之间的相似度 结果见表 1 16 上海华宇药业 0 97 P. lactiflora 样 品 相 似 度 在 和 17 亳 可划分为 2 类 相似度在 的样 品与对照划分为 1 类; 相似度在 的 4 18 亳 亳( 酒炒) 上海龙华医院 亳( 炒) 上海华宇药业 对照 P. lactiflora 样品相似度在 分类 不明显 川 P. veitchii 样品相似度在 和 也可划分为 2 类 相似度在 内蒙古赤峰 内蒙古赤峰 29 河北安国 度在 的 5 个样品中 芍药苷类化合物约占 0 60% 以上 酚酸类化合物约占 0% ; 50 号样品( 相似 号样品总成分含量偏低 而第 个样品中 第 9 21 号样品总成分含量偏高 的样品与对照划分为 1 类 芍药苷类化合物与 酚酸类化合物在样品中的相对含量各约 50% ; 相似 71

4 续表 1 No 样品 来源 相似度 分 为和公认的有效成分 均有一定的含量 与活性 可作为特征指纹峰 作为现阶段主流商品的 P. lactiflora 和 P. lactiflora 来源于同一植物的同一入药部 28 河北安国 吉林 7 8 河南 9 内蒙古 内蒙古 雷允上 42 川 对照 lactiflora 中芍药苷类化合物约占所测总成分含量的 4 川 辽宁省公司 % 以上 而川 P. veitchii 和新疆 P. hybri- 44 川 沈阳同仁堂 da 中除了含有大量的芍药苷类化合物 还含有较多 45 川 甘肃 的酚酸类化合物 46 川 甘肃 / 辽宁省公司 47 川 沈阳市售 川 亳州 49 川( 根) 川( 根茎) 川 川 川 54 川 55 川 56 川 57 川 川 59 川 宁夏 川 甘肃 61 川 川 四川阿贝里水县 6 川 吉林 新疆 新疆医科大学中医学院 65 新疆 新疆医科大学第二附属医院 新疆 新疆乌鲁木齐市售 新疆 新疆医科大学附属中医院 位 但产地加工方法不同 经去皮 水煮后得到 的 芍药苷含量明显下降 芍药内酯苷的含量明 显上升 对来源于 种植物的相比较 川 P. veitchii 的总成分含量高 其次是 P. lactiflora 最低为新疆 P. hybrida 芍药苷类化合物是主 要成分之一 而其中又以芍药苷含量最高 P. 系统聚类分析可以将芍药划分为 P. lactiflora 和 P. lactiflora P. veitchii P. hybrida 两大 类 说明去皮 水煮这种传统加工方法对赤 功 效的影响可能大于赤 种间差异的影响 使用 中药色谱指纹图谱相似度评价系统 简 便快速 在已建立指纹图谱共有模式的基础上 用相 似度评价待测样品与共有模式指纹图谱之间的相似 程度 可以在一定程度上反映中药质量的优劣 但 在使用相似度评价系统时建立的共有模式是非常重 要的 一般 采 用 均 值 向 量 和 它 们 离 散 程 度 的 向 量 ( 标准差向量) 或中位数向量来表征共有模式 当样 品出现极值( 特大 特小) 时将直接影响相似度结算 结果 如 21 号样品因总成分含量偏高而相似度 较低 因此可能会出现样品符合药典规定的单一组 分的下限要求 却因为出现特大值而不符合相似度 分析的标准 如何将中药指纹图谱质量控制方法与 传统的中药质量控制方法相结合 揭示的内在 质量还有许多需要探讨的问题 参考文献 1 中国药典. 一部 S. 2010: 度为 ) 为川的根茎; 而相似度在 的 4 个样品为新疆 P. hybrida 讨论 本研究建立了评价芍药质量的液相色谱特 征指纹谱分析方法 通过与对照品对照指认了 9 个 主要成分 其中 4 个芍药苷类成分 5 个酚酸类成 72 2 田树革 周晓英. 新疆理化性质与紫外光谱的研究 J. 中医药学刊 ( 4) : 542. 洪楠. SPSS for Windows 统计分析教程 M. 北京: 电子工业 出版社 1999: 陈闽军 程翼宇 林瑞超. 中药色谱指纹图谱相似性计算方 法的研究 J. 中成药 ( 12) : 905.

5 Characteristic chromatographic profile of Paeoniae Radix and its application in quality control of crude and processed drugs of different origins and processing methods WANG Rui1 2 HUANG Shanjun1 YANG Qiwei1 SHI Yanhong1 WANG Zhengtao1 2 * ( 1. School of pharmacy Shanghai University of Traditional Chinese Medicines Shanghai China; 2. Shanghai R D Center for Standardization of Traditional Chinese Medicines Shanghai China;. MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines Institute of Chinese Materia Medica Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Shanghai China) Abstract Objective: To establish a HPLC method of characteristic chromatographic profile for the quality control of Paeoniae Radix. Method: The 67 batches of samples were analyzed on a Polaris C18 -A column with a gradient elution of acetonitrile and phosphate solution ( ph. 0) at a flow rate of 1. 0 ml min 1 and detected at 20 nm. Result: Nine main marker peaks were identified and semi-quantificated. By the similarity evaluation software for chromatographic fingerprint of traditional Chinese medicine ( Version 2004A) and hierarchical clustering analysis 67 batches of Paeoniae Radix were classified. Conclusion: The method can be applied for quality assessment of Paeoniae Radix. Key words Paeoniae Radix; characteristic chromatographic profile; HPLC doi: / cjcmm 责任编辑 马超一 中国中药杂志 征订启事 中国中药杂志 创刊于 1955 年 7 月 是由中国科学技术协会主管 中国药学会主办 中国中医科学院 中药研究所承办的综合性中药学术期刊 全面反映我国中药与天然药物学科领域最新进展与研究动态 是中 医药最高科研学术水平的交流平台之一 主要报道该领域新成果 新技术 新方法与新思路 内容包括栽培 资源与鉴定 炮制 药剂 化学 药理 不良反应 临床等 设有专论 综述 研究论文 研究报告 临床 学术探 讨 药事管理 经验交流 信息等栏目 主要读者对象为各级管理部门 研究院所 大专院校 工厂企业以及医 院等从事中医药科研 管理 生产 医院制剂及临床等方面的人员 本刊现为半月刊 144 页 每期定价 0 元 全年定价 720 元 国内刊号 / R 国际刊号 中国中药杂志 在国际国内医药学领域内具有广泛影响 被美国 Medline 数据库 化学文摘 ( CA) 国际药学文摘 ( IPA) 毒物学文摘 ( ToxFile) 俄罗斯 文摘杂志 ( AJ) 波兰 哥白尼索引 ( IC) WHO 西太平洋地区医学索引 ( WPRIM) 等 16 家权威性专业文摘收录; 国内为 中国科学引文数据库 中国学术 期刊综合评价数据库 来源期刊 中国自然科学核心期刊 中国中文核心期刊 中国科技核心期刊 并被 中 国学术期刊文摘 中 英文版收录 曾荣获第三届国家期刊奖百种重点期刊 历届国家中医药管理局全国优 秀中医药期刊评比一等奖 并获得中国科学技术协会精品科技期刊工程项目 B 类资助 地址: 北 京 市 东 直 门 内 南 小 街 16 号; 邮 编: ; http: / / www. cjcmm. com. cn; com; 联系电话详见本刊网站 7

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