妇科千金片和妇科千金胶囊是收载于中华人民共和国药典 ( 中国药典 )2015 版一部的现代中药复方制剂, 具有清热除湿益气化瘀之功效 ; 用于湿热瘀阻所致的带下病腹痛, 症见带下量多色黄质稠臭秽, 小腹疼痛, 腰骶酸痛, 神疲乏力, 慢性盆腔炎子宫内膜炎慢性宫颈炎见上述证候者组方药味

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骧裘
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1 年月第卷第期中国现代中药ＭＣＭＡＶＮ基础研究ＨＰＬＣ定量分析千斤拔药材中染料木苷和染料木素的含量张鹏彭开锋李伏君龚云刘逆夫付卡利杨秀伟王龙株洲千金药业股份有限公司湖南株洲北京大学药学院天然药物学系天然药物及仿生药物国家重点实验室北京约翰霍普金斯大学美国巴尔的摩摘要目的建立千斤拔药材的质量控制方法方法采用高效液相色谱法测定其中的染料木苷和染料木素的含量色谱柱为ＫｍＣｍｍｍｍ μｍ梯度洗脱流动相为乙腈磷酸水溶液流速为ｍＬｍ检测波长为ｍ结果染料木苷和染料木素分别在质量浓度 μ ｍｌ和 μ ｍｌ与峰面积线性关系良好平均回收率染料木苷为ＲＳＤ为染料木素为ＲＳＤ为不同产地千斤拔药材中染料木苷和染料木素的含量有明显差异结论建立的含量测定方法操作简便分离效果好准确能满足千斤拔药材中染料木苷和染料木素含量的准确测定为千斤拔药材的质量评价以及合理开发利用提供了科学依据关键词千斤拔染料木苷染料木素高效液相色谱质量标准ＱＤｍＧＧＭＭＭＨＰＬＣＺＨＡＮＧＰＰＥＮＧＫＬＩＦＧＯＮＧＹＬＩＵＮＦＵＫＹＡＮＧＸｗＷＡＮＧＬＺＱＰｍＣＬＺＣＤｍＮＭＳＫＬＮＢｍｍＤＳＰｍＳＰＵＢＣＪＨＵＢｍＡｍＡＯＴｍｑＭｍｍＭＡＨＰＬＣｍｑＭｍｍＭｍＷＯＫＭＭＲＬｗＴｍｗＨＰＬＣｗＫｍＣｍｍｍｍｍ μｍｗｑｍｗｗｍｒＧｍｗｍｌｗ μ ｍｌ μ ｍｌＴｗｗＲＳＤｗＲＳＤＴＭｍｍｍｗｍＣＴｍｍｗｗｍＭｍｍｑｗｍＭｍｍＫｗＭｍｍＨＰＬＣｑ基金项目国家中药标准化项目ＹＢＨＣＨＵＮ通信作者杨秀伟教授博士生导师研究方向天然产物化学与药物代谢ＴＥｍｘｗｍ

2 妇科千金片和妇科千金胶囊是收载于中华人民共和国药典 ( 中国药典 )2015 版一部的现代中药复方制剂, 具有清热除湿益气化瘀之功效 ; 用于湿热瘀阻所致的带下病腹痛, 症见带下量多色黄质稠臭秽, 小腹疼痛, 腰骶酸痛, 神疲乏力, 慢性盆腔炎子宫内膜炎慢性宫颈炎见上述证候者组方药味包括千斤拔金樱根穿心莲功劳木单面针当归鸡血藤和党参 [1] 君药千斤拔, 中国药典 2015 版四部收载的基原植物有蔓性千斤拔 Moghaniaphilippinensis(Mer etrolfe)li 大叶千斤拔 M macrophyla(wild )O Kuntze 和锈毛千斤拔 M feruginea(wal exbenth )Li [2] 千斤拔性温, 味甘辛, 民间多用于治疗风湿骨痛慢性肾炎跌打损伤白带多和痛经等 [3 5] 已有研究表明, 千斤拔含有大量的黄酮类化合物 [6 9], 其中的染料木苷 (genistin) 和染料木素 (genistein) 具有显著的抗氧化类激素抗菌抗癌和保护心血管等作用 [10 12] 而有关以千斤拔作为君药的中成药妇科千金片妇科千金胶囊金鸡胶囊等治疗妇科疾病和风湿病的作用基础, 正是该味药中起激素作用和抗炎抗氧化作用的化学成分因此, 本研究选取染料木苷和染料木素 2 个活性成分作为含量测定的指标, 建立测定方法, 为评价该药材质量优劣提供方法学 1 仪器与试药 1 1 仪器 Waterse2695 高效液相色谱仪 [ 沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 ],AB204 S 型十万分之一电子分析天平 ( 德国梅特勒托利多仪器有限公司 ),KQ5200DE 型数控超声波清洗仪 ( 昆山市超声仪器有限公司 ),FZ102 微型植物粉碎机 ( 天津市泰斯特仪器有限公司 ) 1 2 试剂和试药对照品染料木苷 ( 供含量测定用, 批号 : ) 和染料木素 ( 供含量测定用, 批号 : ) 购于中国食品药品检定研究院色谱纯乙腈 ( 美国 Merck 公司 ), 分析纯甲醇和乙酸乙酯 ( 天津市科密欧化学试剂有限公司 ), 分析纯三氯甲烷 ( 天津市富宇精细化工有限公司 ), 分析纯冰醋酸和磷酸 ( 湖南汇虹试剂有限公司 ) 9 批次千斤拔样品信息见表 1, 经株洲千金药业股份有限公司刘逆夫副教授分别鉴定为蔓性千斤拔 Moghaniaphilippinensis(Mer etrolfe)li 和大叶千斤拔 M macrophyla(wild )O Kuntze 的根表 1 千斤拔样品信息批次采样时间 / 年月日基原植物产地批号蔓性千斤拔云南勐仑蔓性千斤拔缅甸蔓性千斤拔广西柳州蔓性千斤拔湖南炎陵大叶千斤拔广东佛山大叶千斤拔广西桂林大叶千斤拔云南西双版纳大叶千斤拔河北邢台大叶千斤拔福建泉州方法与结果 2 1 色谱条件 Kromasil100 5C 18 色谱柱 (250mm 4 6mm, 5μm), 流动相为乙腈 (A) 0 1% 磷酸水溶液 (B), 梯度洗脱程序见表 2, 柱温为 35, 进样量为 10μL; 理论塔板数以染料木苷和染料木素计, 不低于 5000; 分离度以染料木苷和染料木素计算, 大于 1 50 表 2 千斤拔中染料木苷和染料木素含量测定的流动相梯度洗脱程序 t/min 乙腈 0 1% 磷酸水溶液的制备对照品溶液的制备精密称取染料木苷对照品约 17 5mg, 置于 25mL 量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度, 摇匀, 制成 699 3μg ml -1 的染料木苷对照品贮备溶液 ; 精密称取染料木素对照品约 16 5mg, 置 10mL 量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度, 摇匀, 制成 μg ml -1 的染料木素对照品贮备 949

3 溶液分别精密量取对照品贮备液, 染料木苷 20mL 和染料木素 2mL, 置于 25mL 量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 配制成染料木苷质量浓度为 μg ml -1 和染料木素质量浓度为 μg ml -1 的混合对照品溶液将混合对照品溶液精密稀释成染料木苷质量浓度分别为 μg ml -1, 染料木素质量浓度分别为 μg ml -1 的混合对照品溶液供试品溶液的制备称取大叶千斤拔药材粉末 ( 过 40 目筛 )5 00g, 加入 50% 乙醇水溶液 75mL, 称定质量, 于水浴中在 85 回流提取 1h, 取出, 放冷, 再称定质量, 用 50% 乙醇水补足减失的质量, 摇匀, 滤过, 取续滤液用 0 45μm 的微孔滤膜滤过, 即得 2 3 专属性试验分别吸取对照品和供试品溶液, 按 2 1 色谱条件测定, 记录色谱图, 详见图 1 结果表明, 供试品色谱图中, 具有与对照品溶液色谱图中相同保留时间的色谱峰, 供试品中分析物色谱峰与其相邻色谱峰均能达到基线分离, 分离度符合要求注 :A 对照品 ;B 供试品图 1 千斤拔及对照品 HPLC 图 2 4 线性关系考察取项下的混合对照品溶液梯度溶液, 用 μm 的微孔滤膜滤过, 分别注入液相色谱仪, 按 2 1 色谱条件测定, 记录色谱峰面积以各组分质量浓度 (X,μg ml -1 ) 为横坐标, 以峰面积 (Y) 为纵坐标, 绘制标准曲线染料木苷的回归方程为 Y= 53167X (r=0 9997), 染料木素的回归方程为 Y=7259X+48586(r=0 9998), 染料木苷在质量浓度 ~ μg ml -1 与峰面积线性关系良好 ; 染料木素在质量浓度 4 088~65 406μg ml -1 与峰面积线性关系良好 2 5 精密度试验精密吸取对照品溶液, 按 2 1 色谱条件分析, 重复进样 6 次, 记录色谱峰面积结果, 染料木苷和染料木素峰面积的分别为 0 40% 和 1 09% (n=6), 表明本方法精密度良好 2 6 稳定性试验取项下的供试品溶液, 分别在放置 h 时按 2 1 色谱条件进样分析, 记录色谱峰面积结果表明, 染料木苷和染料木素峰面积的分别为 0 76% 和 0 58%(n=6), 表明样品在 24h 内稳定性良好 2 7 重复性试验取大叶千斤拔样品 ( 批号 :141208)6 份, 精密称定, 按方法制备供试品溶液, 按 2 1 色谱条件进样分析, 记录色谱峰面积, 分别测定 6 份样品中染料木苷和染料木素的含量, 计算值结果值分别为 1 08% 和 3 16%(n=6), 表明本方法重复性良好 2 8 中间精密度试验同 2 7 操作, 分别由两名不同的分析人员使用不同的仪器对本品进行含量测定, 计算值结果表明, 染料木苷和染料木素含量测定的值分别为 5 78% 和 3 15%(n=12), 表明本方法中间精密度良好 2 9 加样回收率试验取大叶千斤拔粉末 ( 批号 :141208) 约 2 5g( 共 9 份 ), 精密称定, 分置具塞锥形瓶中, 分别加入对照品溶液量为样品量对应化合物量的 50% ~150%, 设 3 次重复, 按方法制备供试品溶液, 按 2 1 色谱条件进样分析, 计算回收率, 结果见表 3 和样品含量测定取 9 批次千斤拔样品各 5 0g, 精密称定, 分别

4 按方法制备供试品溶液, 并按 2 1 色谱条件进样测定, 记录峰面积, 以峰面积计算样品中各待测物质的含量, 结果见表 5 编号表 3 千斤拔中染料木苷加样回收率试验结果 (n=9) 测得量 / 药材中含对照品加 mg 量 /mg 入量 /mg 回收率平均回收率编号批次表 4 千斤拔中染料木素加样回收率试验结果 (n=9) 测得量 / 药材中含对照品加 mg 量 /mg 入量 /mg 回收率平均回收率表 5 千斤拔样品含量测定结果 (n=3) 基原植物 / 产地染料木苷平均质量分数 / mg g -1 染料木素平均质量分数 / mg g -1 1 蔓性千斤拔 / 云南勐仑蔓性千斤拔 / 缅甸蔓性千斤拔 / 广西柳州蔓性千斤拔 / 湖南炎陵大叶千斤拔 / 广东佛山大叶千斤拔 / 广西桂林大叶千斤拔 / 云南西双版纳大叶千斤拔 / 河北邢台大叶千斤拔 / 福建泉州讨论 3 1 检测波长的选择文献报道 [13], 染料木苷和染料木素在 261nm 波长处有最大吸收, 本文对染料木苷和染料木素进行紫外扫描, 发现染料木苷和染料木素在 260nm 波长处有最大吸收, 故最终将其测定波长定为 260nm 3 2 提取方法选择本方法考察不同质量分数乙醇水及不同质量分数甲醇水作为提取溶剂对染料木苷和染料木素提取率的影响, 结果随着有机溶剂比例从 30% 增加到 50%, 染料木苷和染料木素的提取率增加, 有机溶剂比例从 50% 增加到 95%, 染料木苷和染料木素的提取率下降, 且 50% 乙醇水提取出的染料木苷和染料木素的总量最高, 故选定 50% 乙醇水作为提取溶剂提取时间采用热回流提取 min, 发现随时间的推移含量增加, 但是增加不大, 故选择 50% 乙醇水热回流提取 60min 3 3 流动相选择 [13] 本方法在杨启明等所使用的相关方法上进行优化, 采用乙腈 0 1% 磷酸水溶液作为流动相梯度洗脱, 能使待测组分得到很好分离 3 4 不同产地各成分含量测定结果分析通过对不同产地蔓性千斤拔和大叶千斤拔的含量测定结果分析, 蔓性千斤拔以云南勐仑和湖南炎陵两个地区产的染料木苷和染料木素的含量最高, 大叶千斤拔以福建泉州产的染料木苷和染料木素的含量最高, 提示其可能是最适合千斤拔生长的环境, 结合其他研究可以进一步确定千斤拔属植物产地的道地性本研究所建立的含量测定方法能够用于同时测定千斤拔中染料木苷和染料木素的含量, 方法操作简便精密度高分离效果好, 可为千斤拔药材的质量评价以及合理开发利用提供依据参考文献 [1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 : 一部 [M]. 北京 : 中国医药科技出版社,2015: [2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 : 四部 [M]. 北京 : 中国医药科技出版社,2015:

5 [3] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志 : 第 41 卷 [M]. 北京 : 科学出版社,1995: [4] 国家中医药管理局中华本草编委会. 中华本草 [M]. 上海 : 上海科技出版社,1999: [5] 广西壮族自治区卫生厅. 广西中药材标准 [M]. 南宁 : 广西科学技术出版社,1996: [6] LaiW C,TsuiYT,SingabANB,etal.Phyto SERM con stitutesfrom Flemingiamacrophyla[J].IntJMolSci, 2013,14(8): [7] 李华, 杨美华, 马小军. 千斤拔黄酮类化学成分研究 [J]. 中国中药杂志,2009,34(6): [8] 李昌松, 张丽霞, 赵俊凌, 等. 云南地区大叶千斤拔不同种质的异黄酮含量比较 [J]. 中国现代中药,2011,13 (10): [9] 李帅霖, 孙琳, 富艳彬, 等. 蔓性千斤拔的化学成分研究 [J]. 中国药物化学杂志,2017,27(6): [10] 翁春艳, 杨艳, 李晓波. 染料木素抗动脉粥样硬化的研究进展 [J]. 中国医药指南,2016,14(7): [11] 李朋收, 刘洋洋, 范冰舵, 等. 鹰嘴豆化学成分及药理作用研究进展 [J]. 中国实验方剂学杂志,2014,20(11): [12] 张泉洋, 马富超, 王帅, 等. 染料木苷药理作用的研究进展 [J]. 国际药学研究杂志,2017,44(4): [13] 杨启明, 张春凤, 杨中林.HPLC 测定不同产地蔓性千斤拔中染料木苷和染料木素的含量 [J]. 中国现代应用药学,2012,29(8): ( 收稿日期 ) 檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿 ( 上接第 935 页 ) [32] KoSR,ChoiKJ,SuzukiK,etal.Enzymaticpreparationof ginsenosidesrg 2,Rh 1,andF 1 [J].ChemPharmBul,2003, 51(4): [33]DouDQ,ChenYJ,LiangLH.etal.Sixnewdammarane type triterpenesaponinsfromtheleavesofpanaxginseng[j].chem PharmBul,2001,49(4): [34] NambaT,MatsushigeK,MoritaT,etal.Saponinsofplants ofpanaxspeciescolectedincentralnepalandtheirchemo taxonomicalsignificance.i[j].chem Pharm Bul,1986,34 (2): [35] TranQL,AdnyanaIK,TezukaY,etal.Triterpenesaponins from Vietnameseginseng(Panaxvietnamensis) andtheir hepatocytoprotectiveactivity[j].jnatprod,2001,64(4): [36] TakemotoT,AriharaS,NakajimaT,etal.Studiesonthe constituentsoffructusmomordicae. I.Structureofmogro sides[j].yakugakuzashi,1983,103(11): [37] TakemotoT,AriharaS,NakajimaT,etal.Studiesonthe constituentsofgynostemmapentaphylum Makino.I.Struc tureofgypenosidei XIV[J].YakugakuZashi,1983,103 (2): [38]ChenJ,ZhaoR,ZengYM,etal.Threenewtriterpenoidsap oninsfromtheleavesandstemsofpanaxquinquefolium[j].j AsianNatProdRes,2009,11(3): ( 收稿日期 ) 952

第 2 期李珊珊, 等 : 扶骨黄酮分散片中葛根素大豆苷和淫羊藿苷的含量测定 5 isofsimplicity,accuracy,goodreproducibilityandstability,soitcanbeappliedtoqualitycontroloffuguhuangtong Dis

第 2 期李珊珊, 等 : 扶骨黄酮分散片中葛根素大豆苷和淫羊藿苷的含量测定 5 isofsimplicity,accuracy,goodreproducibilityandstability,soitcanbeappliedtoqualitycontroloffuguhuangtong Dis 山东科学 SHANDONGSCIENCE 第 29 卷第 2 期 2016 年 4 月出版 Vol.29No.2Apr.2016 DOI:10.3976/j.isn.1002-4026.2016.02.002 中药与天然活性产物扶骨黄酮分散片中葛根素大豆苷和淫羊藿苷的含量测定李珊珊 1, 牟癑静 1, 刘逢芹 2 3, 郑世存 (1. 山东中医药大学药学院, 山东济南 250355;2. 山东省千佛山医院,